纳米孔测序+CRISPR：新方法挑战基因组暗物质

基因组的大部分由单调的重复组成，其中某些短片段会重复数百次甚至数千次。不过，重复次数通常有个范围，若大大超出这个范围，则有可能造成严重的后果。以脆性X综合征为例，患者FMR1基因5’非编码区上的CGG异常扩增是主要原因。然而，这些重复区域的检测仍然颇具挑战性。

近日，德国马克斯•普朗克分子遗传学研究所领导的研究团队在《Nature Biotechnology》杂志上发表了一种新方法，能够仔细观察这些过去无法触及的基因组区域。这种方法结合了纳米孔测序和CRISPR-Cas技术，有望改善先天性疾病和癌症的诊断。

马克斯•普朗克分子遗传学研究所的Franz-Josef Müller是文章的通讯作者。他的团队首次成功确定了源自患者的干细胞培养物中基因组串联重复的长度。研究人员还利用纳米孔测序和CRISPR-Cas技术，通过扫描单个DNA分子而获得了重复序列的表观遗传状态，为基因组重复区域的研究以及各种疾病的快速诊断打开了大门。

X染色体上的基因缺陷

在脆性X综合征中，X染色体上FMR1基因5’非编码区的重复序列大大扩增。“细胞识别出重复区域，并通过在DNA上添加甲基来关闭它，”Müller解释说。“不幸的是，表观遗传标记扩散到了整个基因，于是它被完全关闭。”研究表明，FMR1基因对大脑正常发育至关重要。“如果没有FMR1基因，我们会看到严重的发育迟缓，导致不同程度的智力残疾或自闭症。”

通常来说，女性受这种疾病的影响较小，因为重复区域仅仅位于两条X染色体的一条上。基因的第二个拷贝在表观遗传上没有发生改变，因此它能够补偿遗传缺陷。相比之下，男性就没有这么幸运。他们只有一条X染色体，若FMR1基因出现问题，则会完全表现出临床症状。短串联重复序列的扩增会引起30多种疾病，脆性X综合征仅仅是其中的一种。

短串联重复序列的精确定位

在这项研究中，Müller及其团队研究了来源于患者组织的干细胞的基因组。他们利用纳米孔测序技术确定重复区域的长度及其表观遗传特征，这是传统测序技术无法实现的。他们还发现，即使是同一名患者的细胞，重复区域的长度也会有很大的差异。

研究人员还利用这种方法检验了患者细胞中C9orf72基因的重复序列，这种突变往往导致额颞叶痴呆和肌萎缩性侧索硬化症（ALS）。“我们是第一个通过单个实验来绘制整个重复区域的表观遗传学状态的团队，”Müller说。

此外，与以往的表观遗传学检测方法不同，DNA分子上的感兴趣区域在物理上仍保持完全不变。“我们开发出一种独特的方法来分析单分子和分析基因组中最隐秘的区域 – 这也是我如此激动的原因，”Müller谈道。

文章的共同第一作者、马克斯•普朗克分子遗传学研究所的Bj?rn Br?ndl表示：“传统测序方法在面对高度重复的DNA序列时就存在着限制，更不用说同时检测重复序列的表观遗传性质。”这也是许多科学家青睐纳米孔测序技术的原因。

在纳米孔测序技术中，DNA被片段化，每条链穿过芯片上的众多小孔（纳米孔）中的一个。同时，带电粒子流过纳米孔并产生电流。当DNA分子穿过时，电流会根据DNA的化学性质而变化。利用这些电信号的波动，人们足以重建遗传序列和表观遗传标记。

解析基因组的暗物质

常规方法往往是测序患者的整个基因组。如今，研究团队希望这个过程更具选择性。Br?ndl利用CRISPR-Cas系统从基因组中切割下含有重复区域的片段。经过几个中间处理步骤，这些片段随后被加样到测序芯片的孔中。

生物信息学家Pay Giesselmann表示：“如果我们不通过这种方式对分子进行预分选，那么它们的信号将被基因组其余部分的噪音所淹没。”他必须专门开发出一种算法，以解释重复序列所产生的电信号：“大多数算法都失败了，因为它们无法预计重复序列的规则模式。”尽管Giesselmann开发出的程序“STRique”无法确定基因序列本身，但它可以高度精确地计算序列的重复次数。

未来的潜在应用

“利用CRISPR-Cas系统和我们的算法，我们可以仔细检查基因组的任何部分，尤其是那些利用常规方法难以检查的区域，”Müller说。“我们创造了让每一位研究人员都能探索基因组暗物质的工具。”他认为此工具在基因研究方面有巨大潜力。“有证据表明重复序列在神经系统的发育过程中会不断增长，我们希望对此进行研究。”

临床医生还设想了它在临床诊断中的应用。毕竟，重复区域参与了癌症的发展，而新方法既便宜又快速。Müller认为：“我们已经非常接近临床应用了