WB/ELISA/IHC三大实验，ELISA(酶联免疫吸附试验)篇（一）

沪震生物

2021/08/06 10:08

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做实验最怕什么?早起抢仪器？熬夜写报告？......都不是。这些是家常便饭，最怕的是辛辛苦苦做了很久的实验，才发现做出来的效果不满意，这个时候我们就需要学习一套标准的实验流程了。

IHC(免疫组化)、ELISA(酶联免疫吸附试验)、WB (免疫印迹)，是免疫学三大常用工具，分别用于定位，定性和定量。

ELISA(酶联免疫吸附试验)

ELISA简介

利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。

实验步骤

ELISA(酶联免疫吸附试验)

注意事项

1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18 C~25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。

2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。

3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔问污染，导致假阴性或假阳性。

4、要保证加液量一致我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。

5、显色液量不可过多加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。

6、试剂的影响因数:应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。

ELISA(酶联免疫吸附试验)

常见问题
操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环

问题一:景或阴性对照值偏高

可能原因	建议
阴性对照孔被阳性对照或样品污染	洗涤时，勿将洗液溢出孔外
抗体非特异性结合	封闭液不适合，更换封闭液
酶结合物过浓	请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
孵育温度过高	检查孵育箱的温度是否正确、稳定
底物在使用前曝光	应保存在暗处，避光
读板前停留时间过长	加终止液后3分钟内读数

问题二:标准曲线较差

可能原因	建议
标准瓶溶液配置有误	确认是否进行正确稀释
标准品复溶不当	开盖前进行离心；检查复溶是否存在不溶物
标准品已降解	按推荐方式保存和处理标准品
曲线的标度不合适	尝试使用不同标度绘制曲线，例如双对数、5参数拟合
移液器加样误差	正确使用经过校准的移液器

问题三:标准曲标准曲线良好,但样本无检测信号

可能原因	建议
样本中无检测物或检测物含量极低	设置内参，重新实验
样本中其他物质影响/掩盖检测	作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释,检测回收率
样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值	适当倍数稀释样本,检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内

问题四:显色缓慢

可能原因	建议
样本未置于室温	实验开始前，将样本平衡至室温
酶结合物活性减弱	检测稀释度
酶活性收到抑制如叠氮钠	避免实验不当的防腐剂
显色温度不适当	按说明书操作