BJ5183感受态细胞
BJ5183 Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格(CAT#: DL1075)
BJ5183: 100μl/支
pUC19 (control vector,10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期): -80℃(6个月)
BJ5183感受态细胞基因型
endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)
产品说明
BJ5183是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株,是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC双重突变,赋予BJ5183细胞较强的重组能力,有利于转入的目的基因与腺病毒质粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3/E4 deleted)]}的重组。endA1(缺失核酸内切酶)的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。StrR 赋予BJ5183菌株链霉素抗性。BJ5183感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA。
BJ5183感受态细胞操作方法
1. BJ5183感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的质粒(含有目标基因并线性化)和腺病毒质粒,并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
BJ5183感受态细胞注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间
存放会降低转化效率。
2. 混入目的DNA时应轻柔操作。
3. BJ5183菌株的质粒产量不高。腺病毒构建成功后,可选择在其他大肠杆菌菌株中扩繁,纯化质粒。
4. BJ5183感受态细胞对温度敏感,应储存在-80℃超低温冰箱,避免温度波动,温度波动会降低感受态转化效率。
![QQ图片20181128145241.png QQ图片20181128145241.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/79713afa-fd28-4b72-bcba-ac7e8d5df20d.jpg)
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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