BY4741感受态细胞

BY4741感受态细胞

BY4741 Chemically Competent Cell 产品说明书

产品规格 （CAT#: LM1060）

BY4741 Competent Cell:                                      100μl/支             保存： -80℃（3个月）

pYES2 (control vector, 10 ng/μl)                               10μl              保存：-80℃（12个月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12个月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12个月）

BY4741感受态细胞基因型

MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52

BY4741感受态细胞产品说明

BY4741菌株来源于酿酒酵母原始菌株——S288C，是实验室的常用菌株，为配子MATa型，广泛应用于钠，钾离子平衡；细胞抗盐；各种金属离子的吸收；重金属毒性；各种糖类，碳源对真核生物细胞生长的影响；过氧化物，超氧化物的吸收与运输的研究中。BY4741酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸 、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2质粒转化进入BY4741细胞内。质粒pYES2的筛选标志为URA，可用SD-URA板板进行筛选。唯地生物生产的BY4741感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒检测转化效率>10³ cfu/μg DNA。

BY4741感受态细胞操作方法

1. 取100 μl冰上融化的BY4741感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒1-3 μg，Carrier DNA (96℃水浴3 min，快速冰浴

3 min，重复一次) 10 μl，PEG/LiAc 500 μl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将感受态移到42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH₂O 400 μl 重悬，离心 30s弃上清。

4. ddH₂O 50 μl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 若使用pYES2质粒表达蛋白，需在培养基中加入2%的半乳糖（筛选培养基中不用加半乳糖；当需要目的蛋白表达时，需加入半乳糖代替葡萄糖作为碳源），以诱导目的基因的表达。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

5. 酵母为真核生物，不易长期保存，随感受态在-80℃保存时间的延长，转化效率会不断下降，建议保存时间不超过90天。

6. BY4741酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

7. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。