试剂盒是打开病毒“锁”的一把钥匙，带你揭开它的“神秘面纱”现在很多人每天早上起来做的第一件事就是打开手机，先看一看当天新增的确诊人数，随着确诊人数的不断增加，不少人开始慌了，因为截至2月6号，全国确诊的人数已经达到了2812那么问题来了，不少人很想知道新型冠状病毒肺炎是如何确诊的，这就不得不提到试剂盒了。想必大家在最近的新闻里多多少少都听说过这个名字，但是试剂盒检测病毒的原理是什么，又是如何发挥作用的，可能大家还不是很了解，下面就一起来揭开它的神秘面纱。试剂盒是打开“病毒锁”的一把“钥匙”试剂盒表面上看起来很不起眼，远看就像一个装感冒药的盒子，里面放着反应液、检测酸液等，平凡却很关键，是检测新型冠状病毒的主要手段，也可以说是打开病毒锁的一把钥匙。大家可能都去过医院看病，只有医生明确了你患的疾病，才能够有针对性地进行治疗。而新型冠状病毒感染的肺炎可能有跟流感或者是普通感冒相似的症状，因此检验出它的传染源则至关重要。也就是说遇到新型病毒感染的时候，首先要确定病毒类型，病毒是一种个体微小的非细胞生物，只含有一种核酸，对它的检测要比检测细菌难得多，用传统的检测方法很难发现并追踪它，而试剂盒就起到这样一种作用。那试剂盒是如何发挥作用的？简单来说，病毒无论是处在寄生状态还是游离状态，它都有自己的遗传物质，也就是它自己的RNA，然后这种遗传物质会通过反转录酶合成DNA，再通过聚合酶链式反应然后来扩大DNA片段，然后通过对里面加入的荧光基团产生的荧光值进行检测，能够精准判断病毒数量，而且灵敏度也比较高。这种检测方法是基于荧光定量检测技术的试剂盒。之前之所以确诊的人数比较少，跟试剂盒缺乏也有一定的关系，现在确诊人数有了大幅度增长，很多人内心慌张，其实这也说明了检测能力的提升，但是这类检测是需要专业人士进行操作的，并不是一个普通人在家就能随随便便测，而且在检测的过程中，面对患者的痰液、粪便或者是血液，也需要在防控措施比较强的实验室中操作，所以，请给检测人员一点时间，毕竟他们也是用生命在捍卫更多人的生命。

可以调控寿命的线粒体蛋白近期，一项由南加州大学的研究人员发表在《Aging》杂志上的研究首次证明，一种微小的蛋白质对动物和人类的健康和长寿都有重大影响。该蛋白是线粒体基因组编码的一种叫做“humanin”的肽。通过对实验动物到人类患者的测量的结果表明，体内更高水平的humanin伴随着更长的寿命和更好的健康状况。同时，它与患阿尔茨海默症等疾病的低风险有关。文章作者Pinchas Cohen说：“humanin一直以来都有助于预防许多与年龄有关的疾病，这是首次证明它还可以延长寿命。”该研究检查了包括线虫和小鼠在内的几种动物以及包括阿尔茨海默氏病患者在内的人类中的同源蛋白。该结果突出了humanin和其他线粒体蛋白成为治疗与年龄有关的疾病的潜力。第一作者，南加州大学研究助理教授Kelvin Yen说，它们还表明，人类素可能是古老的线粒体信号传导机制，是调节人体健康和寿命的关键。在许多物种中，先前已经观察到人类蛋白水平会随着年龄的增长而降低。在这项新研究中，科学家们观察到容易长寿的生物体中的人源蛋白水平较高。相比之下，小鼠在生命的前18个月中会经历humanin下降40％，而灵长类动物（如恒河猴）在19到25岁之间似乎也具有惊人的humanin下降现象。Yan说：“长寿和繁殖之间的这种折衷被认为是由于在利用能量产生更多后代或利用能量维持生物体以进行未来生殖工作之间取得了进化上保守的平衡。从进化上讲，生命的目标是繁殖，然后就完成了，但如果不能繁殖，则应尝试尽可能长时间地徘徊，而这样做的副作用就是寿命。”更高的人源蛋白水平不仅与使用寿命的延长有关；较低的水平可能会增加疾病的风险，并降低对毒性暴露的抵抗力。 研究人员分析了少数阿尔茨海默氏症患者和没有痴呆症的对照个体的脑脊髓液样本，并注意到在阿尔茨海默氏症患者中人源蛋白水平要低得多。在新生儿脐带血样本中，高水平的人源蛋白与高线粒体DNA（mtDNA）拷贝数或每个细胞内存在的线粒体基因组拷贝数相关。Yan说：“人类血红蛋白水平与线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的减少呈负相关，而线粒体DNA的拷贝数本身与许多不同的疾病如癌症，肾脏疾病和心血管疾病有关。这项新的广泛研究突显了humanin作为生命和健康的重要性，并且利用它进行治疗可以解决各种与年龄有关的疾病

尊敬的各位客户：    根据国务院办公厅《关于2020年部分节假日安排的通知》，我司2020年端午节放假时间为6月25号（周四）-6月27号（周六），共计三天。6月28日（周日）正常上班。请各位新老客户注意假期安全~预祝大家端午节安康！      ——【泽叶生物】

1、唾液样本：1.1、 唾液一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶，最好的采集的时间时空腹采集；1.2、将样品收集于离心管后在-70 度冰冻 1 小时。 在冰上融化样品后， 10000rpm 离心 10 分钟，取上清检测；1.3、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。2、尿液样本：2.1、无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；2.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。3、精液样本：3.1、将精液收集于无菌容器中，正常精液射出体外呈稠厚的胶冻状，射出体外后需在室温或 37 度水浴箱中使其在前列腺分泌的纤维蛋白溶解酶的作用下液化，变的稀薄。待精液完全液化后，将精液 4000 rpm 离心 10 分钟分离精浆进行检测；3.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。4、粪便样本：4.1、尽量采集干的粪便，粪便过稀会较难处理且降低检测的准确性。采集的重量应大于 50 mg，将粪便用 PBS 洗 3 次（最终粪便质量：PBS 体积=1:9），用超声粉碎（或捣碎）后于 5000×g 离心 10 分钟，取上清检测；4.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。5、肺泡灌洗液、脑脊液样本：5.1、样本收集后于 1000g 离心 20 分钟，离心后收集上清，并将标本保存于-20度，且应避免反复冻融；5.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。6、痰液样本：6.1、选择痰液中较为粘稠部分称重， 加两倍于痰量的 0.1% DTT(二硫苏糖醇)。DTT 的主要作用是溶解粘液，用吸管反复吹打，漩涡器振荡 15s，37 度恒温水浴振荡 5 分钟；6.2、加入两倍于痰量的 PBS 缓冲液继续振荡 15-20 分钟，150 目的金属丝网过滤，1500 rpm 离心 10 分钟吸取上清液检测；6.3、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。7、牛乳样本：7.1、将牛乳4°，12000g 离心 30 分钟，去除上层脂肪，以及下层沉淀，取中间层样本用于检测；7.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。8、细胞样本    8.1、一瓶细胞，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，加入适当培养液，制备成细胞悬液；8.2、细胞悬液转入离心管中，4℃，2500rpm离心5min；    8.3、弃掉上清，沉淀中加入遇冷的PBS,吹打混匀，4℃，2500rpm离心5min；重复一次这个步骤；    8.4、去掉上清，加入适量细胞裂解液（细胞裂解液中加入PMSF）,置于冰上，裂解30min-1h，裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解；    8.5、取出离心管，4℃，12000rpm离心5min；    8.6、上清移入EP管中，-20℃保存。

TOP1：标曲显色过强无明显梯度1、主要怀疑点：洗板不充分：1.1、机器洗版：确保机器设置的针头能吸干孔中液体，并且加液针头能加液大于350ul，加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。1.2、手动洗板，严格按照步骤，使用干净灭菌的枪头和加样槽，使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液，静置90秒，在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。1.3、特别注意，在加入TMB前的洗板步骤极其重要，残留的HRP酶会直接导致TMB显色。2、次要怀疑点：2.1、TMB 已经污染，检测TMB是否透明无色，如果偏蓝就是污染了。2.2、检查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是双蒸水，三蒸水或无离子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属，以及HClO都会氧化TMB。2.3、酶标板受潮，长霉，或者试剂过期。2.4、环境污染，空气中有导致显色的物质或者粉尘。Top2：显色较弱或不显色，没有说明书提供的数据阳性强可能原因分析：1、检查标准品是否受潮或者拿错2、检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存，特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC， 如果放在-20度，融化后会严重影响其活性。3、移液器是否校准，可以用去离子水较准移液器，1000ul=1.0g  100ul=0.1g  10ul=10mg4、37度培养箱是否校准温度（建议用水银温度计放入水杯中，平衡12小时以上进行测量）。5、SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。6、未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。7、试剂盒过期。Top3：复孔做的不好，CV值差异大可能原因分析：1、复孔OD450数值在0.5-2.5之间计算的偏差相对较小，小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高，复孔样品数量在5-10个最佳。2、操作时按照标准动作进行加样，比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面，枪头尖部的残留液体可以触碰到液面，使之流入样品孔。3、加样尽量快速准确，不要产生气泡。4、样品需要做预实验，使用不同浓度进行测试，找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大Top4：显色太快，背景小于0.2，但是样品没有阳性。试剂盒工作正常，但是样品没有阳性。可能原因分析：1、样品是否保存妥当。蛋白容易降解，最好保存在-80℃，或者新鲜样品立即检测。2、样品含有的基质影响抗原抗体结合，导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5，1/10，1/100，1/1000来摸索最佳检测稀释比，稀释液稀释样品后会消弱基质效应，阳性就会升高。3、部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品，如果样品稀释后还是检测不到阳性，建议4度16小时孵育标准品和样品，其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作。4、如果是特殊的样品，请通过邮件与我们技术支持进行联系。TOP5：稀释过的样本OD 值比没有稀释的样本值高些1、血清有基质效应，会导致试剂盒回收率下降。所以用原液检测数值会低于稀释后的数据。2、ELISA试剂盒提供的稀释液有抗基质成分，说明书要求样品至少稀释1倍以上3、血清的基质的一类异嗜性抗体或者溶血后的物质，这些物质会封闭捕获抗体，导致抗体无法结合样品中的蛋白，当稀释后 这类物质效应下降，回收率就升高。Top6：标曲方程选择问题一般我们选择曲线平滑上升或者下降，所有点都在曲线上，R值接近于1的方程

10种提高免疫力的自然方法春节前后，自然少不了访亲探友，外出旅游，聚餐这一类增进感情的活动。但是频繁的外出，或是大鱼大肉很容易生病。DLdevelop向大家介绍10种提高免疫力的方法。让你在春节期间，玩的不扫兴。 1.获得充足的睡眠并控制压力。睡眠匮乏和压力超负荷会增加激素皮质醇，这些持续增加会抑制免疫功能。2避免被吸烟。它会破坏基本的免疫防御能力，并增加支气管炎和肺炎风险，甚至儿童的中耳感染。3.少喝酒。过量引用会损害免疫系统并增加对肺部易感性。4.多吃蔬菜，水果，坚果和种子，为身体提供免疫系统所需的营养。一项针对老年人的研究表明，增加的水果和蔬菜摄入量可以改善抗肺炎链球菌疫苗的抗体反应，从而预防肺炎链球菌。5.益生菌。研究表明，补充剂可以减少呼吸道和胃肠道感染的发生率。发酵乳产品也被证明可以减少成人和儿童的呼吸道感染。6.多晒太阳。阳光可以导致皮肤中维生素D的产生。维生素D水平低与呼吸道感染风险增加有关。 2010年对儿童的一项研究表明，每天补充1200 IU的维生素D可降低甲型流感的风险。7.吃大蒜。大蒜是一种免疫增强剂。8.吃药用蘑菇，如蘑菇。最近的一项研究表明，浓缩蘑菇提取物可以增强乳腺癌患者的免疫功能。9.尽量使用草本植物。10.听自己喜欢的音乐。美妙的音乐能刺激大脑感觉愉悦，从而提高免疫力。

“神药”阿司匹林到底有多神？阿司匹林，这个百年老药也许是全世界人们最为熟悉不过的。据说，光是美国人每天就要吞下20吨该药片；在太平洋一个岛国，阿司匹林还可当硬币用……阿司匹林早于1899年问世，一直被用于止痛、退热与消炎。直至20多年后，科学家才逐渐发现它的新作用，将阿司匹林送上“神坛”。那么阿司匹林到底有多神那？1. 止痛退热这种药品能够阻止前列腺素的合成，正是这种前列腺素能够参与肌体炎症，升高体温和增加疼痛感，所以阿司匹林具有止痛退热的作用。2. 抗血栓阿司匹林通过抑制血小板的前列腺素环氧酶、从而防止血栓烷A2的生成防止血小板聚集，起到抗血栓的作用。3. 抗炎炎症其实是一系列复杂的人体反应，而阿司匹林是这个反应过程之中相应酶类的抑制剂，可以很好的中断炎症物质生成反应。从而减少或者减轻炎症反应，具有很好的抗炎效果。4. 防止癌症防治肿瘤。研究发现，常规使用阿司匹林可使患直肠癌的危险降低。其机理可能与血中前列腺素降低有关。国外有调查报告指出，隔日服用阿司匹林的消化道癌症患者死亡降低40%，食道癌的发病率可降低40%。5. 治疗阿尔茨海默病研究发现，经常服用阿斯匹林的老年人患老年痴呆和认知障碍的危险性明显降低。小剂量阿司匹林可以减少老年痴呆症恶化。6. 治疗习惯性流产 韩国汉阳大学医学院采用适量的阿司匹林治疗，使一些患习惯性流产的妇女成功生育。阿司匹林在人体内水解生成水杨酸和醋酸，这两种酸性产物有抑制胚胎流产、防止胎儿畸形的作用。阿司匹林—一个不朽的传奇！在其发现最初，一直被用于止痛、退热与消炎。但随着医药研究的进步，它的其余神奇疗效不断被发现。随着医药研发的进步，我们无锡市东林科技发展有限责任公司的科研试剂也要紧随其后，才可以为奋战在一线的科学家们提供最及时周到的服务。作为生物领域的一个生产型企业，我们公司主要生产研发ELISA kit，这一类产品主要是检测蛋白质，激素等物质在生物样本中的浓度，为了紧跟时代步伐，我们也会努力研究，把自己推向科学发展最前沿。

1、唾液样本：1.1、 唾液一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶，最好的采集的时间时空腹采集；1.2、将样品收集于离心管后在-70 度冰冻 1 小时。 在冰上融化样品后， 10000rpm 离心 10 分钟，取上清检测；1.3、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。2、尿液样本：2.1、无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；2.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。3、精液样本：3.1、将精液收集于无菌容器中，正常精液射出体外呈稠厚的胶冻状，射出体外后需在室温或 37 度水浴箱中使其在前列腺分泌的纤维蛋白溶解酶的作用下液化，变的稀薄。待精液完全液化后，将精液 4000 rpm 离心 10 分钟分离精浆进行检测；3.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。4、粪便样本：4.1、尽量采集干的粪便，粪便过稀会较难处理且降低检测的准确性。采集的重量应大于 50 mg，将粪便用 PBS 洗 3 次（最终粪便质量：PBS 体积=1:9），用超声粉碎（或捣碎）后于 5000×g 离心 10 分钟，取上清检测；4.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。5、肺泡灌洗液、脑脊液样本：5.1、样本收集后于 1000g 离心 20 分钟，离心后收集上清，并将标本保存于-20度，且应避免反复冻融；5.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。6、痰液样本：6.1、选择痰液中较为粘稠部分称重， 加两倍于痰量的 0.1% DTT(二硫苏糖醇)。DTT 的主要作用是溶解粘液，用吸管反复吹打，漩涡器振荡 15s，37 度恒温水浴振荡 5 分钟；6.2、加入两倍于痰量的 PBS 缓冲液继续振荡 15-20 分钟，150 目的金属丝网过滤，1500 rpm 离心 10 分钟吸取上清液检测；6.3、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。7、牛乳样本：7.1、将牛乳4°，12000g 离心 30 分钟，去除上层脂肪，以及下层沉淀，取中间层样本用于检测；7.2、处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80 度不应超过 2 个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。8、细胞样本    8.1、一瓶细胞，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，加入适当培养液，制备成细胞悬液；8.2、细胞悬液转入离心管中，4℃，2500rpm离心5min；    8.3、弃掉上清，沉淀中加入遇冷的PBS,吹打混匀，4℃，2500rpm离心5min；重复一次这个步骤；    8.4、去掉上清，加入适量细胞裂解液（细胞裂解液中加入PMSF）,置于冰上，裂解30min-1h，裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解；    8.5、取出离心管，4℃，12000rpm离心5min；    8.6、上清移入EP管中，-20℃保存。

TOP1：标曲显色过强无明显梯度1、主要怀疑点：洗板不充分：1.1、机器洗版：确保机器设置的针头能吸干孔中液体，并且加液针头能加液大于350ul，加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。1.2、手动洗板，严格按照步骤，使用干净灭菌的枪头和加样槽，使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液，静置90秒，在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。1.3、特别注意，在加入TMB前的洗板步骤极其重要，残留的HRP酶会直接导致TMB显色。2、次要怀疑点：2.1、TMB 已经污染，检测TMB是否透明无色，如果偏蓝就是污染了。2.2、检查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是双蒸水，三蒸水或无离子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属，以及HClO都会氧化TMB。2.3、酶标板受潮，长霉，或者试剂过期。2.4、环境污染，空气中有导致显色的物质或者粉尘。Top2：显色较弱或不显色，没有说明书提供的数据阳性强可能原因分析：1、检查标准品是否受潮或者拿错2、检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存，特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC， 如果放在-20度，融化后会严重影响其活性。3、移液器是否校准，可以用去离子水较准移液器，1000ul=1.0g  100ul=0.1g  10ul=10mg4、37度培养箱是否校准温度（建议用水银温度计放入水杯中，平衡12小时以上进行测量）。5、SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。6、未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。7、试剂盒过期。Top3：复孔做的不好，CV值差异大可能原因分析：1、复孔OD450数值在0.5-2.5之间计算的偏差相对较小，小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高，复孔样品数量在5-10个最佳。2、操作时按照标准动作进行加样，比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面，枪头尖部的残留液体可以触碰到液面，使之流入样品孔。3、加样尽量快速准确，不要产生气泡。4、样品需要做预实验，使用不同浓度进行测试，找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大Top4：显色太快，背景小于0.2，但是样品没有阳性。试剂盒工作正常，但是样品没有阳性。可能原因分析：1、样品是否保存妥当。蛋白容易降解，最好保存在-80℃，或者新鲜样品立即检测。2、样品含有的基质影响抗原抗体结合，导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5，1/10，1/100，1/1000来摸索最佳检测稀释比，稀释液稀释样品后会消弱基质效应，阳性就会升高。3、部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品，如果样品稀释后还是检测不到阳性，建议4度16小时孵育标准品和样品，其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作。4、如果是特殊的样品，请通过邮件与我们技术支持进行联系。TOP5：稀释过的样本OD 值比没有稀释的样本值高些1、血清有基质效应，会导致试剂盒回收率下降。所以用原液检测数值会低于稀释后的数据。2、ELISA试剂盒提供的稀释液有抗基质成分，说明书要求样品至少稀释1倍以上3、血清的基质的一类异嗜性抗体或者溶血后的物质，这些物质会封闭捕获抗体，导致抗体无法结合样品中的蛋白，当稀释后 这类物质效应下降，回收率就升高。Top6：标曲方程选择问题一般我们选择曲线平滑上升或者下降，所有点都在曲线上，R值接近于1的方程

实验结果不理想，就是因为你忽视了这一步 ··· ···优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号，从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留，在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景，从而带来不理想的结果。在做ELISA实验时，洗板有两种方法：手工法洗板和洗板机洗板。二者没有本质的差别，只要操作合乎要求，均能得到正确、可靠的结果。手工洗板手工洗板人为因素比较大，实验人员必须经验丰富，洗涤次数要足够，冲击力又不要太大，加入的洗液量以刚满反应孔为限，防止孔口内有游离酶未能洗净，同时防止孔与孔之间液体交叉。洗涤结束后扣干亦非常重要，否则易造成假阳性。每次洗完板后，在吸水纸上轻轻拍干，拍板时要垂直，避免交叉感染。用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离;吸水纸要一次性使用，应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。酶结合物不耐干燥，特别在较高的温度下更易失活，所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间，时间越长，吸光度值越低。手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种方法：浸泡式1.吸干或甩干孔内反应液；2.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；3.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1～2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；4.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；5.重复操作步骤3和4，洗涤3～4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%～0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。

血清专题：你的实验有必要做血清热灭活吗?细胞培养是很多下游实验的基础，细胞培养的好坏会直接影响后续实验的成功和稳定，而血清作为细胞培养的主要试剂对实验的重要性不言而喻！血清的热灭活是很多培养者感兴趣的话题，价格不菲的血清中含有诸如生长因子、维生素、氨基酸等珍贵物质，而将它们置于56℃的温度长达30分钟是完全没有必要的。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，多数实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响，下面我们就对血清的热灭活来探讨探讨。血清灭活的目的是什么？ 1  血清热灭活目的主要是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。 2  研究人员曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定，他们发现胎牛血清中含有的C1、C6仅达成年动物血清的1-3%，而其它补体成分仅有成年动物的5-50%，至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验，也未发现有明显的溶血现象。多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程，也对热敏的补体有灭活的作用。 3  热灭活另一个目的是为了使支原体失活。 血清使用前是否都必须热灭活？ 1  在免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。而对于其他大多数的细胞来说是不需要热灭活血清的。 2  很多情况下，热灭活并不会改善细胞的生长，却降低了支持细胞生长的能力。即使在少数有促进的情况下，其促进的比率也是微不足道。另外，血清的热灭活导致的沉淀常常被认为是微生物污染，从而给用户带来不必要的麻烦。 3  建议，对血清进行灭活的用户，需要通过试验来证实其必要性。 血清热灭活对细胞生长有帮助吗？细胞生物学家比较了正常热灭活胎牛血清对各种细胞株的生长能力影响，发现11株细胞中，热灭活对6 株细胞有负面影响（红）、3株无影响（绿）、2株有微弱正面改善（黄） 血清热灭活应该怎么操作？ 1  融化血清，并充分混匀其内容物。 2  对照瓶装等量水，插入温度计。 3  将血清瓶和对照瓶放入56℃水浴箱。 4  当温度达到56℃，立即开始计时。 5  每5分钟，旋转血清瓶一次，轻微规则摇晃，以使瓶中血清受热均匀一致。 6  56℃，30分钟后，立刻去除血清。注意事项：血清灭活时，避免接触到加热管，防止受热不均匀，导致灭活失败，血清灭活后，冷水浴冷却。 为什么血清灭活后产生大量沉淀？ 1  血清灭活后出现的沉淀大多数是纤维蛋白析出，属正常现象。灭活过程多次摇晃使血清受热均匀可以降低蛋白的析出。 2  当血清在未完全化冻状态时直接置56℃水浴、灭活过程中局部受热过高、加热时间过长就会产生胶状沉淀，这样的血清质量严重受损，是无法继续正常使用的。

ELISA小能手 三分钟带你看懂趋化因子家族趋化因子（chemokines），也称做趋化激素、趋化素或是化学激素。趋化因子（来源于希腊语激情、运动）是专门协调免疫细胞向组织运动的小多肽（约8-10 kDa）。趋化因子的理论和应用研究是目前生命研究的热点之一。它们在炎症、淋巴器官发育、细胞运输、淋巴组织内的滤泡形式、血管生成和伤口愈合中起重要作用。趋 化 因 子 结 构在趋化因子的分子中通常有4个保守的半胱氨酸（C），这些半胱氨酸通过二硫键形成特殊的三级结构。根据靠近分子氨基酸（N端）的前两个C间是否插入其他氨基酸，将它们分成4个亚类：CXC类（插入1个氨基酸残基）；CC类（不插入其它氨基酸残基）；CX3C类（插入3个其它氨基酸）；C类（N端仅一个C）。趋 化 因 子 生 物 活 性趋化因子是一类小分子分泌蛋白，参与炎症和免疫应答过程，如诱导淋巴细胞游走到炎症部位、参与天然免疫和获得性免疫应答、刺激或抑制血管的生成、抑制病毒感染和增强细胞毒性T淋巴细胞应答等。趋化因子系统在免疫系统功能行使得各个环节中处于关键地位，并由此在病原体的清除、炎症反应、病原体感染、细胞及器官的发育、创伤的修复、肿瘤的形成及其转移、移植排斥等方面都起着重要的作用。家 族 成 员 一 览 表趋化因子被分为四个主要的亚家族：CXC，CC，CX3C和XC。所有这些蛋白质都通过与G蛋白质连接的跨膜受体（称为趋化因子受体）相互作用而发挥其生物学作用，该受体在其靶细胞表面被选择性地发现。

ELISA实验中不容忽视的「温育」盘点温育的时间选择温育这一步是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。目前国内ELISA试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟-1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1-2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。温育的温度选择温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。温育的保温选择温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（“边缘效应”即外周孔显色较中心孔深）。可将ELISA板置于水浴箱中，板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料（如金属等），在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。为避免酶标板底部受水汽或磨损导致的读数误差，一般采用鼓风恒温箱保温，这个过程必须在酶标板上方贴封纸，以免蒸发。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证时间精确，一个人一次不宜多于两块板同时操作、测定。关于温育，在实际测定操作中应注意不同的温育环境对检测结果有影响，操作中应严格按照说明书控制温育时间及温度，并注意封闭避免边缘效应。为确保各板温度都能迅速达到平衡，不可将反应板叠加放置，设定的温度及时间严格按照说明书进行，一般加入待测标本后使其与固相抗原(抗体)置于37℃环境下温育。因为很多恒温箱的构造，温度及检测的温度并非酶标板温育温度，所以使用恒温箱温育时建议将温度计置于酶标板旁，保证酶标板旁温度为37℃。干育和水温的影响差异较为明显，建议使用水温，注意将固相板放入水中，防止受热不均匀。试剂盒一般设定的反响温度为 37℃，在这个温度下放置 30 分钟，蒸腾的水分会许多，对于全部反响体系来讲，各种反响物的浓度会不断添加，这么必会致使反响毕竟的值添加，温育时贴封片或加盖，避免标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁。试剂盒断定的一定温度下的反响时间并不是反响的完毕，添加反响的温度，会加速反响，一样添加时间会延伸反响，这么得到的反响程度会比试剂盒断定的反响程度多，也会引起阴性高值或假阳性。