T7体外转录试剂盒

T7体外转录试剂盒

T7 in vitro Transcription Kit

本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T7启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

试剂盒特点：

• 即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验不需要单独准备每一个成份。
  

• 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
  

• 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
  

• 可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
  

• 产品配方经过精心优化，每1μg DNA模版可以合成2～6μg RNA。
  

• 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰（RNAi）等实验。
  

• 本试剂盒足够50次20μL体系的体外转录实验并且只能用于科研。

试剂盒组成：

保存：-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：
Tris饱和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。

使用方法：

一、制备DNA模板（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考）
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。

• 必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
  

• 需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列5′ TAA TAC GAC TC A CTA TAG GG 3′加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
  

• 需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3′突出。如果是3′突出（比如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。
  

• 必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。如果有RNase污染，则必须反复酚氯仿抽提去除残留的RNase然后再乙醇沉淀质粒DNA。
  

二、体外转录反应

1. 如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照故共设置N+1个反应这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA哪个条带是扩增得到的RNA。在N+1个RNase-free的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分T7转录预配液容易产生结晶沉淀一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用）
   

   成分	N个样品管	阴性对照管
   DNA模板	50ng左右的PCR片段 或1μg左右的线状质粒	-
   T7转录预配液，2×	各10μL	10μL
   T7 RNA聚合酶RI混合液	各1μL	1μL
   RNase-free水	至20μL	至20μL

   
   注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本产品的T7转录预配液已经含有NTP。如果需要标记RNA探针或制备带帽RNA，则需要订购NTP分开的试剂盒。
   

2. 37℃保温12小时。
   注意：延长保温时间并不能大幅提高产量。
   

3. 加入2μL自备的500mM的EDTA溶液灭活T7 RNA聚合酶。
   

4. 取13μL电泳此时最好用DNA模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是扩增得到的RNA由于合成的RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得RNA条带一般都不是清晰而是比较弥散的电泳条带。但由于RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此RNA一般比其双链DNA模板电泳速度更快。
   

5. 定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度。不推荐使用电泳定量。使用本试剂盒时1μg的DNA模板一般可以合成2～6μg的RNA。
   

6. 得到的RNA可以放80℃保存。如需去除DNA模板，请按下面步骤操作。

三、去除DNA模板（所需试剂需要另购）

7. 在20μL体积的体外转录体系中加入2μL的10×DNase Buffer和1μL自备的RNase-free DNase 3～5U/μL。
   

8. 37℃保温30分钟。
   

9. 补RNase-free水到100μL。增加体积可以减少样品的丢失。
   

10. 用自备的等体积100μL的Tris饱和酚氯仿震荡混匀后14000g离心3分钟将上清转移到新的离心管中。此步去除DNase和RNA聚合酶。
    

11. 加自备的200μL无水乙醇和10μL 3M的乙酸钠溶液（pH5.2），振荡后14000rpm离心20分钟，RNA形成沉淀，弃上清。
    

12. 在沉淀中加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后14000g离心5分钟，弃上清。
    

13. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。不要丢失沉淀。
    

14. 晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。

疑难解答：

• 没有RNA产物。
  最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳，再检测其是否有污染。
  

• RNA产量低。
  最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
  

• RNA长度比预期的短。
  可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒（启动子也必须改成SP6启动子
  

• RNA长度比预计的长。
  T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。
  

• 5′单磷酸还是三磷酸?
  如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。
  

• 用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA?
  需加入带帽NTP类似物即可。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！