NRTN试剂盒;人神经秩蛋白检测试剂盒(ELISA方法)
ELISA实验样品制备指南:
在收集样品前需要建立完整的计划,必须清楚要检测的成分是否足够稳定。新鲜样品需尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时低温储存,如需周期性收集样品,需在造模取材后,将标本及时分装后-20℃或-80℃保存。因冰箱与室温存在较大温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以应避免反复冻融。
样品制备方法——液体样品:
液体类实验样品包含血清、血浆、尿液、胸腹水、细胞培养上清等。
细胞培养上清:将细胞培养基转移到离心管中,在4℃条件下以1500rpm离心10分钟。立即等分上清液并于-80℃下保存样品。尽可能减少样品冻融。
血清:室温血清自然凝固10-20分钟后,在4℃下以3000rpm离心10分钟。立即等分上清液并于-80℃下保存样品。保存过程中如产生沉淀,应再次离心。避免反复冻融样品。
血浆:收集全血于含抗凝血剂的管中,根据标本的要求选择EDTA,柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,在4℃条件下以3000rpm离心10分钟。立即等分上清液(血浆)并于-80℃下保存样品。避免反复冻融样品。
尿液:用无菌管收集,并在4℃下以10000g离心2分钟。立即等分上清液并于-80℃保存样品。避免反复冻融样品。
唾液:用无菌管收集,并在4℃下以10000g离心2分钟。立即等分上清液并于-80℃保存样品。避免反复冻融样品。
样品制备方法——组织样品:
采集组织(冰上操作,并尽可能快速完成,以防止被蛋白酶降解)样品后,称组织净重,用液氮迅速冷冻保存备用。将样品保存在-80℃下以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。加入一定量的组织提取缓冲液,用手工或匀浆器将样品充分匀浆。在4℃下以13000rpm离心20分钟。置于冰上,将上清液(可溶的蛋白质提取物)等分至新的冷却管中并在-80℃下保存样品。避免反复冻融样品。
酶标板整体背景高:
1)结合反应太强或时间过长:检查底物的稀释,使用建议的稀释度。当酶标板显色足够进行吸光度读取时立即用终止液终止反应。
2)底物溶液或终止液不是新配制:使用新配制的底物溶液。终止液应该是清亮的(如果它变黄,这是被污染的标志,需要重新配制)。
3)没有终止反应:如果底物反应没有被终止,颜色会继续变化。
酶标板在酶标仪读板前放置时间过长:颜色会继续变化(尽管加了终止液,依然会以很慢的速度变化)。
4)底物孵育过程没有避光:底物孵育应该在避光条件下进行。
5)抗体非特异性结合:确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。我们建议使用5-10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清。确保板孔经过预处理以防止非特异结合。使用亲和力强、纯度高的抗体,最快经过了预吸收。
吸光度数值底:
使用的样品中没有显示出靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低:检查靶蛋白表达系统,确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低,需要增加样品使用量,或者您可能需要选择一个更灵敏的测定方法。确保您使用的是没有超出测定方法检测范围的阳性对照。
抗体不足:确定使用的是建议的抗体量,为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度。
底物溶液不是新鲜配制:使用前新鲜配制底物溶液。
孵育时间不够长:如果建议了孵育时间,确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想,孵育时间可能需要增加。
吸光度数值高:
样品和/或阳性对照吸光度数值高。吸光度没有按样品在板子上的稀释度递减:样品或阳性对照的浓度过高,超出了试验方法检测的范围。重新设置试验方法或者在加样前通过稀释降低样品和对照的浓度,在处理结果计算浓度时考虑到所作的稀释。
酶标板上吸光度不规律:
吸液不一致:确保移液器使用正确并经过校准、确保枪头插得足够紧密。板子稀释时要特别仔细,注意确保每个枪头都吸上和排出正确量的液体,这对平行样品结果的一致性有很大影响。
抗体稀释液/试剂未混匀:为保证板子所有孔的浓度一致,确保所有的试剂和样品在加到板子上以前都被混合均匀。
板孔变干涸:确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘(保持清洁,无菌水)在孵育箱的底部。
洗板不充分:这将导致一些孔没有其他孔清洗的好,残留不同量的未结合的抗体,使后面的结果产生不一致。
酶标板底部不净影响吸光度读取:读板前小心清洁酶标板底部。
阴性对照出现阳性结果:
夹心ELISA - 检测抗体与包被抗体反应:确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,他们之间不会互相反应。
酶标板洗板不彻底:用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤,洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净。
抗体量过多导致非特异结合:根据推荐的用量使用合适浓度的抗体。
试剂/样品污染:试剂和样品可能被污染,或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂,小心操作移液器。
![图片12.png 图片12.png](https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/f5152a2d-3361-467b-9f58-dc6fdc6300df.jpg)
需自备的设备及试剂
450±10nm滤光片的酶标仪(建议仪器使用前提前预热)
单道或多道微量加液器及吸头
稀释样品的EP管
蒸馏水或去离子水
吸水纸
盛放洗液的容器
试剂盒的储存及有效期
未开封的试剂盒:所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意,收到试剂盒后请尽快将TMB 洗涤液,终止液保存于4℃,其他试剂保存于-20℃。
使用后的试剂盒:剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存,开封后的酶标板要加干燥剂后密封保存于-20℃,避免潮湿。
稳定性
经测定,试剂盒在有效期内按推荐温度保存,其活性降低率小于5%。
为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响,实验室的环境条件需尽量保持一致,尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。
注意:
试剂盒内酶标条可拆卸,按实验需求可分多次使用;使用后的剩余试剂盒建议在首次实验后 1个月内使用完毕。产品过期时间以盒子上的标签为准,保质期内所有组分都确保是稳定的。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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