微生物组研究通常归结于两类问题:谁在那儿以及它们在干什么。为了回答这些问题,生物学家往往使用新一代测序。16S rRNA测序能够揭示微生物的身份,而转录本测序又能够提供线索,说明这些微生物在干什么。
不过,除了测序,研究人员也利用改造的遗传工具来研究微生物组。下面,我们就来看看他们如何利用质粒工具来开展微生物组研究。
原位改造肠道微生物
尽管人们能够通过测序来监控微生物组,但遗传改造其成员的能力还十分有限,而且许多微生物难以在其天然环境以外的地方培养。因此,哥伦比亚大学的Harris Wang实验室开发了一种原位改造肠道微生物组成员的方法,并发表在《Nature Methods》杂志上1。
他们将这种方法称为MAGIC(通过原位接合来改造肠道微生物组)。在MAGIC方法中,研究人员将大肠杆菌供体菌株引入微生物组,从而利用IncPα-family-RP4接合系统将遗传负荷导入受体。此系统可将质粒引入革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
研究人员进一步开发出一套pGT质粒,带有各种复制起点,适用于各种微生物。它们还含有RP4转移起点、可选择的标记以及所需的遗传负荷(如GFP)。因此,细胞可利用FACS进行分选,并通过抗生素选择进行分离。
他们在体外和体内测试了该系统。他们在体内实验中发现19个属的细胞通过接合系统摄取了质粒,不过在体外实验中只鉴定出7个属,这可能是因为体外条件不能很好地支持有些物种的生长。这些结果也突出了微生物组研究需要原位改造工具。
分析肠道菌群的纸片法
对于临床和诊断实验室而言,在处理大量微生物组样本时,深度测序和qPCR方法都过于昂贵和耗时。为了实现大规模的肠道微生物组研究,麻省理工学院的James Collins实验室开发出一种“纸片法”,可检测纸上的微生物和生物标志物。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上2。
这种方法的核心在于一种RNA Toehold开关,这是一种RNA发夹结构,可结合和检测几乎任何RNA序列。发夹的下游是核糖体结合位点(RBS),接着是报告基因。发夹通过隔离RBS而阻断翻译,但“trigger RNA”的结合能够暴露出RBS,让报告基因得以翻译,从而产生GFP信号。通过标准品的使用,这种方法可估算出样品中mRNA的浓度。
Collins实验室选择了10种与疾病相关的细菌,并设计出Toehold开关传感器(TSS),可对菌种特异的mRNA进行半定量检测。另外,他们还针对钙网蛋白和抑癌蛋白M等四种生物标志物开发出TSS,以分析炎症性肠病患者的粪便样本,并用RT-qPCR方法进行验证。
研究人员还证明,利用此平台可以检测艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素mRNA的表达。由于mRNA表达无法通过qPCR方法来鉴定,故他们认为这种检测毒素mRNA转录本及其他转录本的能力具有潜在价值。
研究蜂类的微生物组
对动物微生物组中存在的细菌进行改造,有望在农业和医学方面取得突破,不过对于蜂类微生物组,目前就缺乏这样的工具。德克萨斯大学奥斯汀分校的Nancy Moran和Jeffrey Barrick实验室开发出Bee Microbiome Toolkit(BTK)来研究大黄蜂和蜜蜂的微生物组3。这个工具箱含有模块化的组件,可通过Golden Gate组装技术组装在一起,从而快速检验新分离细菌的多种抗生素抗性标记、启动子、荧光报告蛋白及其他编码序列。
研究人员利用BTK来操控蜜蜂和大黄蜂肠道内固有的变形菌,在一系列变形菌中表达荧光蛋白,让人们能够观察到这些细菌如何在蜂类的肠道内定植。此外,他们还能够利用BTK来导入CRISPR组分,实现基因功能的破坏或干扰。尽管这些质粒是为蜂类设计的,但它们适合广泛的宿主,也可用来研究其他动物的微生物组。
对细胞分裂进行计数
监控肠道内微生物群体的动态,有助于研究人员了解微生物组如何应对感染、失调和抗生素治疗。为了促进这方面的研究,哈佛医学院的Pamela Silver实验室开发出一种合成标记和重新捕获策略,对细胞分裂进行计数。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上4。
这种技术称为分布式细胞分裂计数(DCDC),它是将荧光蛋白在细胞内组装成明亮的颗粒。为了实现这一点,实验室将红色荧光蛋白(RFP)与自组装蛋白(SAP)相融合,比如噬菌体衣壳蛋白。这种融合蛋白的表达受到阿拉伯糖诱导型启动子的控制。
在实验过程中,首先用阿拉伯糖诱导细胞,让SAP-RFP融合体开始表达。然后,洗涤细胞,不再产生新的颗粒。在后续细胞分裂的过程中,含有颗粒的细胞随时间的变化呈指数下降,以此确定细胞分裂的次数。这种方法可用于体内和体外研究
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