Stable Electro感受态细胞

Stable Electro感受态细胞

Stable Electroporation-Competent Cell产品说明书

产品规格（CAT#: LM1080）

Stable Electroporation-Competent Cell                 50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                10μl

保存条件(保质期)：                                         -80℃（6个月）

Stable Electro感受态细胞基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC)

Stable Electro感受态细胞产品说明

Stable电击感受态细胞只能用于电击转化，不可用于热激转化。Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。基因组含有重组酶recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1突变，避免了提取质粒过程中核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性。唯地生物开发的Stsble电击感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种具有末端重复序列的复杂DNA文库构建，经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>1×10¹⁰ cfu/μg DNA。

Stable Electro感受态细胞操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的Stable电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

    A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；

    B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)或ddH2O重悬，             DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。

3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

5. 2分钟后取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1 ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。倾斜放入摇床，30℃，250 rpm复苏90分钟。

      当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，则                         需37℃，225 rpm复苏60分钟

6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的LB平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于30℃培养箱过夜培养20-24小时。

注意事项

1. 对不稳定DNA片段的克隆或逆转录病毒/慢病毒载体的构建，涂板后平板应在30℃培养，以减少发生错误重组的概率。2. 制备高纯度病毒质粒时，应使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温保存后提取质粒。

3. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中10分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。混入目的DNA时应轻柔操作。

4. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

5. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

6. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

7. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

8. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

9. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

10. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

11. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。