农杆菌EHA105化学感受态细胞

农杆菌EHA105化学感受态细胞

E.coli EHA105 Chemical Competent Cell

本产品为EHA105农杆菌化学感受态细胞，为C58型背景，核基因中含有筛选标签-利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA 插入植物基因组必需的元件，pEHA105(pTiBo542DTDNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。本产品适用于水稻、烟草等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达103cfu/μg。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期一年。

自备试剂：质粒DNA、液氮等

使用方法：

转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2. 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100μL感受态细胞加1ug(体积不大于10μl)质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置5分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻5分钟(注：也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4. 迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5. 加入800μl 无抗生素的2×YT或LB液体培养基，28-30℃振荡培养2～3小时。使菌体复苏，表达抗性。
6. 5000rpm离心1分钟收菌，保留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72小时。
?注：当平板只含有50μg/mL kan时，28℃培养48 h 即可；平板中同时加入50μg/mL kan、20μg/mL rif时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50μg/mL rif 则需要28℃培养72-90h。

注意事项：
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25μg/mL，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50μg/mL kan，若所用平板含有20μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！