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包涵体大量纯化试剂盒
Inclusion Body Maxiprep Kit
产品是包涵体微量纯化试剂盒的大提升级产品,用于大量,快速的提取高质量的包涵体。
产品特点:
1.大量提取,1次可处理多达5升的菌液,相当于50次中量提取。
2.适合制备级别的包涵体纯化,需在50mL以上的离心管或离心瓶中完成。
3. 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份,使重组蛋白在包涵体中所占比重达到60%以上。
4. 即可以选择高压裂解法,也可以采用酶学裂解法裂解细菌。
5. 得到的包涵体可以用于重折叠,也可以用于凝胶层析和动物免疫。
试剂盒组成:
成分 | 规格 |
溶液A | 100mL |
溶液B | 250mL×2 |
包涵体溶解液 | 100ml |
溶菌酶 | 100mg |
说明书 | 1份 |
储存条件:常温运输,4℃保存(溶菌酶需要-20℃保存,包涵体溶解液可以室温保存),有效期一年。
自备试剂:如果得到的重组蛋白确有降解则需要自备蛋白酶抑制剂混合物(BTN80808)。
使用方法:
一.细胞沉淀:
1.转移1-5升菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大,可以分多次反复离心收集。
2.5000g(相当于Sorvall GSA转头5500rpm)4℃离心15-30分钟,小心弃上清。
3.复称重量,差值就是细菌的湿重。1升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为3克,所以1-5升菌液一般能得到3-15克细菌。注意:后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。
4.细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。
二.细胞裂解(下面两法中选其一):
?高压破碎法(French Press)+超声法(推荐方法)
1.按每克细菌湿重加入3mL溶液A重悬细胞,可以用玻璃棒搅拌或用Waring捣碎机匀浆(如果细菌湿重超过10克)使细菌悬浮,直到检测不到成块的细胞为止。如有必要,可以加入溶菌酶干粉,使其终浓度为0.2mg/mL。
2.让细胞通过压力为16000-18000 lb/in2的高压细胞破碎仪,收集的细胞裂解液需放冰上。
3.重复上步操作一次或多次,直到绝大部分细菌都被裂解。注意:每次处理后最好在显微镜下检查细菌裂解的比例。
4.将细胞裂解液置于冰浴中,用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟,工作状态为50%(开0.5秒,关0.5秒)。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌,否则产生的热量会使包涵体蛋白变性,在纯化中丢失。
?酶法+超声法(在没有高压破碎仪器时首选方法)
1.按每克细菌湿重加入3mL的含溶菌酶的溶液A重悬细胞,可以用玻璃棒搅拌细菌沉淀使之悬浮。
2.在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉,使其终浓度为0.2mg/mL,搅拌混匀后37℃放置30分钟裂解细菌,其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的DNA将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠,说明裂解不充分,需要继续裂解,否则完整细菌将和包涵体一起沉淀,影响包涵体的纯度。由于处理量大,最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
3.将细胞裂解液置于冰浴中,用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟,工作状态为50%(开0.5秒,关0.5秒)。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌,否则产生的热量会使包涵体蛋白变性,在纯化中丢失。
三.包涵体纯化:
1.将超声处理的细胞裂解液转移到离心瓶中,22000g 4℃下高速离心60分钟(注意:转子不同其对应的离心速度不同),小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白,可以保留作为SDS-PAGE对照样品。
2. 将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在预冷的溶液B中。每克细菌需要5mL溶液B,1升细菌的湿重约3克,大约需要15mL溶液B,用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置5分钟。
3.22000g 4℃下高速离心30分钟,沉淀将出现三层,最下面的是未彻底破裂的细胞碎片,其上是包涵体,最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理过程中使用过溶菌酶,则此层较薄。小心收集上清,可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。
4.重复第8-第9步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失,此过程一般需要重复洗涤2次(共3次洗涤),小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的溶液B足够一次5升规模的提取洗3次,如需更多溶液B请单独购买。
5.上步得到的沉淀即为包涵体,其中重组蛋白一般占60%重量,其余40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用,也可以直接用于免疫动物制备抗体,还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。
6.估计重组蛋白的产率:首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水品,如果表达水平为1%,则1克湿重的细菌中将含有1mg重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在75%,即1mg重组蛋白质能得到0.75mg,丢失0.25mg。
四.包涵体的溶解:
1.在室温下,将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中,用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化,则按每克原始细胞湿重加入1mL包涵体溶解液,重组蛋白的浓度约为4-5mg/mL;如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠,则按每克原始细胞湿重加入3mL包涵体溶解液,重组蛋白的浓度约为1-2mg/mL;注意:包涵体溶解液低温放置会产生沉淀,必须45-65℃溶化并混匀后才能使用。
2.室温放置1小时使蛋白质充分溶解。
3.100,000g 4℃离心60分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算),小心收集上清,保留不溶性沉淀。注意:检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有,说明包涵体没有完全溶解,需要用适当增加包涵体溶解液的用量。
4.将上清(溶解的包涵体)分成10-20mL一份,放于塑料离心管中(不要超过离心管容量的70%)置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件,需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶,在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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