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柱式DNA PAGE胶回收试剂盒
PAGE DNABACK
本试剂盒适用于从TAE和TBE琼脂糖凝胶中回收100bp~10kb的DNA片段,回收效率在80%以上。本试剂盒采用特殊的吸附膜和结合液BB2,能够有选择性地吸附核酸分子,去除体系中的蛋白、小分子、盐分等其他杂质,通过洗脱液EB将DNA从吸附柱中释放,得到高质量的DNA回收产物。本试剂盒采用的膜结合液中不含有干扰酶活性的碘化钠,所得到的DNA可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学实验。
试剂盒特点:
适用范围广,回收效率高。
操作简单快速,整个回收过程仅需15分钟左右。
洗脱效率高,洗脱体积最小可低至15μL。
试剂盒组成:
组分 | 50次 | 100次 |
结合液BB2 | 50mL | 100mL |
洗涤液WB | 12mL | 24mL |
洗脱液EB | 5mL | 10mL |
吸附柱及收集管 | 50套 | 100套 |
保存:室温干燥保存。
注意:结合液BB2中含有刺激性的化合物,操作过程中应穿上实验服,戴好乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,防止吸入口品。沾染皮肤或眼睛后,请立即用清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医生的帮助。
快速操作流程:
准备工作。
□ 检查洗涤液WB中是否已经加入无水乙醇。
□ 检查结合液BB2是否出现沉淀。
□ 将水浴锅调至50℃。
从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块,称重。
加入胶块重量3~6倍的结合液BB2,50℃水浴5~10分钟溶胶。
(选做)对于<500 bp的片段,加入1/3结合液BB2体积的异丙醇。
将溶胶液移入吸附柱中,8000g离心30秒,倒掉收集管中液体。
加入500μL洗涤液WB,9000g离心30秒,倒掉收集管中液体。
重复步骤6一次。
空吸附柱于9000g离心1分钟。
将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中,在吸附膜中央加入15~40μL洗脱液EB,室温静置1分钟后,离心1分钟。保存管中DNA溶液。
标准回收步骤:
自备材料:水浴锅、小型高速离心机(最大离心力>12000g)、1.5ml离心管、无水乙醇、异丙醇等。
按瓶身标签说明在洗涤液WB中加入相应虽的无水乙醇(乙醇终浓度为80%),混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。
结合液BB2在低温下可能产生沉淀,使用前请检查,如有沉淀,请于37℃溶解沉淀,待冷却至室温后使用。捉前将水浴锅调至50℃备用。
通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开,用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下,放入1.5mL离心管中,称重。
· 尽可能多地去掉不含目标DNA的琼脂糖。
· 每管琼脂糖凝胶块不要超过400mg,否则导致溶胶不完全。
· 切胶过程尽可能快,减少DNA在紫外线中的暴露时间以降低对DNA的损伤。
根据胶块的重量和浓度,按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300~600μL的比例加入结合液BB2。
· 凝胶浓度≤1%,每100mg凝胶加入300μL结合液BB2;
· 1%<凝胶浓度≤1.5%,每100mg凝胶加入400μL结合液BB2;
· 1.5%<凝胶浓度≤2%,每100mg凝胶加入500μL结合液BB2;
· 凝胶浓度>2%,每100mg凝胶加入600μL结合液BB2。
将离心管置于50℃水浴5~10min,间或混匀,直至胶块完全溶化。
· 胶块完全溶化即可,过长时间的处理可能导致DNA损伤。
当目的片段<500bp时,加入所使用的结合液BB2体积1/3的异丙醇,混匀。当目的片段≥500 bp时,此步骤可以省略,直接进行步骤5。
将溶化好的溶液全部移入吸附柱,8000g离心30sec。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同—个收集管中。
· 如果溶胶液总体积>750μL,则每次使用750μL,多次上柱。
向吸附柱中加入300μL结合液BB2,9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同—个收集管中。
向吸附柱中加入500μL洗涤液WB,9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同—个收集管中。
· Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确星的无水乙醇。
重复步骤7一次。
将空吸附柱和收集管放入离心机,9000g离心1min。
· 此步绝不可省略,否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
在吸附膜中央加入15~40μL洗脱液EB,室温静置1~2min,9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
· 洗脱液EB为2.5mM Tris-HCl,pH8.5,可以用TE或水(pH>7.0)代替。
· 将洗脱液EB预热至60℃可以进一步提高得率。
· 请勿使用小于15μL的洗脱液进行洗脱。
常见问题解答:
DNA回收效率较低或者未回收到目的片段
胶块溶解不完全:可适当延长水浴的时间,并增加颠倒混匀的频率辅助溶解。
胶块体积太大:溶胶困难。可先将胶块切碎,溶胶后分多次上柱离心,回收DNA片段。
漂洗液中未加入正确量的无水乙醇
Agarose抑制DNA与吸附材料的结合:应尽量切除不含目的DNA片段的Agarose胶。
提高结合液BB2的相对浓度,增加DNA与吸附膜的作用时间(静置时间),在一定程度上可以提高回收率。
如果纯化的片段长度大于4kb或者目的片段含量较少,可以将洗脱液再次加入至吸附柱中进行洗脱,以提高回收效率。
洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜的中心部位,以完全覆盖硅胶膜的表面,达到最大的洗脱效率。
洗脱液不合适:洗脱缓冲液的pH值对洗脱效率有影响,如果使用水进行洗脱,请确保其pH值>7.0,pH值过低可能导致低洗脱效率。
洗脱时间过短:洗脱时放置1分钟可达到较好的洗脱效果。洗脱时将洗脱液预热至60℃后使用,有利于提高洗脱效率。
回收DNA进行后续酶切反应效率低
琼脂糖凝胶胶块不溶
洗脱液的选择
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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