【知识分享】洗脱方式-液相色谱方法优化的阶梯

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     洗脱方式一般分为等度洗脱和梯度洗脱两种。

     等度洗脱是指实验过程中（做样过程）从头到尾只用一种流动相。梯度洗脱是指在同一个分析周期中随着时间的变化按一定程序梯度性地改变洗脱液的比例(浓度配比、成分、离子强度、溶液极性等)或pH，以期将色谱柱上不同的组分洗脱出来的方法。从而可以使一个复杂样品中性质（极性）差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

      液相“圣经”---实用高效液相色谱方法建立（第2版），作者建议在液相色谱方法开发之前先运行一个全范围的线性梯度洗脱，它会给后续采用等度洗脱还是梯度洗脱提供非常重要的信息。比如设计方法（色谱柱：ChromCore 120 C18 5μm, 4.6×250mm；流速：2 ml/min；柱温：35 ℃；流动相方法：5-100%乙腈-水，梯度时间60 min）来分析取代苯胺样品，最早流出的峰的保留时间tRa晚于2倍t0，晚流出峰tRz早于梯度结束，表明该液相色谱法适合分析该样品。下一步可以通过谱图标出的第一个峰和最后一个峰的保留时间（图中的tRa和tRz）来确定梯度还是等度洗脱更合适。如果我们设定保留时间差ΔtR = tRz-tRa，则比值ΔtR/tG可以决定等度分离是否可行,TG为跑梯度时间：当要求0.5 < k < 20，ΔtR/tG < 0.25 log [(kz/ka)max] = 0.4，即该样品的保留值范围小于梯度时间的40%时，适合等度分离，否则梯度方法更合适；当要求1 < k < 10，ΔtR/tG < 0.25 log [(kz/ka)max] = 0.25，即该样品的保留值范围小于梯度时间的25%时，适合等度分离，否则梯度方法更合适。

1. 当样品中各成分性质差异很大

2. 分析大分子样品，比如多肽、蛋白、合成聚合物等，一般采用梯度洗脱分离效果会更好，特别是用反相分离条件时。因为这些样品的等度保留往往对流动相的组成（B%）的变化非常敏感，难以将保留值控制在合理的范围内；

3. 当样品中存在强保留的干扰物时，可能会污染色谱柱或者干扰后续的分析，这时设计梯度洗脱方法可以在下一次进样前将这些晚流出的物质快速洗脱出色谱柱；因此在制备HPLC中，常常使用梯度洗脱；

4.有些样品出峰靠后的峰的峰宽较大，灵敏度偏低。当选择等度方法时，可以通过增大B%来加快出峰，从而减小峰宽来提高灵敏度。但是由于t0附近的干扰峰和极限波动，使这种方法的应用受到限制，而使用梯度方法时这些情况就可以避免；

5. 对于溶解于弱溶剂（避免出现强溶剂效应）中的稀样品，使用梯度方法可以采用大体积进样，而不会引起明显的峰展宽，这种情况下，样品在柱入口处就实现了柱上浓缩，因此可以大体积进样；等度洗脱也可以进行类似的柱上浓缩，但是由于进样过程中样品直接与洗脱能力强的流动相的混合，使样品体积过大，引起样品峰严重展宽。

    优点：流速不发生变化，压力稳定，实验结果准确、可靠；
    缺点：多组分检测或有杂质干扰情况下分离度可能会差，而且不容易优化，对于某些复杂样品分析时间长，峰形差。

    优点：

a. 多组分检测或有杂质干扰情况下提高分离能力

b. 缩短某些复杂样品的分析时间

c. 改善峰形，减少拖尾

d. 提高柱效，增加检测灵敏度

     缺点：

a. 梯度洗脱方法运行后都需要重新平衡色谱柱，耗时较长

b. 由于不同的HPLC仪器存在不同的体积滞后，所以梯度洗脱方法在不同仪器间转移时可能会出现分离结果的差异

c. 流速变化得由程序控制，有时会出错

d. 压力可能会不稳定

e. 混合时可能会产生气泡，影响基线噪声及漂移

f. 高压混合时可能会产生热量

g. 对混合器要求很高，如果混合不好，基线噪声和漂移会很大

h. 由于流动相比例发生变化，基线可能会漂移

i. 实验准确度、稳定性没有等度高

j. 故障率高于等度