【分享】深度，基因治疗AAV载体定量之二

通过液滴数字PCR对单链和自身互补的腺相关病毒载体基因组滴度进行绝对定量

作者： James M. Wilson

摘要

准确定量腺相关病毒(AAV)载体基因组拷贝数对于临床前和临床中正确和可重复的给药至关重要。目前定量PCR(qPCR)是检测AAV基因组的主流方法。然而，由于AAV基因组自身互补配对或过早包装不完整基因组，基于qPCR的AAV载体基因组滴度测定还存在问题。液滴数字PCR(ddPCR)是一种新的PCR技术，可以无与伦比的精确度直接定量DNA拷贝，而不依赖标准曲线及高PCR扩增效率，这些特性有助于准确定量单链和互补AAV基因组。在本文中，我们将基于ddPCR的AAV基因组滴度测定与标准和优化的qPCR测定方法进行比较，以定量单链和互补的AAV基因组。结果显示，ddPCR对单链AAV载体基因组的绝对定量，与标准qPCR检测相比，滴度增加了4倍。对于自互补AAV载体，ddPCR滴度分别比标准qPCR、优化qPCR和琼脂糖凝胶测定法测定的滴度平均高5、1.9和2.3倍。基于液滴数字PCR的基因组滴度在批内和批间精度方面均优于qPCR，并且对PCR抑制剂更具抵抗力，是监测病毒生产过程及体内生物学分布的理想方法。

引言

腺相关病毒(AAV)载体介导的基因治疗在临床上的成功以及欧洲第一个基于AAV的基因治疗产品(Glybera)的批准，引爆了对更安全可靠的AAV载体生产和检测方法的需求，以满足行业标准和商业生产的要求。

AAV载体放行的最关键指标就是AAV基因组滴度测定，因为基因组拷贝数是临床前和临床研究中使用最普遍的剂量标准。以往测定基因组滴度的主要方法是DNA斑点印迹，随着实时定量PCR(qPCR)的出现，AAV基因组滴度分析得到了很快的发展，并显著增加了检测的准确性和简便性，目前qPCR常用于AAV基因组滴度测定。然而在生产用于临床试验的自身互补AAV(scAAV)载体期间，发现qPCR测定的滴度与斑点印迹和紫外分光光度法测定的滴度之间存在很大差异（10倍）。目前认为造成这种差异的原因是qPCR扩增的片段靠近病毒基因组互补配对的发夹状反向末端重复(ITR)区域。scAAV基因组自身退火并干扰了PCR扩增反应的整体效率，从而干扰了基因组滴度的准确测定。Fagone及其同事随后发表的一篇论文报告称，这种效应导致的错误程度与PCR目标序列和发夹ITR的空间距离相关，通过限制性内切酶消化物理分割PCR目标序列和发夹ITR能显著提升病毒的检测结果。这一发现引入了对AAV的检测一项建议：无论是基于qPCR或是琼脂糖凝胶的检测，在检测之前都需要对发夹ITR进行限制性内切酶消化。该研究的另一个含义是：如果一项标准qPCR可用于量化scAAV基因组，PCR反应所使用的扩增子最好远离发夹ITR。然而，目前标准qPCR的方法并未排除靶向发夹ITR区域，所以scAAV基因组的定量很可能还存在问题。研究人员要么使用一些复杂并容易出现操作失误的方法，要么花大量时间用于qPCR检测的设计和验证。

qPCR在理想条件下是稳定的，但不当的引物设计、反应体系中存在抑制剂或如之前提到的scAAV载体模板中的二级结构等因素会显著影响PCR的扩增效率。qPCR的另一个问题依赖于标准曲线，但标准曲线本身可能会存在误差。无论是单因素还是组合因素，都可能导致AAV基因组滴度的误报。数字PCR(dPCR)于1990年代首次引入，已经成为日常使用的实用技术。dPCR将模板进行分割后，可以同时运行数万个纳升级PCR反应。使用标准的TaqMan引物探针组合，通过荧光对阳性和阴性反应进行判读，然后获得模板的绝对拷贝数。前面提到qPCR技术存在许多缺陷不适用于dPCR，因为即使是低效率的PCR也会被判读为阳性，并且不需要标准曲线。该技术以在各种DNA应用中无与伦比的精确度和灵敏度而闻名，这些特征使dPCR成为临床级AAV制品定量的首选方法。

无需标准曲线或无需高效率的PCR反应即可直接对DNA定量的能力将使我们能够应用一种通用技术来检测ssAAV和scAAV基因组。我们证明了基于ddPCR的rAAV基因组滴度测定是可靠的，报告的滴度与qPCR和基于DNA凝胶的测定等效或更高，并能将dPCR的精度转化为AAV载体的滴度。此外，我们证明了与qPCR相比，ddPCR检测对PCR抑制剂的抵抗力增强，这一结果将有助于评估病毒粗提物的滴度以及生物学分布研究。

结果与讨论

qPCR目前是AAV基因组滴度测定的标准方法。然而，qPCR低估AAV自身互补基因组滴度的现象促使我们重新审视AAV滴度检测方法并探索数字PCR在AAV基因组定量中的潜力。标准qPCR检测包括对样品进行DNaseI处理，然后进行系列稀释、衣壳热变性以释放载体基因组，以及依据线性化质粒标准曲线进行qPCR定量。低浓度AAV载体会与塑料表面结合导致丢失，这一点可以通过在体系中加入表面活性剂来克服。我们对检测体系进行了优化，初步结果表明，加入0.1%的PF-68或用蛋白酶K预处理然后热灭活可以将标准qPCR测定的平均滴度分别提高2.9倍和2.4倍，当两种处理方法合并时可以提高3.5倍。因此，最终优化的qPCR检测采用了两种处理方法。数字PCR使用与qPCR相同的引物探针，但没有对样品进行蛋白酶K处理，因为包装到单个衣壳中的正链和负链一旦从衣壳中释放出来可能会重新退火，导致不会分散到单个液滴中。由于数字PCR输出是绝对测量值，因此不需要质粒校准曲线。

AAV标准曲线存在偏差

我们的终极目标是在一系列AAV载体中比较三种基因组滴度分析（标准qPCR、优化qPCR和ddPCR）的性能。最初，我们开始使用ddPCR校准两个质粒标准品（表1）。对于nRBG标准品，使用两种不同引物探针（nRBG和eGFP），ddPCR最初确定的拷贝数比通过分光光度法测定的拷贝数低50%。为了提高ddPCR和分光光度法确定的拷贝数之间的一致性，我们增加了PCR循环数并在PCR过程中增加延伸步骤。尽管这些方法提升了ddPCR测定的滴度，但仍比预期低30%。对于BGH标准品，使用优化后的条件通过ddPCR检测到的拷贝数与分光光度法测定的拷贝数基本吻合。nRBG和BGH ddPCR结果之间的差异表明nRBG分光光度法测量拷贝数存在偏差，所以使用质粒标准曲线进行qPCR定量存在问题，因为质粒自身的定量可能就存在偏差。

采用数字PCR验证质粒标准品的拷贝数

^a采用分光光度计检测换算

^b采用优化后的PCR扩增程序

ddPCR对PCR扩增效率有较高耐受性

使用三种PCR方法检测及比较一系列包含单链和自身互补基因组的AAV载体。对于各种血清型的单链AAV载体，优化qPCR和ddPCR基因组滴度测定显示比标准qPCR测定增加1.5到3.8倍。对于单链载体，ddPCR与优化的qPCR滴度的比率始终接近1。对于自互补载体，优化的qPCR和ddPCR检测的滴度分别比标准qPCR检测高4倍和8倍。此外，对于测试的6种scAAV载体，ddPCR检测的滴度比优化的qPCR检测高1.5到2.5倍。在ssAAV载体的情况下，优化qPCR和ddPCR分析观察到的更高滴度很可能是由于稀释缓冲液中包含表面活性剂。然而，对于scAAV载体，与优化的qPCR检测相比，获得的更高ddPCR检测滴度似乎对这种基因组类型具有特异性，反映了ddPCR对低效率PCR扩增具有更好的耐受性。

Fagone2011年报告说，与其他类型的引物探针组合相比，距离scAAV基因组发夹ITR小于1000bp的引物探针往往会低估基因组滴度，说明靠近发夹位置的引物探针表现出更大的抑制作用。假定抑制效应是由于发夹基因组的快速退火导致引物探针不能与扩增区域结合，那么这种抑制效应在扩增子成为主要模板之前的早期循环中是最明显的，足以使扩增曲线向右移动并导致循环阈值的延迟。与qPCR相比，ddPCR对PCR扩增效率的依赖性较小，因为不需要达到循环阈值。为了评估scAAV基因组空间抑制效应是否对ddPCR和优化qPCR有不同的影响，两种测定方法都使用了距scAAV发夹ITR不同距离的引物-探针组合。与靶向发夹ITR-远端序列引物探针相比，靶向CMV和TBG启动子（分别距5'ITR290和444bp）的引物探针组，无论使用ddPCR或者优化的qPCR，检测的滴度低约2倍。相反，对于ssAAV基因组，在ddPCR或优化的qPCR分析中，使用CMV或TBG引物和探针与远侧靶向引物-探针没有差异。以上结果表明：接近发夹结构而不是引物探针组内在特性导致检测结果偏低，无论在哪种检测中，都要避免使用靠近发夹的引物探针。尽管PCR靶标的位置影响了scAAV载体基因组滴度检测，但ddPCR检测结果依然高于优化的qPCR，表明ddPCR不需要达到循环阈值的特点仍然比qPCR有优势。

数字PCR的重复性和精密度更优秀

数字PCR广为人知的优势是在定量基因拷贝数方面的高度精确性。尽管大量文献报道ddPCR比qPCR精度更高，但我们想确认ddPCR在AAV基因组滴定方面是否有优势。采用优化的qPCR和ddPCR，使用不同的引物探针组合对多个AAV样本重复检测3次，采用变异系数来评价每个方法学的精密度。对于优化的qPCR分析，nRBG和BGH引物探针组合的CV值中位数分别为5.35%和4.37%，CV值分布范围的上限分别为33.2%和8.7%。对于ddPCR分析，三个引物探针组合的CV值中位数分别为2%或更低，检测结果的分布范围更集中。作为临床开发计划的一部分，既往使用ssAAV载体（批次WL057CS）对优化的qPCR程序进行过正式的批间验证研究。由2名操作员对6个样本分别进行6次重复，变异系数的分布范围在11.5%~16.5%（均值，13.7%），这个结果与使用标准qPCR对阳性对照载体重复检测13次的CV（16.5%）相似。采用ddPCR进行相同的评价，获得的平均滴度与优化qPCR测定法获得的平均滴度非常相近，但变异系数平均值为5.0%（分布范围，2.7-7.92%），比优化的qPCR程序几乎低了3倍。结果表明ddPCR基因组滴度测定与qPCR测定相比，在测定内和测定间水平上都有更高的精度。

批内精密度评价

批间精密度评价

数字PCR对复杂抑制物比qPCR至少好10倍

在我们的研究过程中获得的数据表明：在载体稀释过程中使用表面活性剂以及用蛋白酶K处理衣壳可以显著提高qPCR滴度，然而，由于二级结构的存在、scAAV载体基因组自身互补、反应体系中的抑制物会抑制PCR扩增效率进而影响循环阈值。使用数字PCR，只要扩增后的微滴荧光信号超过阴性微滴的荧光信号，就可以判读为阳性微滴，因此，纯度较差样本中PCR抑制剂对ddPCR的影响不像在qPCR中那么严重。我们采用AAV基因组滴度测定验证了这个猜想，将未纯化的粗提物样品进行梯度稀释，并在稀释液中掺入已知量的纯化AAV载体，然后使用ddPCR和优化的qPCR对样品进行检测。在稀释1000倍的样本中，ddPCR检出了近100%的掺入AAV载体。相比之下，qPCR在10,000倍稀释的样品中检出了80%的掺入AAV载体。因此，我们的初步数据表明，ddPCR对细胞大分子和基因组复杂抑制物的抵抗能力至少比qPCR优秀10倍，该方法可用于评估早期生产阶段未纯化载体样品中的AAV拷贝数。

抑制物对ddPCR及qPCR定量结果的影响

AAV参考物质的标定研究

目前qPCR之所以被认为是AAV载体基因组滴定的最佳方法，是因为与更早期的基因组分析方法相比，它提供了更好的特异性和精确度。rAAV2参考标准物质(AAV2RSM)由多个独立实验室使用通用qPCR方法协同标定。在这项研究中，实验室间检测结果的变异系数非常大（CV，77.7%），甚至在其中一个实验室内，也观察到变异系数高达60%。有趣的是，当通过ddPCR对AAV2RSM进行标定时，获得的滴度（3.6×10^¹³GC/mL）与报告值（3.28×1013GC/mL）相似，表明尽管检测结果的变异度很大，AAV2RSM检测结果的平均值接近真实值。除了各实验室在qPCR操作上的差异，另一个误差可能源自于各实验室采用了不用的基于qPCR的AAV载体基因组滴定方案。从我们的研究数据可以看出即使对qPCR方法学进行非常小的修改，例如在没有表面活性剂或蛋白酶K处理的情况下进行检测，也会导致检测结果的巨大差异。对于scAAV载体，qPCR目标区域的选择不当会进一步影响检测结果。因此，总的来说，需要更稳定、更精确的方法来定量AAV载体基因组滴度。

自身互补AAV（scAAV）载体的定量

scAAV载体基因组定量，Fagone及其同事2011年引入了两种新的检测方法，一种是在qPCR之前用限制性内切核酸酶切割末端发夹（称为ED-PCR），另一种是基于天然琼脂糖凝胶分析，。尽管这两种方法都能够克服scAAV基因组对PCR的抑制作用，但它们都存在局限性。分析间变异被认为是ED-PCR的一个问题，如果不同的载体基因组需要不同的限制性内切酶，这种变异可能会显著增加。另一些更古老的AAV基因组定量方法，如DNA斑点杂交和最近的Southern印迹，虽然可以克服基因组自身退火的问题，但特操作步骤非常复杂，容易引入偏差，不太可能被用作生产环境中的检验放行。通过紫外分光光度法直接定量AAV载体基因组是另一种检测方法，但仅限于高纯度制剂。相比之下，ddPCR代表了一种高度精确的AAV载体基因组定量方法，不会受到低效扩增或标准曲线问题的过度影响。该技术为所有AAV载体类型提供了一种通用的检测方法，没有qPCR的一些限制，也不需要针对scAAV载体开发特定的方法。尽管不能完全消除scAAV载体末端发夹结构对引物探针造成的抑制，但与最优的qPCR检测结果相比，ddPCR仍然显著提升了检测结果，提高了批内和批间精度，非常适合此类载体的定量。这非常符合临床及商业化载体生产中对高度的重现性和精密度的需求，小的滴度差异可以转化为更少次数的规模量产并节省更多成本。ddPCR检测的高精度可以减少重复次数，从而在单个96孔板上进行多样本、多引物探针组合分析。不需要质粒标准曲线免除了制备过程中涉及的时间、费用和误差。ddPCR有效地降低了引物探针的扩增效率阈值，并允许对不同扩增效率的检测结果直接进行比较。在分析纯度不够的样品，或在临床前/临床研究中分析AAV载体基因组的生物分布时，ddPCR在灵敏度、精密度和对抑制物的耐受方面具有实质性优势。

ddPCR检测体系的验证和确认

要将基于ddPCR的基因组分析发展为符合cGMP/GLP要求的方法，需要使用经过验证的终产物对ddPCR方法学进一步验证，例如准确度、精密度、定量限和线性范围等。该验证批次将包含在每次检测中，并作为参考点以确认正确的样品制备和检测性能。此外，还需要对ddPCR仪器本身进行确认和验证，并且执行对仪器的安装和操作确认(IQ/OQ)程序。但执行了这些验证程序后，ddPCR基因组滴度测定会非常适合用于临床级AAV载体的生产。

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原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3991984/