AP试剂盒;植物氨肽酶(AP)ELISA试剂盒
使用目的:
适用于检测人动植物组织匀浆、细胞上清、血清、血浆、尿液或其他相关生物液体中浓度。
AP试剂盒;植物氨肽酶(AP)ELISA试剂盒检测原理:
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被抗体的微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
![图片9.png 图片9.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201912/uepic/cec23cd7-0fc2-4702-b5fb-c1f5ec08a7f4.jpg)
AP试剂盒;植物氨肽酶(AP)ELISA试剂盒规格及配置:
名称 | 96孔配置 | 48孔配置 |
微孔酶标板 | 12孔×8条 | 12孔×4条 |
标准品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 |
样本稀释液 | 6mL | 3mL |
检测抗体-HRP | 10mL | 5mL |
20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL |
底物A | 6mL | 3mL |
底物B | 6mL | 3mL |
终止液 | 6mL | 3mL |
封板膜 | 2张 | 2张 |
说明书 | 1份 | 1份 |
自封袋 | 1个 | 1个 |
自备物品:
①.酶标仪(450nm)
②.高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
③.37℃恒温箱
AP试剂盒;植物氨肽酶(AP)ELISA试剂盒样本的收集:
液体样本的收集:
1、血清:用无菌管收集,室温血液自然凝固 10-20 分钟,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2、血浆:应根据标本的要求选择 EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
3、尿液:用无菌管收集,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
4、胸腹水:用无菌管收集,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5、脑脊液:用无菌管收集,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
6、唾液:用无菌管收集,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
7、细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
8、牛奶:用无菌管收集,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
9、蜂蜜:用无菌管收集,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
10、全血:用含有抗凝剂的无菌管收集,立即轻轻摇动,来回轻轻颠倒数次,使血液和抗凝剂混匀,以防血液凝固。
固体样本的收集
1、组织标本:切割标本后,称取 1g 组织,加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清。分装一 份待检测,其余冷冻备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。对于植物组织,不好匀浆的话,就在液氮中充分研磨。
2、细胞内蛋白样本:许多待测蛋白不是分泌蛋白,而是存在于细胞内的蛋白,这个时候,要先收集细胞,洗涤干净,再破碎细胞,离心取上清。
(1)培养的细胞
A、动物细胞:用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀释细胞悬液,使细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融(如果反复冻融,破碎效果不好,就采用超声波破碎),以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
B、植物细胞:用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀释细胞悬液,使细胞浓度达到 100 万/ml 左右,置于冰盒上,用超声破碎仪,设置破碎 2s,冷却 30s 的方式,充分破碎细胞,以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
(2)组织的细胞
切割标本后,称取 1g 组织,加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),去除上清,再用 pH7.2-7.4左右的 PBS 小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。
3、细胞内蛋白样本:许多待测蛋白不是分泌蛋白,而是存在于细胞内的蛋白,这个时候,要先收集细胞,洗涤干净,再破碎细胞,离心取上清。
4、咽拭子:加入 2ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS,溶解咽拭子头部,摇匀,用镊子取出咽拭子并挤干液体,2-8℃条件离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分),仔细收集上清。分装一份待检测,其余冷冻备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。如果是测分泌蛋白,直接取上清检测,测试细胞内蛋白,要破碎细胞。
5、植物标本:取组织块(0.2g~0.5g)最少可到 5~10mg 在冰冷的 PBS 中漂洗,滤纸拭干,准确称重,放入 5ml 的匀浆管中;按重量(mg):体积(ml)=1:9 的比例加入 9 倍体积的匀浆介质于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块;匀浆的方式:手工匀浆,机器匀浆。 ① 手工匀浆:左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8 分钟),充分研碎,制成 20%的匀浆液。 ② 机器匀浆:用组织捣碎机 10000~15000 转/分 上下研磨制成 10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间 10 秒/次,间隙 30 秒,连续 3~5 次,在冰水中进行,可适当延长匀浆时间),镜检观察:取少量组织匀浆作涂片(直接涂片、染色均可以),显微镜下观察细胞是否破碎,若没有则可延长匀浆时间。将制备好的 10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机 4000 转/分左右,离心 10~15 分钟,取上清液进行测定。
AP试剂盒;植物氨肽酶(AP)ELISA试剂盒操作步骤:
①.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
②.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
③.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
④.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
⑤.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次 (也可用洗板机洗板)。
⑥.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
⑦.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
![图片11.png 图片11.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201912/uepic/3ef691c1-b7a9-4ce2-b2f7-b44b7778a094.jpg)
结果判断
绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
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