基于iTRAQ和磁珠分离技术的类风湿关节炎湿热瘀阻证血清蛋白质组学研究

基于iTRAQ和磁珠分离技术的类风湿关节炎湿热瘀阻证血清蛋白质组学研究

研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以关节炎为主要表现的自身免疫性疾病,是导致残疾的重要原因之一。在祖国医学中RA属于“痹病”、“白虎历节”、“尪痹”的范畴,中医药对于RA的治疗有着疗效好、副作用低、个性化强、花费少的特点。湿热瘀阻证是RA尤其是活动期RA的重要证型,清热活血法是治疗RA湿热瘀阻证的主要治疗方法。临床的准确辨证是中医临床疗效的保证,目前,在中医的临床诊治中,辨证的多样化、主观化影响了临床用药的准确性。证候的规范化、客观化研究一直是中医学与现代医学结合研究的重要方面,中医学的“证”是人体病理状态的反应,“证”的整体性、模糊性、动态性、差异性、复杂性的特点,使得中医的“证”通过现代实验室检查所得到的单一微观理化指标不能整体反应“证”的表达特点,并缺乏足够的特异性。如何将中医理论客观量化一直是中医学与现代医学结合的一个巨大障碍,也是中医学进入新的发展时期以来所面临的一个瓶颈。以蛋白质组学为代表的系统生物学技术的出现使现代医学由还原论思维走向了整体思维,也使得中医的理念有了数理化的可能。蛋白质组学的整体性、复杂性、动态性、信息化的特点和中医学的理念不谋而合。蛋白质组学技术在中医证候学的研究中得到了广泛的应用,并取得了一系列的成果,指导了中医的临床诊治。然而在RA的研究中,尚无课题组以蛋白质组学的技术手段对RA湿热瘀阻证进行深入探讨。本课题采用病证结合的方法,将从探讨湿热瘀阻证的微观物质基础的角度出发,分别应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)结合超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-QE-MS)以及磁珠分离多肽技术结合基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS),寻找RA湿热瘀阻证血清差异蛋白,研究差异蛋白应用于RA证候诊断的价值,为进一步的证候学研究提供参考依据。研究一基于iTRAQ技术的类风湿关节炎湿热瘀阻证差异蛋白质组学分析研究目的:筛选RA湿热瘀阻证差异蛋白,揭示其微观物质基础,为进一步研究疾病发病机制及临床辨治提供依据。研究方法:本研究共纳入病例90例,分为RA湿热瘀阻证、RA非湿热瘀阻证、健康志愿者三组,每组各30例,其中男性4例、女性26例;通过SPSS v 19.0软件分析,采用H检验的方法统计得出各组间年龄无统计学差异,具有可比性。各组病例样本血清分别进行混合后,采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)进行定量标记,再以超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-QE-MS)进行分析检测。所得质谱数据选用Thermo Proteome Discoverer 2.1软件进行蛋白的检索和鉴定,当筛选蛋白组间比较差异倍数≥1.5(上调)或者≤0.7(下调),且经统计检验q-value<0.05时,定义为组间差异蛋白。生物信息学分析采用DAVID数据库(DAVID Bioinformatics Resources)对所鉴定的差异蛋白进行GO(Gene ontology)注释、功能注释聚类分析及KEGG Pathway通路分析,采用STRING数据库对差异蛋白进行相互作用分析。研究结果:经与健康对照组比较分析,共得出RA湿热瘀阻证差异蛋白72个,其中上调蛋白25个,下调蛋白47个,RA非湿热瘀阻证中得出上调差异蛋白1个,下调蛋白11个,湿热瘀阻证蛋白表达与非湿热瘀阻证蛋白表达存在明显差异。通过对湿热瘀阻证上调蛋白GO注释分析,其相关生物功能主要涉及急性期反应、Fc-gamma片段受体信号通路介导的吞噬作用、受体介导的内吞作用、补体激活、血小板脱粒、补体激活经典途径、血小板聚集、蛋白质水解、凝血及纤维蛋白凝块形成9个方面,差异蛋白位置分布涉及10个方面,其中胞外区、细胞外间隙、胞外外泌体占到了 78%,主要参与了抗原结合、丝氨酸肽链内切酶激活两个生物学过程。湿热瘀阻证下调蛋白相关生物学功能主要涉及26个方面包括补体激活的经典途径、补体激活、受体介导的内吞作用、免疫反应的调节、蛋白质水解、免疫反应等方面;差异蛋白所处细胞位置主要分布于胞外区、胞外外泌体、细胞外间隙、血液微粒、细胞膜等12个方面;所参与生物过程包括抗原结合、丝氨酸肽链内切酶激活、胆固醇结合、脂类结合等10个方面。在RA湿热瘀阻证上调差异蛋白中有6个蛋白表达与急性期炎症相关,分别为血清淀粉样蛋白A1(SAA1)、αl-酸性糖蛋白(AGP1)、触珠蛋白(HP)、α2-酸性糖蛋白(AGP2)、血清淀粉样蛋白A4(SAA4)及C反应蛋白(CRP);有IGHG3、IGHV1-69、IGHV4-34、IGHL7-43 4个免疫球蛋白片断表达与补体激活相关;有3个蛋白表达与血小板聚集、凝血、纤维蛋白凝块形成相关,分别为肌动蛋白β(ACTB)、纤维蛋白原α链(FGA)、纤维蛋白原γ链(FGG);另外FGA、FGG、AGP1、AGP2还与血小板脱粒相关。这提示RA湿热瘀阻证与急性炎症反应及凝血功能的异常密切相关,在对湿热瘀阻证上调蛋白相关Pathway通路的分析中存在Coagulation and complement cascades、Bacterial invasion of epithelial cells、Shigellosis、Platelet activation通路的激活。在湿热瘀阻证差异蛋白表达中17个蛋白有文献支持与RA存在直接相关性参与了 RA的发病。研究结论:通过湿热瘀阻证、非湿热瘀阻证与健康对照组的对照,从整体上得出了一系列差异蛋白的表达,在湿热瘀阻证差异蛋白表达中急性期炎性蛋白、凝血相关蛋白占重要地位,体现出RA湿热瘀阻证与疾病的活动性存在重要联系,与现代医家对于湿热证的研究具有一定的相似性,也为清热活血法治疗RA提供了一定的参考依据。以iTRAQ技术筛选差异蛋白的表达,对于研究RA湿热瘀阻证的客观物质基础有一定的价值,我们不能简单的将湿热证等同于炎性蛋白的表达,但通过这一系列的差异蛋白,使我们在接下来的研究中有了更多的研究方向去探索RA及湿热瘀阻证的发病机制,在治疗方面,进一步研究中医方药干预对于疾病中蛋白表达的影响,无论对于研究疾病的发病机制还是对于辨证用药的精确化都具有重要意义。研究二基于磁珠分离技术的类风湿关节炎及湿热瘀阻证血清多肽质谱分类模型的建立及验证研究目的:建立RA血清多肽分类模型及RA湿热瘀阻证血清多肽分类模型,为临床诊断提供依据。研究方法:本研究共纳入RA患者40例,其中湿热瘀阻证20例、非湿热瘀阻证20例,每组男性2例、女性18例,纳入健康对照组20例,其中男性2例、女性18例。通过SPSS v 19.0软件分析,采用H检验的方法统计得出各组间年龄无统计学差异,具有可比性。分别以RA患者40例与健康对照组20例进行比较建立RA血清多肽分类模型,以RA湿热瘀阻证患者20例与非湿热瘀阻证患者20例比较建立RA湿热瘀阻证分类模型。研究采用磁珠分离法提取样本血清多肽,所得样本多肽经点靶干燥后,以基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)进行检测,质谱数据以 Clinprotools 3.0 软件(CPT3.0)进行分析建立疾病分类模型。再次纳入RA患者20例,包括湿热瘀阻证10例、非湿热瘀阻证10例,健康对照组10例,其中以RA患者20例与健康对照组10例进行RA血清多肽分类模型;以湿热瘀阻证10例与非湿热瘀阻证10例进行RA湿热瘀阻证血清多肽分类模型验证。样本血清处理方法同上,将数据调入CPT软件计算模型的准确率。研究结果:RA血清多肽分类模型通过GA-5算法所建立分类模型为最优分类模型,由五个多肽组成,其m/z分别为2601.05、4967.6、6639.43、1866.29、8144.63该模型中m/z4967.6、6639.43、8144.63多肽峰经统计学分析组间差异P<0.000001,其中m/z4967.6、6639.43的多肽峰表达强度与RA呈正相关,m/z8144.63的多肽峰表达强度则与RA呈负相关。该模型识别率为94.74%,交叉验证率为81.96%,盲法验证准确率为97.5%。m/z4967.6、6639.43的多肽峰具有作为RA诊断血清敏感蛋白的潜在可能。RA湿热瘀阻证血清多肽分类模型由GA-7算法所建立分类模型为最优分类模型,由五个多肽组成,其m/z分别为5740.43、4251.35、2863.03、1607.22、4531.5,其中 m/z5740.43 的多肽峰经统计学分析组间差异P<0.000001,且表达强度与RA湿热瘀阻证呈正相关,该模型识别率为97.50%,交叉验证率为80.05%,盲法验证准确率为90%,m/z 5740.43的多肽峰具有作为RA湿热瘀阻证血清敏感蛋白的潜在可能。研究结论:本研究所建立的诊断指纹图谱模型准确率较高,对RA及RA湿热瘀阻证的临床诊断具有一定的参考价值,为进一步筛选其生物学标志物并研究疾病的发病机制打下基础。