实验小白入门|PCR基础知识介绍

本期讲堂，作为PCR基础知识的开篇，我们先来了解一下最基础的PCR原理、操作流程、成功的要素这三部分内容。

PCR作为一项基础的分子生物学技术，由于操作简便、省时、灵敏度高等优点，在生物科学研究领域应用广泛：从克隆、基因编辑、下一代测序（NGS）到基因分型、法医侦查、病原鉴定等，都离不开PCR技术的助力分析。

首先我们先来了解一下PCR的原理，

一、PCR原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

理论上，每一轮循环可使DNA的数量增加一倍，经过n次循环后，反应混合物中所含的DNA数量为2n。

二、PCR操作流程

①DNA制备

从样品中提取PCR反应所需的DNA模板、直接PCR无需此步。
推荐商品化的核酸提取试剂，节省时间、简化操作流程、减少DNA提取量的损失。

②PCR反应

包括反应液的制备和PCR反应两个步骤。

反应液的制备
普通PCR的反应体系由DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板这五大要素组成。商品化的DNA聚合酶，一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应缓冲液，因此仅需我们准备引物及DNA模板，并且根据说明书推荐量进行反应液配制即可。

PCR反应
选择适宜的梯度PCR仪，根据扩增片段大小及酶制品说明书推荐来进行PCR反应条件设置。

③电泳、染色

PCR反应后，通过凝胶电泳确认扩增片段大小。

三、PCR成功的要素

DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板是构成PCR反应组分的五大要素，这是影响PCR成功的内因；PCR反应条件的设置，是影响PCR成功的外因。

酶 

之前提到过商品化的DNA聚合酶，一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应buffer，因此酶的选择至关重要，我们需要兼顾保真性、扩增特异性、扩增速度、扩增效率、模板复杂程度及扩增片段长度等，选择最适PCR酶。

引物

引物是PCR特异性反应的关键，PCR反应引物的浓度一般在0.1μm~1μm之间，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

模板

模板的完整性要好，模板降解会导致PCR扩增无产物。同时模板纯度也尽量越纯越好，纯度不好，可用PCI（苯酚氯仿抽提）及EtOH（乙醇沉淀 ）精制。

模板添加量可以参考酶制品说明书及下表的建议模板量进行添加，加量过多会导致非特异性扩增产物增加：

反应条件

PCR反应条件可以参考酶制品说明书及下表进行设置：

四、常见问题

1.假阴性

不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

2.阴性

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

3.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

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