包涵体蛋白质复性液

包涵体蛋白质复性液

Inclusion Body Protein Solubilization & Refolding 

使用IPTG诱导表达目的蛋白a。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。因此通过变复性的方式，重溶目标蛋白a，通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。
包涵体蛋白的变复性
1. 将菌体沉淀重悬于20 ml 裂解液 （20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0），超声破碎（功率400 W，工作4sec，间歇8sec，共20min）；
2. 将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 g离心20 min，收集沉淀；
3. 使用包涵体洗涤液（20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0）洗涤包涵体3次；
4. 用溶解缓冲液（20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0），按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000 rpm离心15min；
5. 将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ，100 mM NaCl ，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。
包涵体融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析
包涵体蛋白Ni柱纯化
1. 利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱；
2. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
3. 用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
4. 用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
5.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH8.0进行透析过夜；
6. 进行12% SDS-PAGE分析, 结果如Fig.2所示。
纯化结果分析
包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12% SDS-PAGE分析。

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