柱式DNA胶回收试剂盒（又名柱式DNAback）

柱式DNA胶回收试剂盒（又名柱式DNAback）

PAGE DNABACK 

本试剂盒适用于从TAE和TBE琼脂糖凝胶中回收100bp～10kb的DNA片段，回收效率在80%以上。本试剂盒采用特殊的吸附膜和结合液BB2，能够有选择性地吸附核酸分子，去除体系中的蛋白、小分子、盐分等其他杂质，通过洗脱液EB将DNA从吸附柱中释放，得到高质量的DNA回收产物。本试剂盒采用的膜结合液中不含有干扰酶活性的碘化钠，所得到的DNA可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学实验。

试剂盒特点：

• 适用范围广，回收效率高。
  

• 操作简单快速，整个回收过程仅需15分钟左右。
  

• 洗脱效率高，洗脱体积最小可低至15μL。

试剂盒组成：

保存：室温干燥保存。
注意：结合液BB2中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口品。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

快速操作流程：

• 准备工作。
  □ 检查洗涤液WB中是否已经加入无水乙醇。
  □ 检查结合液BB2是否出现沉淀。
  □ 将水浴锅调至50℃。
  

• 从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重。
  

• 加入胶块重量3～6倍的结合液BB2，50℃水浴5～10分钟溶胶。
  

• (选做）对于＜500 bp的片段，加入1/3结合液BB2体积的异丙醇。
  

• 将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30秒，倒掉收集管中液体。
  

• 加入500μL洗涤液WB，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体。
  

• 重复步骤6一次。
  

• 空吸附柱于9000g离心1分钟。
  

• 将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15～40μL洗脱液EB，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。

标准回收步骤：
自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力＞12000g)、1.5ml离心管、无水乙醇、异丙醇等。
按瓶身标签说明在洗涤液WB中加入相应虽的无水乙醇（乙醇终浓度为80%)，混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。
结合液BB2在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。捉前将水浴锅调至50℃备用。

• 通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重。
  · 尽可能多地去掉不含目标DNA的琼脂糖。
  · 每管琼脂糖凝胶块不要超过400mg，否则导致溶胶不完全。
  · 切胶过程尽可能快，减少DNA在紫外线中的暴露时间以降低对DNA的损伤。
  

• 根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖（如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300～600μL的比例加入结合液BB2。
  · 凝胶浓度≤1%，每100mg凝胶加入300μL结合液BB2；
  · 1%＜凝胶浓度≤1.5%，每100mg凝胶加入400μL结合液BB2；
  · 1.5%＜凝胶浓度≤2%，每100mg凝胶加入500μL结合液BB2；
  · 凝胶浓度＞2%，每100mg凝胶加入600μL结合液BB2。
  

• 将离心管置于50℃水浴5～10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。
  · 胶块完全溶化即可，过长时间的处理可能导致DNA损伤。
  

• 当目的片段＜500bp时，加入所使用的结合液BB2体积1/3的异丙醇，混匀。当目的片段≥500 bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤5。
  

• 将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同—个收集管中。
  · 如果溶胶液总体积＞750μL，则每次使用750μL，多次上柱。
  

• 向吸附柱中加入300μL结合液BB2，9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同—个收集管中。
  

• 向吸附柱中加入500μL洗涤液WB，9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同—个收集管中。
  · Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确星的无水乙醇。
  

• 重复步骤7一次。
  

• 将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。
  · 此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
  

• 在吸附膜中央加入15～40μL洗脱液EB，室温静置1～2min，9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
  · 洗脱液EB为2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用TE或水(pH＞7.0)代替。
  · 将洗脱液EB预热至60℃可以进一步提高得率。
  · 请勿使用小于15μL的洗脱液进行洗脱。

常见问题解答：

• DNA回收效率较低或者未回收到目的片段
  
  

• 胶块溶解不完全：可适当延长水浴的时间，并增加颠倒混匀的频率辅助溶解。
  

• 胶块体积太大：溶胶困难。可先将胶块切碎，溶胶后分多次上柱离心，回收DNA片段。
  

• 漂洗液中未加入正确量的无水乙醇
  

• Agarose抑制DNA与吸附材料的结合：应尽量切除不含目的DNA片段的Agarose胶。
  

• 提高结合液BB2的相对浓度，增加DNA与吸附膜的作用时间（静置时间），在一定程度上可以提高回收率。
  

• 如果纯化的片段长度大于4kb或者目的片段含量较少，可以将洗脱液再次加入至吸附柱中进行洗脱，以提高回收效率。
  

• 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大的洗脱效率。
  

• 洗脱液不合适：洗脱缓冲液的pH值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其pH值＞7.0,pH值过低可能导致低洗脱效率。
  

• 洗脱时间过短：洗脱时放置1分钟可达到较好的洗脱效果。洗脱时将洗脱液预热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

• 回收DNA进行后续酶切反应效率低
  
  

• 洗脱产物中含有残留的乙醇：可将离心后的吸附柱开盖室温干燥2～5分钟，有助于残留的乙醇挥发完全。
  

• 盐份的残留：请确保使用洗涤液WB洗涤两次，每次500μL沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。
  

• 琼脂糖质量差：请选用高质量的琼脂糖。

• 琼脂糖凝胶胶块不溶
  
  

• 琼脂糖质量差：请选用高质量的琼脂糖。
  

• 含目的片段的胶块在空气中放置时间过长，使胶块失水、干燥。建议切胶后立即进行胶回收，或将胶块保存在4℃或-20℃备用。
  

• 配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。应重新配制缓冲液。

• 洗脱液的选择
  

• 洗脱液可以根据后续实验的需要来确定：—般懦况下，若需要进行测序反应，请用双蒸水洗脱。如果需要长期保存DNA，请用TE洗脱。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！