小鼠核因子-κB亚基p65亲和肽(NF-κB p65)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

小鼠核因子-κB亚基p65亲和肽(NF-κB p65)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围： 96T

16pg/ml-650pg/ml

使用目的：

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中核因子-κB 亚基p65 亲和肽(NF-

κB p65)含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠核因子-κB 亚基p65 亲和肽(NF-κB p65)

水平。用纯化的小鼠核因子-κB 亚基p65 亲和肽(NF-κB p65)抗体包被微孔板，制成固相抗

体，往包被单抗的微孔中依次加入核因子-κB 亚基p65 亲和肽(NF-κB p65)，再与HRP 标

记的核因子-κB 亚基p65 亲和肽(NF-κB p65)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，

经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下

转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的核因子-κB 亚基p65 亲和肽(NF-κB p65)呈正相

关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠核因子-

κB 亚基p65 亲和肽(NF-κB p65)浓度。

试剂盒组成

1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶

2 酶标试剂6ml×1 瓶8 标准品（1200pg/ml） 0.5ml×1 瓶

3 酶标包被板12 孔×8 条9 标准品稀释液1.5ml×1 瓶

4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书1 份

5 显色剂A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 张

6 显色剂B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 个

标本要求

1. 血清：

室温血液自然凝固10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保

存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2. 血浆：

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心20

分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。

尿液：

用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀

形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4.细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。

5.培养细胞:

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100 万/ml 左右。

通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左

右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6.组织标本:

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化

后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀

浆器将标本匀浆化。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检

测，其余冷冻备用。

7.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进

行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

8.不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀

释。

600pg/ml 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液

300pg/ml 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液

150pg/ml 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液

75pg/ml 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液

37.5pg/ml 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、

待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，

然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽

量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。

4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此

重复5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10 分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止

液后15 分钟以内进行。

操作程序总结：

计算

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的

OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，

即为样品的实际浓度。