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中文名称:星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
英文名称:Astrovirus(AV)
运输:低温运输
保存:-20℃保存
有效期:一年
货期:现货
产品介绍:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),是体外酶促合成特异DNA片段的一种经典方法,由变性、退火及适温延伸组成,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点,是分子生物学实验的最基本实验技术。
如何选择星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒:RT-PCR是指将RNA 的反转录(RT)和cDNA 的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。利用逆转录酶将RNA逆转录(RT)成cDNA(Complementary DNA),再以cDNA 为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR的常见应用包括基因检测、转录物变异检测,以及克隆和测序用cDNA模板制备。
PCR反应鉴定——PCR反应条件
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
注:
a)退火温度:请参考引物的理论 Tm 值,退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。
b)延伸时间:需要根据片段的长度来确定,对于1 kb以内的DNA片段,建议延长时间为30 sec。
星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒常见问题与解决方法:
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系,或减少裂解液的用量。 |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 |
模板加入量不适合。 | 在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时,可以降模板浓度调节到低于10%的范围。 |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。 |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。 |
注意事项
1. 建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。
2. 试剂Buffer AL若低温保存,易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间,也可在37℃水浴中预热10 min,以溶解沉淀,混匀后再使用。
3. 电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。
4. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率佳。
5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
星状病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存,有效期一年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
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