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溶菌酶的制备原理和操作方法

2023/07/19 10:48

阅读:111

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应用领域:
生物产业
发布时间:
2023/07/19
检测样品:
其他
检测项目:
溶菌酶
浏览次数:
111
下载次数:
参考标准:
/

方案摘要:

溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内,鸡蛋(含量约为2%~4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源,目前,溶菌酶仍属于紧销的生化物质,广泛应用于医学临床,具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。

产品配置单:

所需试剂

进口溶菌酶(来源于鸡蛋清)12650-88-3

型号: 250mg

产地:

品牌: 远慕

¥1

参考报价

人溶菌酶(LZM)酶联免疫试剂盒,人ELISA试剂盒

型号: 96T/48T

产地:

品牌: 远慕

¥1

参考报价

方案详情:

实验概要
本实验介绍了溶菌酶(lysozyme)的制备及其性质测定的原理和操作方法。

实验原理
溶菌酶(lysozyme)是由弗莱明在1922年发现的,它是一种有效的抗菌剂,全称为   1,4-β-N-溶菌酶,又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35,是一种糖苷水解酶,能催化水解粘多糖的N-   乙酰氨基葡萄糖(NAG)与N-乙酰胞壁酸(NAM)间的β-1,4糖苷键,相对分子质量14700Da,由129氨基酸残基构成,由于其中含有较多碱性氨基酸残基,所以其等电点高达10.8左右,最适温度为50度,最适PH为6~7左右。在280nm的消光系数为  13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2 ,Fe2 ,Zn2 (10-5~10-3M)以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制,能被Mg2 ,Ca2 (10-5~10-3M)、NaCl所激活。

溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内,鸡蛋(含量约为2%~4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源,目前,溶菌酶仍属于紧销的生化物质,广泛应用于医学临床,具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。

溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性,在中性条件下溶菌酶带正电荷,因此在分离制备时,先后采用等电点法,D152型树脂柱层析法除杂蛋白,再经Sephadex  G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE 鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量,分光光度法测定酶活性。

主要试剂
1. 鸡蛋清(鲜鸡蛋)
2. 底物微球菌粉
3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂
4. 固体氯化钠(NaCl)
5. 固体硫酸铵(NH4)2SO4
6. 固体磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)
7. 固体磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)
8. 固体磷酸钠(Na3PO4)
9. 乙醇;蒸馏水;甲醇;考马斯亮蓝;三氯/醋酸;丙酮
10. 溶菌酶标准品;Sephadex G50
11. N-乙酰葡萄糖胺;硫酸铜;硫酸亚铁;硫酸锌;氯化镁;氯化钙;氢氧/化钠;盐酸
12. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂;蛋白含量测定(福林法)试剂
13.聚乙二醇-20000、两性电解质

主要设备
1. 循环水式真空泵 HSB-IⅡ
2. 蛋白紫外检测仪
3. 记录仪
4. 紫外分光光度计
5. 梯度混合器(500mL);
6. 721型光分光光度计
7. 冰冻离心机
8. 冰箱
9. 透析袋
10. 酸度计
11. 部分收集器
12. 恒流泵
13. 圆盘电泳装置
14. 恒温水浴锅
15. 层析柱(2.6×1250px)(1.6×750px)
16. 布氏漏斗(500mL)
17. 吸滤瓶 (1000mL)
18. G-3砂芯漏斗(500mL)

实验步骤
1. 蛋清的制备
将4~5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞,使蛋清流出(鸡蛋清pH 值不得小于8),轻轻搅拌5分钟,使鸡蛋清的稠度均匀,用两层纱布过滤除去脐带块,量体积约为100ml.

2. 鸡蛋清粗分离
按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水,均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右,用脱脂棉过滤收滤液。

3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析
1) D152树脂处理:将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物,滤出,用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4~8小时,抽滤干NaOH,  用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂,直到全部转变成氢型,抽滤干HCl ,  用蒸馏水洗致近pH5.5,保持过夜,如果pH之不低于5.0,抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型,pH值不小于6.5。吸干溶液,加pH6.5  0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。

2)  装柱:取直径40px,长度为750px的层析柱,自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液,关闭层柱出口,待树脂沉降后,放出过量的溶液,再加入一些树脂,至树脂沉积至15~500px高度即可。于柱子顶部继续加入  pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂,使流出液pH为6.5为止,关闭柱子出口,保持液面高出树脂表面25px左右。

3) 上柱吸附:将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部,打开出口使其缓慢流入柱内,流速为1ml/min。

4) 洗脱:用柱平衡液洗脱杂蛋白,在收集洗脱液的过程中,逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况,当基线开始走平后,改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5,浓度为0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液洗脱,收集洗脱液。

5) 聚乙二醇浓缩:将上述洗脱液合并装入透析袋内,置容器中,外面覆以聚乙二醇,容器加盖,酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时,用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇,小心取出浓缩液。

6) 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。

4. Sephadex G50分子筛柱层析
1) 装柱:先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇,用 6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex  G50数分钟,再抽滤,反复多次直至无醇味为此。(如果Sephadex G50是新的,则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/L  NaCl溶液,充分搅拌,超声除去气泡,装入玻璃层析柱(1.6×1250px),柱床1125px。
2) 上样。
3) 洗脱:样品流完后,先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品,连接恒流泵,使流速为0.5mL /min,用部分收集器收集,每10分钟一管。
4) 聚乙二醇浓缩:合并活性峰溶液,用聚乙二醇浓缩到5mL左右时,用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇,小心取出浓缩液。
5) 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液,量取体积。

5. 溶菌酶活力测定
1) 酶液配制:准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液,再将酶液稀释成50?g/ml。
2) 底物配制:取干菌粉5mg加上述缓冲液少许,在乳钵中(或匀浆器中)研磨2分钟,倾出,稀释到15~25ml,此时在光电比色上的吸光度最好在0.5~0.7 范围内。
3) 活力测定:先将酶和底物分别放入25度恒温水浴预热10分钟,吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中,在450nm波长读出吸光度,此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL(相当于10?g酶),每隔30s读1次吸光度,到90s时共计下四个读数。
活力单位的定义是:在25℃,pH6.2,波长为450nm时,每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质

6. 蛋白质含量的测定
采用Folin-酚试剂法进行测定。

7. 纯度检测
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

8. 理化和酶学性质的测定
可根据酶纯化和活力测定的结果,运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。

9. 实验结果
步骤项目 体积(ml)总蛋白量(mg)总活力单位比活力(单位/mg)回收率(%)
1.制备蛋清
2.溶菌酶分离
3.D152树脂柱层析
4. Sephadex G50层析

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