cDNA第一链合成试剂盒

cDNA第一链合成试剂盒

产品及特点本试剂盒提供合成 cDNA 第一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）高效合成 mRNA 的全长 cDNA 拷贝。

1. 使用突变的反转录酶，内源 RNase H 活性低。

2. 最长可合成 13 Kb 的 cDNA。

3. 可以使用 oligo-dT、随机引物和 RNA 专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。

4. 总 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作为模板。

5. 可用于 cDNA 文库构建、RT-PCR、探针标记等。
规格及成分 成 份 编号 十块盒包装
MMLV（含 RI） 60906A 100 uL
RT Buffer（含 dNTP） 60906B 250 uL
Oligo (dT)18 引物(0.5 ug/uL) 100814 50 uL
随机引物(0.2 ug/uL) 100409 50 uL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手册 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法 一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA

1. 按下表配制 RT 反应体系:

RNA 模板

总 RNA 100-500 ng

或 poly(A) mRNA 10-500 ng

或专一的 RNA 0.01 pg-500 ng

注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。

引物

Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL

或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL

或 RNA 模板专一性引物 15-20 pmol

注意：随机引物与 RNA 模板的比例跟 cDNA 合

成的平均长度成反比。

RNase-free 水 补水到 13 uL

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 再加入 5 uL RT Buffer（含 dNTP）。

4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保

温 5 分钟。如果使用随机引物，则改成 25℃ 5 分钟。

5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20 uL。

6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然

后再转移到 42℃保温 60 分钟）。此步为 RT 反应。

7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以

直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。

二：合成建文库用的 1st-strand cDNA

1. 按下表配制 RT 反应体系:

RNA 模板

poly(A) mRNA 1 ug

或专一的 RNA 0.5-1 ug

注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。

引物

Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL

或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL

或 RNA 模板专一性引物 100 pmol

注意：随机引物于 RNA 模板的比例跟 cDNA

合成的平均长度成反比。

RNase-free 水 补水到 13 uL

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 再加入 5 uL RT Buffer（含 dNTP）。

4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保

温 5 分钟。如果使用随机引物，则改成 25℃ 5 分钟）。

5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20uL。

6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然

后再转移到 42℃保温 60 分钟）。此步为 RT 反应。

7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于

第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。

三：用对照模板合成 cDNA(需要用同位素，需要对照的客户需要单独跟天泽基因联

系)

1. 按下表配制 RT 反应体系:

对照 RNA 模板(0.5 ug/uL) 2 uL

引物

Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL

或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL

或对照专用引物 2 uL

RNase-free 水 补水到 13 uL

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 再加入 5 uL RT Buffer（含标记 dNTP，本试剂不提供）。

4. 37℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃。

5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20uL。

6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。

7. 加 1uL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。

8. 电泳检测。合成的 cDNA 的量一般有加入 RNA 总量的 50%以上，电泳一般能出现 1.1Kb 的片段（如果使用随机引物，将出现多个小片段）。