有关物质测定hplc方法的建立一、开始之前必须明白：1、有关物质来源的两种途径：1）合成过程中的中间体和副产物；2）储存过程中产生的降解产物；2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；3、样品中可能含有的中间体；4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；二、准备工作1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。4）分析结构。。。。。。5）与同类产品进行比较；三、开工（以紫外检测为例）1、流动相的选择（采用粗品进行选择）1）、有文献，按文献进行优化。不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。2）、没有文献。。。。。。a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。要是有pda检测器就不需要这一步了。b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。2、最低检测限3、系统适应性试验重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告4、考察中间体及副产物和样品的分离度。同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。5、考察降解产物和样品的分离情况。这个一般是通过破坏性试验来考察。常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。现在对三批样品进行测定，通过归一化来观察，应该可以知道杂质的大概情况，根据这个可以定出相应采用自身对照法测定的杂质限量。一般情况下还应定出最大的单一杂质限量。如果样品中的杂质可以很好得到纯品，那么你就可以采用外标法来准确定量。7、杂质的限量必须根据你的样品本身性质来定。有关物质检查，包括对产品中残留合成原料、中间体、副产物及可能的降解产物的检查，是控制药品质量的重要指标，目的是检查药品中所含的上述杂质是否符合安全性的要求,同时也是药品稳定性评价中需重点考察的项目。有关物质检查常用的方法之一是HPLC主成分自身对照法（紫外检测器），即将HPLC色谱图中杂质峰面积与主成分自身对照液峰面积进行比较，以确定杂质限度是否合格。采用此方法时确定的检测波长是否合理直接影响到方法的可行性，因此检测波长的选择是方法学研究的重要内容。在审评中发现一些申报单位在采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质时直接或间接地以主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有：1．直接将主药的最大吸收波长选作检测波长。2．简单地套用含量测定的色谱条件。在HPLC法进行含量测定时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长。若套用含量测定的色谱条件，实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检测波长。3．以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外扫描，将扫描图谱中最大吸收波长确定为有关物质的检测波长。因破坏性试验后溶液中存在尚未破坏的主药、降解产物、辅料等，此溶液的紫外吸收为各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解产物的紫外吸收特性。由于未破坏主药所占比例较大，故破坏性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质，其前提之一是需检查的杂质与主成分在确定的检测波长下应有相近的紫外吸收（响应值接近），选择检测波长时需对产品中可能存在的杂质（合成原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。已知杂质的紫外吸收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察，未知杂质（如未知降解产物等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况，根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的色谱条件一致。另外，HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制。对于具有明确归属的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。对于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定，并制定严格的限度。

新药有关物质检查中的一些问题作为一个新药，对其纯度的检查是保证安全有效的重要指标之一，而纯度检查的内容，根据各个药物的性质和特点有些不同，但基本上均要涉及各自的“有关物质”检查研究。关于有关物质的检查，在国际上已早为“人用药品注册技术规范协调会(ICH)”所关注，国内在新药的有关文件中也提出了供参阅的一些具体要求，并逐渐引起研制新药者的重视。　　由于一个新药从合成原料药到制备有关的制剂，再经贮藏、运输、使用，要经历一段较为复杂和漫长的过程，在此期间，每一过程都有可能产生有关的物质，如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程中，可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。为保证药物的安全有效，同时也要考虑到生产实际情况，因此，国内外对药物的研究，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，能危害人体健康的、无效的或能影响药物稳定性的有关物质则必须严格控制。　　因有关物质的量微小，故检测方法至关重要，必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的方法。目前，首选的是色谱法，可根据新药的具体品种及其有关物质的性质采用TLC，HPLC及GC等，有的还应采用其他有关的色谱或波谱法。对于一、二类新药更应重视，必要时可采用HPLC/UV二极管阵列、HPLC/MS或GC/MS等联机技术，对有关物质进行定性定量分析。　　现将有关物质检查中常见到的一些问题讨论如下。1　未提供研究方法的专属性　　申报资料中常见到有关物质检查的结论是“未检出有关物质”，甚至在稳定性各影响因素考察中，样品颜色已明显变化，但其结果仍是“未检出降解产物”，因而提供的TLC图上只有1个斑点，HPLC图上只有1个主药的峰。对于此类情况，应考虑方法的专属性，如采用的是HPLC，则在方法研究中可按中国药典附录的要求，进行系统适用性试验，考察方法的专属性，具体方法有：①如有关物质为已知的某中间体、副产物或降解产物，则可在原料药中加入该杂质适量进行试验，以证明能达到分离；②如有关物质为未知，可用含有杂质的粗品进行试验，以证明能达到分离；③将精制品经强光、高温、高湿、氧化剂或酸碱等分别处理，使样品光解、分解、氧化或水解后进行试验，以证明能分离出杂质。经上述方法试验能分离出杂质，即证明采用的方法具有一定的专属性。2　未提供研究方法的灵敏度　　申报资料中，有的把试验的最低浓度作为灵敏度，甚至有的只有文字叙述而无任何数据和图谱，而未提供详细方法学研究资料和图谱来证明该最低浓度为最低检出量。因此，提供的灵敏度缺乏试验依据，不能反映所采用方法的真实检出灵敏度。对此，研究者在研究的方法具有专属性后，应考虑方法的灵敏度。如采用HPLC分析时，一般使最低检出量相当于基线噪音的3倍峰高时注入的样品量；如采用TLC分析时，应将样品配制成一系列的不同浓度，分别点样、展开、显色，以确定灵敏度和最低检出量。3　未提供定性和定量的依据　　在申报资料中，除极少数用已知杂质作对照，对样品中有关物质进行定性、定量外，多数强调了制备杂质对照品的困难。因此，对有关物质的定性和定量是用主成分自身对照法或面积归一化法，但因未提供所检测的杂质在设置的检出波长处的响应因子，而不同杂质的的响应因子有可能不同，且差别较大，至使虽有定性和定量结果，但可靠性较差。因此，有关物质定性、定量的最佳方法是采用已知对照品的方法，使所提供的定性和定量有充分依据。4　未提供有关物质的来源及其性质　　申报新药中的有关物质，绝大多数为未知，即使其有关物质含量大于2%或一类创新药，也常把在HPLC主峰以外的各杂质峰统归为未知的杂质，而未研究其杂质的来源、性质及其确切的含量。为保证新药应有的纯度，特别是一类新药，对有关物质检查应严格要求，对其主要杂质要确证化学结构，对主要杂质和其他杂质要分别定出限量。5　色谱图记录时间太短或进样量过小　　在资料中，有不少HPLC图谱不符合要求，表现在主峰的保留时间记录刚完毕，即停止记录，致使一些比主成分峰保留时间大的有关物质不能检出或进样量过小，杂质检不出。由于有的药物与其有关物质分子结构的极性相差较大，因此，在HPLC分析中，有关物质的保留时间可能在主成分峰之后出现，故记录时间应比主成分峰的保留时间延长2～3倍，并应考虑样品配制浓度或进样量致使主成分峰为一矩形峰，以确保样品中的有关物质能全部检出。6　提供的色谱图不合要求　　资料中常见提供的色谱图失真，例如TLC分析提供的是手工绘制的正圆形示意图，或虽是图谱的照片，但无样品点样点，无溶剂前沿，斑点未标示Rf值，样品无批号或文字说明等；HPLC分析中亦有用手工描绘图谱的，有的原图缩得过小以至图上数据模糊不清，或提供的图谱无样品批号，无保留时间，无文字说明，或各峰积分值与列表数据不相吻合等；在稳定性考察降解产物中，上述情况更为严重，致使无法审查。因此，研究者应认真参考新药审批的有关技术指导原则进行试验，提供符合要求的色谱图。7　资料前后缺乏相关性　　在有关物质检查研究中，有的用HPLC进行了较深入的方法学研究，以已知中间体或杂质作对照，证明方法较好，专属性较强，但在制订质量标准研究中的图谱却未出现相同的杂峰，而是其他杂质峰，致使样品研究中的有关物质与制订标准中的有关物质不相关，且在资料中对此无说明。对此情况，应进一步深入研究，弄清是产品工艺不稳定带入的其他有关物质，还是产品本身不稳定的降解产物或残留有机溶剂所致，使研究的结果与制订标准的结果一致。8　未说明有关物质的个数及其总量　　资料除极少数研究了有关物质的个数和总量，并放入质量标准外，大多数对有关物质的数和量未做精密研究，对有关物质只是笼统的订为不得大于百分之多少，这就难以保证产品的有关物质是否稳定在规定的限度范围内。因此，在研究并确定了有关物质数和量的基础上，应对若干批工艺稳定后的产品进行分析，积累数据，对有关物质订出个数，并对主要有关物质、未知及总的有关物质分别订出限量，以保证产品质量。9　对制剂不检查有关物质的问题　　申报资料中常有提出因原料药进行了有关物质检查，并已放入质量标准中，因此，对制剂不再进行有关物质研究。关于原料药已有有关物质检查，制剂是否还要检查有关物质的问题，ICH对原料药和制剂已分别制订了杂质的定义、分类、测定方法和要求，国内新药审批的有关规定中，对制剂也有要求。首先，对制剂在筛选处方时，应考虑辅料与主药能否配伍，是否影响稳定性，有无干扰质量检测；在制备过程中和贮藏期间是否会使主药降解、聚合或转晶等。由于制剂过程较复杂，影响因素较多，因此，对制剂一般应以原料药确立的有关物质检查方法，对其有关物质进行检查研究。如原料药较稳定，制剂经考察研究亦较稳定者，可考虑该制剂不必再检查有关物质；但有些原料药稳定的药物，经加工制成制剂后，有关物质有增加；或有的原料药本身稳定性较差，对其制剂则均应检查有关物质，并订出限量。　　综上所述，有关物质检查中出现众多问题的原因主要有二：一是对有关物质检查的目的和意义认识不足；二是对有关物质检查的知识技术学习和掌握不够。　　由于目前我国大多数新药是仿制药，而仿制药不能单从与被仿制的原料药化学物质一致，制剂剂型和规格相同即可，应考虑原料药由于合成工艺、反应条件或精制方法等的不尽相同，而使终产品所带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等可能有所不同，制剂则往往由于处方中所用辅料品种不同，而可能影响其安全性和有效性。因此，要认真对待有关物质的研究，严格控制毒性较大的有关物质。　　申报新药的单位务必将这部分工作研究完善，以确保新药的质量，为新药在临床研究、生产上市和临床使用上的安全有效提供可靠保证。

elisa（双抗体夹心法）检测hbsag以已知抗体(抗hbs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗hbs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】hbsag试剂盒，本试剂盒含：1、包被抗-hbs反应条1瓶2、酶结合物1瓶3、hbsag阳性对照1瓶4、hbsag阴性对照1瓶5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释1瓶6、显色剂(tmb)a1瓶7、显色剂(tmb)b1瓶8、终止液1瓶【方法】1、加入待测标本每孔0.05ml，并设hbsag阳性对照2孔，hbsag阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。3、显色剂:先加显色剂a每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂b每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。【结果】比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。样品od值/阴性对照平均od值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。备注：阴性对照平均od值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际od值计算。阳性对照od值≥0.8，实验结果有效。【注意事项】1、试剂盒置2℃～8℃保存。2、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。3、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。4、待测标本不可用nan3防腐。5、不同批号试剂请勿通用。6、结果判断须在10分钟内完成。7、若浓缩洗涤液出现结晶时，请置37℃至溶解。

elisa的原理、类型及操作步骤elisa的原理elisa的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。elisa方法类型和操作步骤elisa可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。  （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的elisa提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人igg抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测igm抗体 血清中针对某些抗原的特异性igm常和特异性igg同时存在，后者会干扰igm抗体的测定。因此测定igm抗本多用捕获法，先将所有血清igm（包括异性igm和非特异性igm）固定在固相上，在去除igg后再测定特异性igm。操作步骤如下： （1）将抗人igm抗体连接在固相载体上，形成固相抗人igm。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的igm抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性igm结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性igm抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的elisa

细胞培养基本参数和基础知识解答1.如何选用培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。2.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。5.为什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。6.如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。7.如何消除组织培养的污染？当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6)重复步骤4。7)在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。9.Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测 激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。13.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。14.如何检测内毒素(热源)水平？LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。16. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-（2x0.310）＝6.7817. 室温下(25℃)配制的17.Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。18. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。19. High Five细胞有任何其它名称吗？High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。21.High Five细胞用多大的密度冻存？3.0x10E6 cells/ml22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。23.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1)去除培养基。2) 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。4) 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）6) 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

细胞培养之“一”：细胞培养基之系统学习（配方、制备、选择等）此帖初定结构：一，培养基的分类二，常用培养基配方、缓冲液及添加剂参考 常用培养基配方 - 丁香园论坛 PS:任十七参考如何选择合适的培养基 - 丁香园论坛 PS：zichao819三，常用培养基的制备、灭菌与消毒参考 常用培养基的制备、灭菌与消毒 - 丁香园论坛 PS:friend520四，常用培养基及基本特性参考 细胞培养-常用培养基及基本特性 - 丁香园论坛五，培养基的选择六，细胞培养与培养基培养基与PH值培养基与污染

 尊敬的客户朋友; 　　2017年端午佳节在即，沪震实业提前预祝全体沪震家人及广大客户朋友节日快乐!为了便于广大客户顺利办理业务，现根据国务院办公厅通知精神及公司的实际情况，现将“端午节”期间我司放假安排通知如下： 　　一、放假时间： 2017年5月28日至30日放假调休，共3天。5月27日(星期六)上班。如有业务咨询情况，请与我司客服专员联系手机：13916550749 　　二、放假期间我司暂无发货安排，如需备货请提前与我司业务员沟通，由此给您带来的不便敬请原谅! 　　                                                                特此通知                                                          上海沪震实业有限公司　　                                                            2017年5月26日

抗酸染色液染色原理及作用抗酸染色法acid－fast staining method 1882年由埃利希（F．Ehrlich）首创并经F．Ehrlich）齐尔（Ziehl）改进而创造出的细菌染色法。其中最具代表性的为对结核菌的齐尔-尼尔森（Ziehl－Neelsen）染色法和齐尔-加贝特（Ziehl－Gabbet）染色法。用石炭酸复红染色后，用盐酸乙醇分色，再用美蓝进行对比染色，即不再脱色而呈现石炭酸复红的红色。抗酸染色的原理：分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。抗酸染色的染液配制：1、石炭酸复红碱性复红酒精饱和溶液 10mL5%石炭酸 90mL2、3%盐酸酒精浓盐酸 3mL95%酒精 97mL3、吕氏美兰液美兰酒精饱和液 30mL氢氧化钾（1:10000） 100mL染色结果：抗酸菌被染成红色，为抗酸阳性；其它细菌染成蓝色，为抗酸阴性。背景细胞及杂质也被染成蓝色。注意事项：1.染色程度可通过改变染色时间或染色温度做适当调整。2.每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发。3.石炭酸对皮肤、粘膜有强列刺激性和腐蚀性，使用时请穿实验服并戴一次性手套操作。

植物RNA提取过程中所遇难点的相应对策从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。 a )*Y(W　　从文献报道上看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA， 而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失〔1〕，或形成不溶性复合物〔2〕；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来〔3〕；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解〔2〕和酶解。对于这些植物材料，用常规的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）难以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常规的方法提取芒果果实的RNA时未能成功，他们的结果分为三种情况：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能进行体外翻译。他们认为在果实成熟时各种酶的活性增强，其中也包含RNase，不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖，芒果果实细胞壁中特殊的成份，以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰RNA提取的因素〔4〕。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA时，发现RNA与某种未知化合物凝聚成不溶性的复合物，并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光吸收，从而干扰了RNA紫外吸收的测定〔5〕。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。本文根据文献综述了解决上述植物RNA提取过程中难点的相应对策。1　酚类化合物的干扰及对策 T　　许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）〔6〕和树木类植物中〔1〕富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多〔1〕。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）〔7〕。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物〔8〕。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。 cHlu yS-fF 1.1　防止酚类化合物被氧化的方法 pU$IH*\| 2 　　还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸〔9〕来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％〔10〕。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物〔7〕。 _K8])G, 　　螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去〔6〕。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用〔6〕。 \~/)UyuSH 　　Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂〔4〕。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率〔7〕。 *59AzmK 　　牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性〔6〕。 -yR#,S　　丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA〔1〕。 s4 q_!qz 　　Guillemant等〔12〕和Ainsworth〔13〕认为低pH值（pH5.5）的提取缓冲液可以防止酚类化合物的离子化和进一步的氧化。1.2　酚类化合物的去除 uQU)zmZZ3U 　　通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去〔6〕。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理〔14〕。 }#Y?Wr 2　多糖的干扰及对策 R:Q=MF　　多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性〔15〕，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中〔7〕。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起〔13〕，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。 Mqr-s9N 　　用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖〔3〕。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品〔5〕。 l 1E　　另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖〔9〕；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液〔13〕。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质〔16〕。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质〔4〕。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳〔7〕。 G>5 '8　　Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖〔15〕。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离〔10〕。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖〔14〕。 `0xoS54Vh 3　蛋白杂质的影响及对策 '%#3　　蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。 `W`*r0^Xj 　　Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质〔17〕。 yWv>g$ 4　次级代谢产物的影响及对策 'S|xat8NjL 　　从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等〔18〕综合Hughes等〔16〕的选择性沉淀法、Chirgwin〔19〕的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。 MT^#tP;I 　　由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。 P　　随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。

考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G―250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

 微生物细胞大小测定及显微镜直接计数实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺（图示）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上，此处正好与物镜放大的中间物像重迭，用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺（图示）是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10μm即0.01mm，是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和稀释平板计数法。直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼德罗夫·霍泽（petrof hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载坡片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图示），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，大方格用三线隔开，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，大方格之间用双线分开，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成（图示）。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400 mm2。盖上盖玻片后，         计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000 mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每ml菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。已知：1ml体积＝10 mm×10 mm×10 mm＝1000mm3       所以：1ml体职应含有小方格数为1000mm3/（1/4000mm3）＝4×106个小方格，即系数k＝4×106。因此：每ml菌悬液中含有细胞数＝每个小格中细胞平均数（n）×系数（k）×菌液稀释倍数（d）。六、实验材料活材料：酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）斜面菌种或培养液、枯草杆菌（bacillus subtilis）染色标本片。★为什么不选用大肠杆菌作试验菌？七、实验用品   显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片（22mm×22mm）、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸、血球计数板、吸水纸、计数器。八、实验方法（一）微生物细胞大小的测定1、目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尽与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重迭，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图示），计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。目镜测微尺每格长度 例如：目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重迭，已知镜台测微尺每小格为10μm目镜测微尺上每小格长度为 。用同样方法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在该显微镜上重复使用，当更换不同显微镜目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。刻度重合2、细胞大小的测定⑴将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10－2）。⑵取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。⑶移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格，不足一格的部分估计到小数点后一位数。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。⑷同样方法用油镜测定枯草杆菌染色标本的细胞大小。（二）微生物细胞的显微直接计数法1、视待测菌悬液浓度，加无菌水适量稀释（斜面一般稀释到10－2），以每小格的菌数可数为度。2、取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3、将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，不宜过多，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，注意不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片，勿使产生气泡。4、静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小孔径光阑并减弱光照的强度。5、计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6、对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2～3次，每次数值不应相差过大，否则应重新操作，求出每一个小格中细胞平均数（n），按公式计算出每ml(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。7、测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。 

IHC 常用试剂配方集锦：固定剂固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1、 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　　40g　　0.1mol/L磷酸缓冲液　　　　　　　　至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2、4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠　　试剂：A液：多聚甲醛　　　40g　　蒸馏水　　　　　　　　　 400ml　　B液：Na2HPO4·2H2O　　 16.88g　　蒸馏水　　　　　　　　　 300ml　　C液：NaOH　　　　　　　3.86g　　蒸馏水　　　　　　　　　 200m配制方法：A 液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3、Bouin’s 液及改良 Bouin’s 液　　试剂：饱和苦味酸　　40%甲醛　　　　　250ml　　冰醋酸　　　　　　50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4、Zamboni’s(Stefanini’s)液　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　20g　　饱和苦味酸　　　　　　　　　　 150ml　　Karasson-Schwlt’s PB　　　　　至1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5、PLP液　　PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）　　试剂：过碘酸钠　　赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：　　多聚甲醛　　蒸馏水配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后4℃冰箱保存。（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时间为6～18h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。6．Karnovsky’s液（pH7.3）　　试剂：多聚甲醛　　　30g　　25%戊二醛　　　　　80ml　　0.1mol/L PB　　　　至1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。 7、0.4% 对苯醌 （Parabenzoquinone）　　试剂：对苯醌　　　　　　　4.0g　　0．01mol/L PBS　　　　　　1　000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）　　试剂：对苯醌　　　　　　　　　　　　20g　　多聚甲醛　　　　　　　　　　　　　　15g　　25%戊二醛　　　　　　　　　　　　　40ml　　0.1mol/L二甲酸钠缓冲液　　　　　　至1000ml配制方法：先以 500ml 左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。 9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液　　试剂：0.05mol/L PB　　500ml　　0.01mol/L PBS　　　　 500ml　　Tris　　　　　　　　　约14g　　浓HCl　　　　　　　　 少许　　ECD　　　　　　　　　 10g　　25%戊二醛　　　　　　3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0。此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。 10、四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用前几天配制。　　（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。　　（2）1% OsO4-PB：　　试剂：A、2.26%　　　　NaH2PO4·2H2O　　　　4.15ml　　　       B、2.52%　　　　　　　　　　　　　　     8.5ml　　          C、5.4%　　　　　葡萄糖　　　　　　　　 5ml　　          D、OsO4　　　　　　　　　　　　　　　　0.5g配制方法：先分别配好 A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至 7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。　　（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：　　试剂：2% OsO4 水溶液　　　　　　　　　　　　10ml　　0.2mol/L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）　　　  10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。 总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。

免疫荧光的 10 种检测方法你知道吗？标记免疫技术发展最早的一种是免疫荧光，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，接下来的实验方法希望可以帮到您。 1. 细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。步骤很重要，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下， 2. 抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。 3. 合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。 4. 优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland 可提供优化过的 IHC 用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。 5. 选择正确的二抗如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。 6. 使用合适的细胞密度选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。 7. 多重染色对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。 8. 降低背景高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为 PBS+0.05%Tween。 9. 封片作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。 10. 数据分析观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。以上就是免疫荧光检测的 10 种方法，希望可以更好的服务于您的实验，为您的实验保驾护航！

ELISA为什么我的相对光单位与说明书上的不一致？◆ 由于工业上对于光单位的衡量没有统一的标准，所以相对光单位在酶标仪之间的变化非常大。相对光单位的数值应该具有可比性。◆ 使用推荐的酶标仪设置，如果使用不同的酶标仪则进行相应的等值设置。不同的设置会产生不同的信号。◆ 在读数窗口准确读数。

ELISA为了保证酶结合物和底物反应完全：为了保证酶结合物和底物反应完全：◆ 对于比色法测定：将同体积的结合物和底物溶液充分混合（对于高灵敏度的试剂盒，在加入同体积的结合物和底物一分钟之后，再加入等体积的扩增剂）。颜色若不是立即显现，则检查所加成分是否在正确的贮藏温度下保存，是否被污染，是否在有效期内。我是否需要校正波长？◆ 对于比色法测定，需要通过校正波长来减少误差。如果我没有校正波长应该怎么办？◆ 将所读波长减去原始校正波长。这个方法可以更正光学误差。我的酶标仪上没有说明上推荐的那种用来校正波长的滤光片，我可以用别的吗？◆ 可以。只要选择的波长高于推荐的校正波长即可。我的酶标仪没有说明书上推荐的波长，我可以用别的吗？◆ 推荐波长由使用的底物和反应后颜色的峰吸收度决定。说明书上一般都有相应数据，如果没有，则选择最接近的波长。不过，这种数据变化比较大。

血清、组织/切片定制服务众所周知，血清和血浆可用作实验样本，如Western Blot，ELISA实验的检测样本和对照；血细胞可用于提取RNA和DNA。组织可用于基因组学、转录组学和蛋白组学研究（如各种实验的对照和阳性样本，Western Blot，免疫组织化学和ELISA实验的样本等），提取各种蛋白及制备模板和文库。由于自行养殖实验动物不仅风险大且会花费大量的时间，针对这一现象，本公司现已开通血清、组织/切片定制服务，可提供各种正常或疾病状态以及建模动物的血清、血细胞、器官和组织，既可以采集到检测试剂质控品，又可以分离出数百种原代细胞。我们提供小鼠、大鼠、豚鼠、裸鼠、家兔、猕猴、羊、马、牛、猪、鸡、狗等动物代养及代购服务。为了方便科研人员进行动物实验，公司在提供动物饲养服务的基础上，提供实验动物代购服务。并提供相应的实验动物质量许可证（目前仅为在我公司进行代养的客户提供实验动物代购服务）。现可提供血清、血浆和血细胞的物种：Wistar大鼠、SD大鼠、C57Bl6小鼠、Balb/c小鼠、KM小鼠、长耳兔、豚鼠、裸鼠、山羊、绵羊、牛、猪、马、犬等动物。当需要进行科研实验时，可根据用户要求，新鲜采集正常动物的血清、血浆和血细胞，按照要求进行分装和保存；大型动物采用真空采血管进行无菌采集。可提供组织/切片的物种：Wistar大鼠、SD大鼠、C57Bl6小鼠、Balb/c小鼠、KM小鼠、长耳兔、豚鼠、裸鼠、山羊、绵羊、牛、猪、马、犬等动物。公司还建立了上千种人类疾病复制动物模型，可根据用户要求，选择相应的模型、获取不同的生理阶段和特定部位的组织；并提供包埋、切片、病理染色、免疫组化、免疫荧光和拍照与分析等后续服务。

内参蛋白抗体我们知道，内参蛋白是指由管家基因（house keeping gene）编码表达的一类蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在实验中检测蛋白的表达水平变化时常用它们来做参照物。这些内参蛋白常应用于Western Blot中，Western Blot不仅能证明样品中是否含有某种蛋白，还能比较不同条件、不同组织和细胞中目的蛋白的相对含量，从而衡量蛋白的表达水平。内参蛋白作为一种参照物，在其中的作用为确定样本使用量的一致性，以及校正实验过程中可能出现的操作误差，从而进一步保证实验结果的准确性。那么对于不同的蛋白，内参蛋白该如何选择呢？前面两节已经介绍了几种常见内参蛋白的选择和应用，这一节我们将系统介绍不同内参蛋白的选择及云克隆公司现有内参蛋白抗体。对于内参蛋白的选择首先是考虑分子量。一般情况下，内参蛋白和检测的目的蛋白最好相差在5kDa以上。如分子量为45kDa的检测蛋白，我们可以选择Tubulin Beta（54kDa），Lamin B1（66kDa）等，而不选择ACTa2（42kDa）或者beta-actin（45kDa）。其次对于不同的组织，应选择不同的内参。如肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白，有六种不同的亚型，包括： alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin、gamma-smooth muscle actin、beta-actin (β-non-muscle)和 gamma-non-muscle actin。其中常用作 Western Blot 内参的beta-actin在肌肉组织中分布很少，那么若检测肌肉组织中表达的蛋白，我们就需选择其他的内参，如Actin Alpha 1和Cardiac Muscle (ACTC1)。最后，提取蛋白的部位不同，选择的内参蛋白也不同。比如有时胞质、胞核分开提取而不提取总蛋白时，就要选择相应部位表达的内参蛋白。如beta-actin在胞质中高效稳定表达，理论上在细胞核不表达，那么对于胞质提取的蛋白，可以选择beta-actin作为内参。

常用抗体标记荧光染料的选择随着免疫荧光技术的不断发展，荧光染料及其标记的抗体偶联物也被广泛的应用于生物学实验中。目前，市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA);  Alexa Fluor®系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。使用最多的为Alexa Fluor®系列和CFTM系列。 一、CFTM系列染料的核心对比Alexa Fluor®系列具有以下几点优势：1、新型罗丹明核心罗丹明染料以优异的耐光性和良好的荧光量子产量著称。因此很多Alexa Fluor®染料具有罗丹明核心结构，但是，传统罗丹明的化学结构很难从长波长的荧光染料延伸至远红外区域甚至是更具挑战性的近红外区域，而且生物偶联后其水溶性并不理想。Biotium 科学家发现从绿色到近红外多色荧光的罗丹明染料的新型化学方法。该方法被有效的应用于CF染料的产品中，尤其是远红外CF染料，而且通过这种方法制备的染料不仅水溶性极佳而且耐光性极好。 2、特异性高的近红外染料近红外染料最大的特点是比可见光范围要大很多，大滴的染料常会导致染料水溶性低、染料聚合体多、荧光量子产量差等问题。为了解决这些问题，许多商用的近红外染料比如AlexaFluor®、DyLight®dyes和IRDyes®近红外染料，在制备时吸附了大量的带负电荷的磺化基团，其磺化作用可以在一定程度上会提高染料的溶解性和荧光性，但这样也带来了另一些更加严重的问题，经这种染料标记的生物耦联物的非特异性结合。Biotium的科学家用革命性的方法设计出近红外染料CF，在避免引入大量负电荷的情况下，极大的保证了染料优异的理化特性。Biotium 近红外的CF 染料以花青或罗丹明染料为核心结构，该核心结构的特殊化学修饰限制了染料的分子内位移，从而获得染料的高量子产率和更好的水溶性。因此，近红外CF染料比其他近红外染料荧光强度更高，光稳定性好。最重要的是，在免疫印迹实验上应用近红外CF染料标记蛋白质样品相对于其他商业用近红外染料制备的抗体偶联物，最大限度的提高了信噪比。 3、优异的标记效率生物偶联后的活性染料一般很容易水解，会在运输，操作及储存中带来诸多不便，最终致染料结合效率低下。像Alexa Fluor®dyes,DyLight™dyes and IRDyes®等严重的磺化作用有较强的吸湿性，恶化水解作用等问题。所有Biotium的CF染料具有相对稳定的胺活性的SE基团型，这比大部分AlexaFluor 染料的SE更耐水解。总体来说，CF染料SE产品一贯的给出更高的标记效率，提供给用户更好的使用价值。 二、选择方案：1、蓝色（350-450nm处激发）CF 350、Alexa Fluor 350、AMCA等----亮蓝和紫外光激发。CF350是类似于Alexa Fluor 350和传统荧光染料AMCA的蓝色荧光染料，CF350的荧光强度高于Alexa Fluor350、AMCA，吸附在蛋白上的荧光超过50%，水溶性更好，耐光性非常优秀亮，更容易与现有的绿色荧光基团区分。 CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405 ----近乎完美的匹配蓝色二极管激光器。 CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405与近来使用的荧光显微镜和流式细胞仪405nm;谱线的蓝色二极管激光器完美的匹配。在流式细胞仪上的分析结果显示CF 405S/ CF 405 M荧光信号强度高于Alexa Fluor 405染料1.7倍。 2、绿色（488nm处激发）CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488、Cy2等----针对488nm 氩离子激光器的绿色荧光染料。以上染料其标记的抗体蛋白适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪，流式细胞仪的FL1通道检测，或者可用于荧光显微镜技术。CF 488A最低限度的带电量降低了与抗体耦联物的非特异性结合，在红色通道溢出少于Alexa Fluor 488，耐光性好、水溶性好和pH 不敏感，良好的稳定性和活性染料的标记率。Alexa Fluor 488在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4~10）；FITC激发波长488nm，最大发射波长525nm，缺点：荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 3、橙红色（543-555nm处激发）CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550, Cy 3, DyLight 549, Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色荧光染料；CF ™543 荧光条带明亮，耐光，水溶性好，确保了CF 543染料与抗体的耦联物保持优异的水溶性，为该波段最亮的橙色荧光染料。例如：同等的标记程度下，CF 543标记的羊抗鼠IgG抗体的亮度高于用Alexa Fluor 546 标记的2~10倍。CF 555、Alexa Fluor 555、Tetramethylrhodamine (TAMRA) 等匹配Cy3滤光片的橙色荧光染料。 4、红色（568-594nm处激发）CF 568、Alexa Fluor® 568, ATTO 565, Rhodamine Red等568nm处红色荧光染料。CF 568染料耐光性最好；高效水溶性；比Alexa Fluor 568 标记的抗体亮度更亮。CF 594、Alexa Fluor® 594, ATTO™ 594, DyLight™ 594, Texas Red 等最亮红色荧光染料。CF594由于其高量子产量和优异的水溶性而比AlexaFluor594 明亮2~4倍。同时CF594 对光极其稳定，使它能被理想地应用于诸如共聚焦显微镜和单分子显像条件苛刻的应用中去。 5、远红外（620-660nm处激发）CF 620R、LightCycler Red 640等620nm处。CF ™ 620R是以红色荧光染料罗若丹（rhodamine）为基础的远红外的荧光染料，该染料有高荧光亮度和极度的耐光性。它的吸收和发射光谱为617 和639nm，该染料能被用于荧光能量共振转移中高能量的接收者，或者在激发和发射窗口能和该染料的光谱特性匹配的条件下，被应用于多色检测中的最高荧光量采集。染料的卓越的水溶性有利于生物耦合在水介质中，更好的保持耦联物的生物特异性结合。CF 633、Alexa Fluor 633, Alexa Fluor  647, Cy 5, DyLight 633, DyLight649等633/635nm 激光线的最佳染料荧光染料。CF 633染料的优点：当被633 nm 氦氖激光或635 nm 红色二极管激光激发时，产生最亮的抗体耦联物，光稳定性远高于AlexaFluor 647，高效的水溶性。CF 640、Alexa Fluor 647, ATTO 647N, Cy5, DyLight649等远红外荧光染料。CF640R 的优点：以红色染料罗丹明（rhodamine）为基础，吸收和发射峰类似Cy5、Alexa Fluor647；但以罗丹明（rhodamine）为基础的红色染料CF 640R它最大的优点就是对光稳定性，Cy5 和 Alexa Fluor 647以花青素为基础，因此有着和花青素一样的特点即耐光性较差。极好的亮度和耐光性使CF ™ 640R 被理想的用于共聚焦显微镜和单分子成像等条件苛刻的检测中。 CF 647、Alexa Fluor 647, ATTO 647N, DyLight649等远红外荧光染料。以花青素为基础的远红外荧光染料CF 647 比Cy 5、Alexa Fluor 647 明亮。 CF 660、Alexa Fluor® 660, Allophycocyanin (APC)等介于远红外近红外之间的荧光染料。 6、近红外（680-790nm处激发）CF 680R/ 680、Alexa Fluor 680, Cy 5.5, IR Dye 680等近红外荧光染料。CF680 是高水溶性的以花青素为基础的染料，分子量大约为3000。该染料标记抗体极佳，发出最亮的荧光和在免疫染色光谱相似的染料中产生最高的信噪比。CF 680R 分子量约为900，更适合标记核酸或者相对小的生物分子。CF680R 是新型的以罗丹明（rhodamine）为基础的高荧光亮度, 极度耐光性染料，这使它可被理想地用于共聚焦显微镜，单分子成像等条件要求苛刻的应用中。CF 750、CF™770 and CF™790等近红外荧光染料。CF750、CF770、CF790是领域内真正具有突破性的长波长的新型染料代表。其他近红外染由于受到染料聚集和稳定性差等因素的影响而导致荧光亮度有限。基于Biotium科学家研制的新型分子工程技术，近红外CF 染料克服了这些问题。即使在633 nm 被激发，CF750 也会比APC-AlexaFluor 750拥有足够的亮度来在流式细胞仪检测中带来更好的信噪比，而且不存在串联染料的低稳定性等问题。另外，近红外CF 染料高度水溶性，没有会增加抗体耦联物非特异性结合的过剩的负电荷，也代表了该产品的优秀性能。

多克隆抗体制备流程抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体 ，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体 ， 本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤 多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。  具体实验步骤如下：1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.  预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1  注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3  小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。 3.效价检测 3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。3.8每孔加入50ul的终止液（2N H2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。  抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。抗体的纯化   4.抗体的亲和---亲和柱的制备  4.1 称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。4.2  将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml  2mmol／L的盐酸洗介质3次。4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中  4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。4.6 加入15m l  1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。4.7 用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上 h.4.8抗原固相化完成，可用于纯化。4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。 5.抗血清的纯化和保存   5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体5.7用10倍体积PBS平衡柱子  5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。 在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。

2017清明节放假通知　　尊敬的合作伙伴、用户朋友们：　　您们好!首先预祝各位清明节快乐!　　根据国务院办公厅关于2017年节假日安排的通知，并结合我司实际情况，现将我司2017年清明节放假安排公布如下：　　2017年4月2日至4月4日放假，共3天;2017年4月5日(星期三)正常上班。　　温馨提示：放假期间，我公司不提供接收订单及发货服务，由此给您带来的不便，敬请谅解!　　                                                    上海沪震实业有限公司　　                                                       2017年4月1日

购买ELISA试剂盒需要注意哪些? 第一次采购ELISA试剂盒，需求留意哪些方面？给出的回答是：现在市场上的供给的ELISA试剂盒质量参差不齐，如何去挑选适宜自个的试剂盒就显得格外首要。详细有以下几点可供参考：一、试剂盒功能1，特异性，ELISA试剂盒的特异性与试剂盒的要害组分，抗体对有关，若抗体对中之一为多抗，另一个有必要为单抗，主张运用双单抗。2，灵敏度 灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的才能，用户可根据自个样本中待检目标的量挑选适宜的试剂盒，假如待检目标量很低，通常的试剂盒不能满足要求，可挑选高敏的ELISA试剂盒。3，重复性 科学试验讲究重复性，通常ELISA试剂盒，其板内和板间变异系数应当控制在15%以内。4，简便性 试剂盒在确保高质量数据的情况下，试验时刻越短，操作越便当，越简单遭到用户期待！这也无妨作为挑选试剂盒的一个目标。二、经济性     进口分装试剂盒由于省去不少物流和报关费用，与国外原装进口试剂对比报价上有对比大的优惠，并且能供给对比灵敏的包装标准，格外是48T等小包装，现在很多客户由于对品牌的信赖度疑问，首要仍是挑选国外原装进口，但是国内进口分装对比老练的公司仍然是一个十分好的挑选。三、美誉度     一个品牌不但要有知名度，更首要的是美誉度。通过行业查询公司以及网络，有关宣扬材料等能够找到美誉度高的ELISA试剂盒供给商，这个反映的不仅是商品质量的疑问，对供给商的售前售后服务也是一个十分严厉的检验。

elisa试剂盒步骤核心分析 要确保ELISA试剂盒实验效果的必备请求有高品质的试剂盒、杰出的仪器、精确的操作，这三大点做好以后基本上就没什么问题了。其间，还有一些留意事项和要点请求需求把握。第四季度正在进行中，今日带您来看冬天热门：elisa试剂盒过程中心剖析。就拿洗刷来说。这过程有着决定性的效果，分有浸泡式、流水冲刷式两种，ELISA顶用的蒸馏水或去离子水，包含用于洗刷的，应为新鲜的和高质量的本公司请求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。一、保温    在树立ELISA办法作反响动力学研讨时，实验标明，两次抗原抗体反响一般在37℃经1-2小时，商品的生成可达高峰。为避免蒸腾，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反响板不宜叠放，以确保各板的温度都能敏捷平衡。应留意温育的温度和时刻应按规则力求精确。ELISA试剂盒因为公司的试剂盒温育是在空气浴中完结，选用水浴会形成值偏高或花板。别的温育中还有边际效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判别结果，将质控放在非边际位置。二、基因工程抗原与组成肽抗原的差异    基因工程抗原是抗原基因在质粒载体华夏核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与组成肽比较，分子量大。组成肽选用化学办法制备，因为技术的限制，组成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而使用基因工程制备的抗原，分子量更大。    以上即是ELISA试剂盒过程的中心剖析，感谢您的阅览与支撑，如需了解有关商品的其它信息(包含基本信息、技术资料、解决方案)，可以随时联络我司业务员。

ELISA的类型     ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：　　（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原　　或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情　　况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

ELISA的原理     ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的　　抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的　　活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反　　应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入　　酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检　　物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与　　标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化　　效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

怎么确保ELISA产品质量与运用质量关于试验室试剂来说，商品的质量是朋友们十分重视的一个重要问题，这是影响试验结果的一大要素。商品质量来源于出产厂家，试验的质量即是与操作者有很大的关系了，那么咱们要如何确保ELISA商品质量与运用质量呢？ELISA试剂盒确诊试剂阅历了从组成肽向基因工程抗原的过渡。因为历史的因素，大家通常以反响本底的好坏来衡量ELISA反响试剂盒，因而有些厂家为了坚持较好的本底选用了单片段基因工程抗原及组成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。    商品的质料与出产是质量的底子，ELISA试剂盒在商品质量方面得到了绝对优质的确保以后试验作用天然好，您在运用试验的过程中再加上上海酶联专业的技术指导，您还愁做不出美丽的试验？我公司署理RD品牌试剂盒，ELISA试剂盒商品质量优势表如今：1. 洁净的出产环境及科学的出产控制规程，确保了每个种类不一样批次商品质量的稳定性。2. 质料：我公司选用世界最著名的试剂盒出产商的抗体作为质料。咱们的其它辅料除一些盐外，其余生物活性质料均为原装进口。与国内其它出产商比较，检查抗体和HRP酶我公司商品中供给直接的稀释液，直接加样，免除了客户自己从高浓度向低浓度稀释；底物有些，我公司试剂盒商品中装备进口单组分TMB，免除客户用双组分时用前的混合步骤。我公司供给的样本稀释液可有用消除血清中某些成份的影响，准确度更高。而且选用国内精度最好的包被机，板内差错和板间差错在5%以内。温馨小提示：如果您购买了试剂盒以后没时间做试验，我公司能够组织专业的技术人员为您进行免费代检查。      ELISA试剂盒确保试验质量，您需注意：合理组织检查量，以免反响板过多形成洗板等候时间长。显色剂尽量在临用前配制，坚持不期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不必。加样时坚持显色剂不外流;A、B液应防止触摸金属器械。加停止液时应防止发生气泡。加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

ELISA试剂盒实验练习操作心得ELISA试剂盒为了非常好的为客户效劳, 我司对出售部职工进行了简单的ELISA试剂盒试验训练，并进行可详细的步骤操作，期望以此能更快更及时的与客户进行有用交流，为客户效劳。作为出售人员，触摸实际操作这一块，是挑战，也是学习与前进。通过这个时机，出售人员愈加深入的理解了科学与试验的谨慎。一起表示会将这种谨慎的情绪愈加发扬光大，尽力为客户效劳。通过一天的试验操作，出售人员都以为学习了不少专业知识，也总结了一些心得与注意事项：1. 预备进程。试剂操作预备的不妥很也许影响酶联免疫吸附测定ELISA成果。在试验室，假如对试剂预备不太注意，在试验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而疏忽了这种做法有也许影响后面温育时刻不行的疑问影响后面的操作。因而，在ELISA测定中试剂的预备最为要害的是，在试验开端前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20min以上后，以使试剂盒       在运用前与室温平衡，再进行测定。2. ELISA试剂盒当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。3. 洗刷进程非常重要，不充分的洗刷易形成假阳性。4. 一次加样时刻控制在5分钟内，如标本数量多，引荐运用排枪加样。5. 请每次测定的一起做规范曲线，做复孔。6. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定。7. 在配制规范品、检查溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混杂。8. 底物请避光保留。9、控制好每一步的操作时刻。10. ELISA试剂盒不要用其它生产厂家的试剂更换试剂盒中的试剂。

ELISA试剂盒的五大代测方法ELISA试剂盒试验中常会遇到这些疑问：    1. 温育条件纷歧致，技术建议：恒温箱温育较水浴显色深，OD值高出0.1-0.15，均选用恒温箱。如用水浴水温应控制在37℃。    2. 样品数量纷歧，加样时刻长短纷歧。当重复某相同品时，加样时刻尽可能与首次接近。    考虑到有些客户没有试验设备，我公司还能够供给代测效劳，只需付试剂盒的费用，代测是免费的哦！间接法 ：此测定方法与直接法类似，纷歧样在于一级抗体没有酶符号，改用酶符号的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。    双抗体夹心法 ：被检查的抗原包被在两个抗体之间，其间一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。ELISA试剂盒另一个则是检查抗体，此抗体可用酶符号后直接测定抗原的量；或不符号，再透过酶符号的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体有必要当心挑选，才可防止交互反应或竞赛相同的抗原联络部位。        竞赛法：样本里的抗原（安闲抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一同竞赛相同的抗体，当样品里的安闲抗原越多，就能够联络越多的抗体，而固定抗原就只能联络到较少的抗体，反之亦然。经清洗进程，洗去安闲抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只需固定抗原的对照组效果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。ELISA试剂盒直接法 ：将抗原直接固定在固相载体上，参加酶符号的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。

ELISA试剂盒检测技术在各方面的应用ELISA试剂盒细胞因子检查如白介素、挑选素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等等ELISA试剂盒心肌梗塞检查如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反响蛋白等等内分泌检查ELISA试剂盒如甲状腺，胰腺，性激素，孕酮，睾酮，生长激素，生长抑素，内皮素，皮质醇，骨钙素，催乳素，促肾上腺皮质激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羟色胺，17-羟孕酮等等ELISA试剂盒肝纤维化检查如纤维连接蛋白，通明质酸，胶原，基质金属蛋白酶按捺因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等等本身免疫检查ELISA试剂盒如甲状腺，盐水可获取核抗原抗体(ENA)，抗核抗体，DNA，抗心磷脂抗体，类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，Sm，大疱性类疱疮，蛋白酶，短膜虫法，肝-肾，肝-肾-胃，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗核抗体，抗核糖体蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O，抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体，等等ELISA试剂盒优生优育检查如早早孕，新生儿TSH，胎膜早破检查，抗子宫内膜抗体，抗心磷脂抗体，抗通明带抗体，抗卵细胞通明带抗体，抗卵巢抗体，抗抗体，巨细胞病毒，弓形体，风疹病毒，临产猜测，单核白细胞增多症，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，便隐血试纸，HCG等等

首次利用CRISPR培育出单核苷酸编辑转基因小鼠囊性纤维化、镰刀形红细胞贫血症、亨廷顿舞蹈病和苯丙酮尿症都是由单个核苷酸发生突变导致的疾病。作为DNA的构成单元，核苷酸分为四种不同的类型：腺嘌呤（Adenine, A）、胞嘧啶（cytosine, C）、鸟嘌呤（guanine, G）和胸腺嘧啶（thymine, T）。人类DNA由大约30亿个核苷酸组成。在某些情形下，仅一个核苷酸发生变化就能够导致严重的疾病。科学家们希望利用一个正确的核苷酸替换这个不正确的核苷酸，从而治愈这些疾病。然而，利用当前的基因编辑工具CRISPR-Cas9替换单个核苷酸存在技术上的挑战。如今，在一项新的研究中，来自韩国基础科学研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因组工程中心的研究人员利用这种流行的基因编辑技术CRISPR-Cas9的一种变体版本培育出单核苷酸编辑小鼠。相关研究结果于2017年2月27日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos”。作为近年来出现的一种卓有成效的基因编辑技术，CRISPR-Cas9的作用机制是在DNA双链中的一个发生突变的核苷酸附近进行切割，切除一小段DNA序列。相反，IBS研究人员采用Cas9蛋白的一种变体：切口酶Cas9（nickase Cas9, nCas9），同时让Cas9与一种被称作胞苷脱氨酶（cytidine deaminase, CD）的蛋白融合在一起。CRISPR-nCas9-CD能够将一种核苷酸替换另一种核苷酸，因而也被称作碱基编辑器（Base Editor）。2016年，美国哈佛大学的David Liu团队和日本神户大学的Keiji Nishda团队已开发出这种类型的脱氨酶，并且在体外培养的细胞系中进行过测试。IBS研究人员通过将这种技术用于小鼠胚胎中，进一步推动它的发展。IBS研究人员在小鼠体内测试了CRISPR-nCas9-CD是否能够校正Dmd基因（编码抗肌萎缩蛋白）或Tyr基因（编码酪氨酸酶）中的单个核苷酸。他们在这两种基因中都取得成功：由Dmd基因发生单核苷酸突变的胚胎发育而成的小鼠在它们的肌肉中不产生抗肌萎缩蛋白（dystrophin），而Tyr基因发生单核苷酸突变的小鼠表现出白化性状。抗肌萎缩蛋白确实与肌肉肌营养不良疾病相关联，而酪氨酸酶控制黑色素产生。再者，这两种单核苷酸替换仅出现靶位点上。这是比较重要的，这是因为它表明仅靶位点上的突变核苷酸遭受替换。论文通信作者、IBS基因组工程中心主任KIM Jin-Soo陈述道，“我们首次证实可编程的脱氨酶在小鼠胚胎中高效地诱导核苷酸替换，从而培育出具有疾病表型的突变小鼠。这是一项概念验证实验。下一个目标是在动物中校正基因缺陷。最终，这种技术可能允许在人类胚胎中进行基因校正。”

脂肪酸合成代谢研究取得新进展近日，中科院大连化物所生物质高效转化研究团队赵宗保研究员与瑞典查尔姆斯理工大学（Chalmers University of Technology）Jens Nielsen教授、德国法兰克福大学（Goethe University Frankfurt）Martin Grininger教授合作在真菌脂肪酸合酶改造研究中取得新进展：成功构建了杂合脂肪酸合酶，并扩展了脂肪酸合成机器的产物谱，相关研究成果发表在英国《自然-化学生物学》杂志上。脂肪酸是组成细胞的重要分子，也是生物燃料和油脂化工的基础原料，主要由脂肪酸合酶（FAS）合成。真菌FAS为多功能酶，含7个不同催化结构域和1个酰基载体蛋白（ACP）结构域，分子量约270万道尔顿，可组装成笼状超分子结构，被认为很难进行操控。研究人员通过对产油酵母多组学研究发现，圆红冬孢酵母携带一种含2个结构域的FAS，冷冻电镜分析表明，该FAS也组装成典型笼状结构。研究中发现只需其中一个ACP即可行使脂肪酸合成功能。因此，研究人员利用硫酯酶替换其中一个ACP，所得杂合FAS主要产生中/短链长的脂肪酸；类似地，改造另外两种真菌FAS，也得到了预期结果；更重要的是，利用该策略引入甲基酮合酶所得杂合FAS能合成长链甲基酮。研究结果表明，真菌FAS中可嵌入异源结构域笼，得到具有新功能的脂肪酸合成机器，为利用脂肪酸合成途径进行生物制造提供新机遇。 上述研究得到国家自然科学基金委的资助，并得到我所生物分离分析新材料与新技术研究组（1809组）和公共分析测试组（DNL2001）的协助。