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DNA5’末端标记试剂盒
DNA 5’ End-Labeling Kit
产品及特点 本产品为 DNA 5’末端标记系统,利用 T4 Polynucleotide Kinase(T4
多聚核苷酸激酶)和[γ-32P]ATP 对粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’
末端进行高效标记反应。
本产品具有下列特点:
1. 使用本试剂盒之前,不需要对 5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理,因为使用的 kinase 能使 5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP 的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的 5’末端游离的 OH 基团都能通过 Kinase 反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行,均能得到大于106 cpm/pmol(5’-end)的比活性。
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 DNA 片段、[γ-32P]ATP 或其它的标记、未标记的 ATPs、牛小肠碱性磷酸
酶(CIAP)等
使用方法 一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂:7 M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
2. 在微量离心管中制备下列反应液:
3. 37℃反应 30 分钟。
4. 70℃加热 5~10 分钟使酶失活。
5. 加入 10 μL 的 7 M CH3COONH4(pH 4.5)。如使用 CH3COONa 做乙醇沉淀时使其终浓度达 300 mM。
6. 加入 87.5 μL(2.5 倍)的冷无水乙醇,-20℃放置 30~60 分钟。
7. 离心回收沉淀,用 70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注:通过第 5~8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP,如要完全将其除去时,乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白质时,请在第 8 步之后进行。
二、磷酸化反应标记
A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂:TE 饱和酚/氯仿、3 M NaCl 、100%乙醇、70%
乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
2. 在微量离心管中制备下列反应液:
成分 加入的体积
自备的 DNA 片段 133 μL(≤10 μg)
1 M Tris-HCl,pH 8.0 15 μL
牛小肠碱性磷酸酶
(CIAP,10~20 U/μL)
2 μL
灭菌的超纯水 补足到 150 μL
3. 50℃反应 30 分钟。
4. 加入 150 μL 的 TE 饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分混匀。
5. 离心,取上层(水层)移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4~5。
7. 加入 7.5 μL 的 3 M NaCl(最终浓度 150 mM)。
8. 加入 375 μL(2.5 倍量)的冷无水乙醇,-20℃放置 30~60 分钟。
9. 离心回收沉淀,用 1 mL 70%的冷乙醇清洗后,沉淀真空干燥。
10. 使用 20 μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。
B. 磷酸化反应(前反应)
1. 在微量离心管中制备下列反应液:
成分 加入的体积
自备的 DNA 片段 20.5 μL(≤5 pmoles 的 5′末端)
10×磷酸缓冲液 2.5 μL
[γ -32P] ATP 1 μL
T4 多聚核苷酸激酶(10 U/μL) 1 μL
灭菌的超纯水 补足到 25 μL
2. 37℃反应 30 分钟。
3. 下面的操作与交换反应的第 4-8 步操作相同。
三、合成 DNA 寡核苷酸的标记
1. 在微量离心管中制备下列反应液:
成分 加入的体积
Oligonucleotide DNA with free
5’-OH(5~10 pmoles)
≤3 μL
10×磷酸缓冲液 2.5 μL
[γ -32P] ATP 1 μL
T4 多聚核苷酸激酶(10 U/μL) 1 μL
灭菌的超纯水 补足到 25 μL
2. 37℃反应 30 分钟。
3. 下面的操作与交换反应的第 4-8 步操作相同。
四、合成 DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候,需要使用本步骤,即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱(需另购)对于去除未掺入的 dNTPs 效果很好,它还能大幅减少小于 20 个碱基的 DNA 寡核苷酸和小于20 bp 的双链 DNA 的量。使用之前需要在 70℃加热 5~10 分钟以使 T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于 10 个碱基的寡核苷酸。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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