免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒

免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒

FFPE direct RT-PCR Kit (RNA extraction-free)

本试剂盒免核酸提取，直接用切片裂解液做RT-PCR模板。本试剂盒足够处理30次样品处理和50次的RT-PCR反应。

试剂盒特点：

• 反转录可灵活选用随机引物、Oligo dT引物或专一引物，适合各种情况。
  

• PCR mix含有上样染料，所以PCR产物可直接上样电泳。
  

• 两管式操作，RT和PCR分步进行，便于单独优化RT反应和PCR反应的条件。
  

• 扩增效率高，最高可扩增1kb以上的RNA。

试剂盒组成：

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、样品RNA的释放

1. 如果有N个样品，可设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用水作为制备的阴性对照，提取结束后最后得到模板DNA放冰上待用。
   

2. 将5片厚度为6-8μm的石蜡包埋组织切片转移到1.5mL塑料离心管(最好使用螺旋盖离心管)中并加入1mL溶液A，在振荡器上以最大速度振荡10秒，然后离心。
   

3. 取出上一步的上清液0.6mL，加入0.6mL的溶液B，震荡5-10秒。
   

4. 室温放置10分钟。
   

5. 混合液可以直接用做PCR、RT-PCR、LAMP和RT-LAMP扩增的模板。未用完的部分模板可以放-80℃长期保存。

二、RT反应合成cDNA

6. 按下表配制RT反应体系（20μL体系）:
   

   成分		用量
   RNA模板	总RNA	100～500ng
   	或poly(A) mRNA	10～500ng
   	或专一的RNA（如体外转录制备的）	0.01pg～500ng
   引物	Oligo (dT)18(0.5μg/μL)	1μL
   	或随机引物(0.2μg/μL)	1μL
   	或自备模板专一反向引物(10pmol/μL)	1～2μL
   RNase-free水		至12μL

   
   注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。随机引物与RNA模板的比例将决定cDNA合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于OligodT引物，但如果只想转录总RNA中的mRNA（只占5%左右），则可优先选用OligodT引物，这样就可以排除非mRNA的干扰。
   

7. 70℃保温5分钟变性模板后立即冰浴。
   

8. 按顺序加入6μL RT Buffer（含dNTP）和2μL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
   

9. 42℃保温60分钟。此步为RT反应。
   

10. 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。
    

11. 合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。

三、PCR反应（30μL体系）

12. 将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在PCR结束
    后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速
    度。
    

13. 在PCR管中加入下列成分：
    

    成分	用量
    PCR MagicMix 3.0	15μL
    cDNA样品（上步的RT反应液）	1～5μL
    模板专一性正向引物(10pmol/μL)	1～2μL
    模板专一性反向引物(10pmol/μL)	1～2μL
    RNase-free水	至30μL

    
    注意：cDNA也可以稀释后用作PCR模板。是否稀释或稀释多少倍完全取决于靶基因的丰度。
    

14. PCR反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5min
    PCR反应（35个循环）	95℃	30sec
    	55℃	30sec
    	72℃	20sec
    最后延伸	72℃	7min

四、电泳检测

15. 取5～10μL PCR产物直接在PAGE或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的PCR mix含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！