Ar.A4 Electro感受态细胞

Ar.A4 Electro感受态细胞

Ar.A4 Electroporation-Competent Cell 产品说明书

产品规格 （CAT#: LM1050）
Ar.A4 Electro：                                                            50μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl )                            10μl
保存条件(保质期)：                                         -80℃（12个月）

Ar.A4 Electro感受态细胞基因型

Agrobacterium rhizogenes(kan^R  ) Ar A4 Ri(agropine  type)

Ar.A4 Electro感受态细胞产品说明

发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染

大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。Ar.A4发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广

泛的宿主范围（玉米，烟草，胡萝卜，甘草等），同时具有卡那霉素抗性。唯地生物开发的Ar.A4发根农杆菌

电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pK7WGF2质粒 (size:11876 bp)检测转化效率>10⁵ cfu/μg DNA；

经pK7WGF2-ZH质粒（size:40 kd）检测转化效率可达5×10³ cfu/μg DNA。

Ar.A4 Electro感受态细胞常规操作方法

1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充

分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟

充分降温。

2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，最好用

试剂盒抽提，双蒸水溶解；转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀

，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用

电转仪推荐的protocol操作），将电击杯从冰中拿出，吸水纸吸干外表面水份，快速放入电转槽中，启动电击，

电击完成快速插入冰中，加入1 ml无抗生素的TY，并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上，倒置放

于28℃培养箱培养2-3天

● 农杆菌相关抗生素配方：

常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

● TY配方（1L）：

Tryptone                5g

Yeast extract          3g

补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌

配制1M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌

每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。

若配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。

Ar.A4 Electro感受态细胞注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率

急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2. 电转感受态细胞中不可混入气泡，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的

菌落，应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。

4.  Ar.A4具有卡那霉素抗性，不可用于具有卡那霉素抗性质粒的转化。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。