柱式细菌RNAout

柱式细菌RNAout

产品及特点

本产品是细菌 RNAout (CAT#:51102)的柱式升级产品，用于快速从各种常见的中提取总 RNA。跟细菌 RNAout 相比 它具有下列特点:

1. 操作更加简单快速，省去了最费时的离心步骤。一般只需 30-40 分钟完成。

2. 既可用于革氏阴性细菌，也可用于革氏阳性细菌。

3. 所得 RNA 纯度更高，OD260/OD280 一般在 2.0 左右. 4. 一般不含基因 DNA 和蛋白污染。

5. 性价比高于进口同类产品，适用于各种革氏阴性细菌。

6. 可用于后续 RT-PCR、Northern Blot、芯片分析、体外翻译、polyA筛选和 RNase 保护分析等试验。
规格及成分 成 份 编 号 大纸盒包装 
柱式细菌 RNAout 溶液 A LM80103a 25 mL 柱式细菌 RNAout 溶液 B LM80103b 25 mL 溶菌酶干粉 LM80103c 30 mg 离心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL RNA 洗脱液 71207 10 mL 使用手册 80104sc 1 份

运输及保存 常温运输，收到货后，溶液 A 长期保存需要放 4℃，溶菌酶干粉长期保存需要放-20℃，有效期一年。 

自备试剂 氯仿。

使用方法 

注意：试验所用的实验室环境、耗材等均需要 RNase-free。操作步骤是针对在 1.5 mL 塑料离心管中进行的微量提取。

1. 新鲜配制溶菌酶溶液：根据样品数量用自备的 TE 缓冲液和本试剂盒提供的溶菌酶干粉配制合适体积的、浓度为 4mg/mL 的溶菌酶溶液，放冰上待用。一次革氏阳性细菌 RNA 小量提取需要 100uL 溶菌酶溶液，一次革氏阴性细菌 RNA 小量提取需要 10uL 溶菌酶溶液。未用完的溶菌酶溶液不建议保存后重复使用。

2. 在 1.5 mL 塑料离心管中离心收集 0.2-1.5 mL 新鲜细菌（细菌总数不得超过 1×10E9 个细菌）。注意:由于细菌 RNA 半衰期十分短，只有2-5 分钟，所以必须使用新鲜的、处于对数生长期的细菌才能提到高质量的 RNA。细菌必须立即使用，不能静置。

3. 吸尽液体培养基，如果是革氏阳性细菌，则加入 100uL 第 1 步制备的4mg/mL 的溶菌酶溶液，彻底重悬细菌，常温放置 5-10 分钟。如果是革氏阴性细菌，则加入 90uL TE 缓冲液和 10uL 第 1 步制备的 4mg/mL的溶菌酶溶液，彻底重悬细菌，常温放置 3-5 分钟。

4. 加入 0.3mL 溶液 A，用枪充分吹打细菌沉淀，确保细菌全部裂解，没有块状物。此时裂解物总体积是 0.4mL。

5. 加入约 0.2 倍体积的自备氯仿(10.4mL 裂解物需 0.1 mL 氯仿)，振荡器上充分振荡混均 30 秒。

6. 12000-15000 g 室温离心 3 分钟。

7. 将上清液（约 0.3mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA 污染。

8. 加入等体积（约 0.3mL）的溶液 B，充分混匀后全部上柱。

9. 12000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

10. 加 0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的 穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.3 mL 通用洗柱液重复此步一次。

11. 室温 12000-15000 g 离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响 RNA 的使用。

12. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 收集管中，加入 30-100 uLRNA 洗脱液，室温放置两分钟。

13. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。

15. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1OD260 的 RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。

16. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。