F-DH5α感受态细胞

F-DH5α感受态细胞

F-DH5α快速转化感受态细胞产品说明书

产品规格 （CAT#: LM1001）

F-DH5α：                                                   100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存条件(保质期)：                            -80℃（6个月）

F-DH5α感受态细胞基因型

F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(r_k^-,m_k⁺) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA 

F-DH5α感受态细胞产品说明

DH5α菌株是实验室最常用的感受态细胞。 缺失核酸内切酶 (endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型 (recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA 的稳定性；lacZΔM15的存在使DH5α可用于蓝、白斑筛选。

F-DH5α感受态细胞经特殊工艺制作，无需42℃热激，37℃孵育步骤，只需冰浴，10min内完成转化、涂板操作，pUC19质粒检测转化效率可达1~5×10 ⁸cfu/μg DNA。

 快速转化操作方法 (10min)

1. 提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

2. F-DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀,，冰中静置5分钟。

3. 用200 μl枪将感受态细胞-DNA混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，涂均匀，表面无水渍。

4. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少15h。

 快速热激转化操作方法 (25min,可提高转化效率)

1. F-DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,，冰中静置5分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟 (晃动会降低转化效率)。加入700 μl 不含抗生素的LB，37℃，200 rpm 复苏10分钟，涂板 (均匀，表面无水渍)。

3. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少15h。

F-DH5α感受态细胞注意事项

1. F-DH5α快速转化感受态细胞也可进行热激操作，对于>7 kb质粒的构建，为了提高转化效率可按以下步骤操作：F-DH5α感受态细胞从-80℃拿出，插入冰中，5分钟后，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置20分钟。42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中静置2分钟。加入700 μl LB，37℃，200 rpm复苏30分钟，涂板。

2. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入目的DNA时应轻柔操作。

3. F-DH5α快速转化感受态细胞涂氨苄/羧苄青霉素抗性平板时效率较高，若涂卡那霉素或其他抗生素平板，转化效率下降(因无孵育步骤，卡那霉素等对菌体毒性较大)。若要提高卡那霉素或其他抗性质粒的转化效率，可按热激转化操作，增加孵育步骤。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。