实验室细胞株的构建问题解答！

　　1、什么是瞬时转染和稳定转染？

　　瞬时转染：外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。

　　稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。

　　2、设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？

　　稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：

　　1)，外源插入片段的拷贝数。多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。

　　2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。

　　3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。

　　4)，整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。

　　5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。

　　3、什么时候需要稳定细胞株？

　　以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：

　　1)，外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率，但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。而非分裂细胞，可以使用腺相关病毒载体转导外源基因，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。

　　2)，需要构建使用诱导表达系统，这主要是由于：

　　a)，过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素;

　　b)，目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。

　　3)，希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数，以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。

　　4)，部分细胞种类，病毒载体亦无法达到高转导效率，通过构建稳定株，达到外源片段的高效表达。

　　5)，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究。

　　6)，部分蛋白稳定性极强，瞬时RNA干扰因为作用周期短，只能抑制目的基因的表达，但无法去除已经表达的目的蛋白，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。

　　7)，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。需要构建稳定细胞株，以防止注射入动物体内后，很快外源片段表达丢失。

　　8)，细胞个体差异(同一类细胞，不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰，需要构建单克隆细胞株去除干扰。

　　9)，需要将外源片段插入基因组中，比如基因敲除，基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。

　　4、什么时候不需要构建稳定株？

　　以下实验不需要构建稳定株：

　　1)，希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。例如在正式实验之前进行的小规模预实验。

　　2)，2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的，比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用，或者观察某些细胞周期抑制，凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。

　　3)，细胞个体差异对实验结果有影响。体外培养非原代细胞，多为转化细胞系或者癌细胞，细胞个体差异大，瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。

　　5、病毒载体构建稳定细胞株有什么优势？

　　化学试剂介导的转染方法和电转，整合率低，同时整合位点不稳定，易发生再次丢失的情况，而且整合位点一般都在转录活跃区之外，所以并不是理想的稳定整合工具。

　　另外，整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度，而不是转染时的DNA的量决定，而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多，导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法，造成入核质粒载体量难以控制，这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方比，更倾向于得到串联多拷贝。以上种种因素，导致使用非病毒载体转染方法构建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。

　　逆转录病毒载体由于整合率高，是非常理想的稳定株构建工具。而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件，理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于转录活跃区段，且整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。最重要的是整合几率和所有其它化学，物理转染方法比，增加5至6个数量，使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。由于整合几率非常高，所以很容易获得混合稳定株。

　　腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大，被认为是不能整合的一类病毒载体，因此相关研究数据较少，不建议用来构建稳定株。非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低，但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19号染色体，所以从安全性和稳定性角度来说，潜力都非常巨大。由于诸多因素，研究人员仍然在对其进行改造中，包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体对应的整合位点序列。

　　6、筛选稳定细胞株的方法主要有哪些？

　　主要有三类方法：

　　1)单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。

　　其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。

　　缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含有非整合的细胞。稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中，很快会失去生长优势，最终导致失去稳定株。

　　2)96孔单克隆稀释法：此类方法同样多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株以及筛选悬浮细胞稳定株的实验。其优点在于，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。其缺点在于，工作量比较大。

　　3)逆转录病毒混合克隆制备法：此类方法适用于需要制备混合稳定株。优点在于可以在短时间内(1周)获得稳定细胞株，同时也可以随时将细胞稀释转移至新皿中获得单克隆细胞株。缺点在于需要制备逆转录病毒载体。

　　7、为什么常规转染方法筛选稳定株异常困难？

　　常规化学转染或者电转方法，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低(10-8-10-6) ，且这些转染条件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。

　　8、为什么病毒载体介导的稳定株筛选方法效率要比常规方法高？

　　逆转录病毒载体的染色体整合依赖于病毒重组酶，是一个酶催化反应，因此效率相比随机整合要高多个数量级。而且整合位点多位于转录活跃区，因此表达效率高。同时其整合非常稳定，连续传代100代以上仍然保持稳定表达。

　　9、如何选择适合的病毒包装类型进行稳定株筛选？

　　并非所有的病毒载体都适合用来进行稳定株筛选，首先需要挑选整合效率高，整合位点稳定的病毒载体。至今为止，逆转录病毒载体是最有效的可以介导基因整合的病毒载体。其次，依据具体实验要求，挑选不同整合位点倾向性的逆转录病毒载体。倾向于整合于转录起始位点附近的，容易造成下游基因的激活; 而整合于转录活跃基因内的，容易导致整合区基因的插入失活。

　　10、病毒载体介导的稳定株筛选方法可以适用于任何靶细胞吗？

　　虽然普通的逆转录病毒载体可以用来进行稳定株的构建，然而这一类病毒载体并不能高效感染非分裂细胞，因此对于这一类分化细胞，可以使用慢病毒载体进行稳定株构建。也可以使用腺相关病毒载体高效感染非分裂细胞，这一类病毒载体虽然整合率低于慢病毒载体，但其可以以染色体外形式长期(数月至数年)存在于非分裂细胞中，因此可以避免进行稳定株筛选。

　　11、为什么稳定株构建服务中不使用腺病毒载体？

　　腺病毒载体由于其整合几率极低，被普遍认为是不具备整合能力的病毒载体，所以一般不用来进行稳定株构建。

　　12、单克隆稳定株和混合克隆稳定株有什么区别？我该选择哪一类用于我的实验？

　　单克隆稳定株顾名思义来源于含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增，而混合稳定株则由多个单克隆稳定株构成的克隆群，不同的单克隆其外源片段的整合位点不一样。由于体外细胞多属于细胞系，其基因组呈现不稳定的特点，因此即使是同类细胞，不同细胞个体基因组背景都存在差异。

　　当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时，多考虑这类因素。

　　同时也是由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。混合稳定株可以通过逆转录病毒直接筛选获得，或者通过讲众多不同的单克隆稳定株混合获得。前者无论是是从质量，还是时间周期来看都更好。

　　13、怎么判别筛选的稳定株是单克隆？

　　1)，如果外源片段含有荧光标记，可以直接使用流式细胞仪检测其荧光是否均一; 如果还有其它标签，可以进行免疫荧光标记，再使用流式细胞仪观察荧光分布是否出现均一峰值。因为不同单克隆由于整合位点不一样，其表达强度也会受附近染色体结构的影响，出现差异。

　　2)，如果外源片段不含任何标签或者荧光标记，则可以使用分子生物学比如Southern Blot的方法鉴定。

　　3)，使用96孔板稀释法筛选，得到的阳性克隆一般是单克隆。因为最初如果混有非整合细胞，则含有整合外源片段的单细胞多半会失去生长优势，无法得到阳性克隆。使用单克隆环法，如果挑取的是致密，单一的克隆，那么多半也是单克隆。

　　14、如何判别筛选的稳定株是100%含有外源整合片段的细胞群？

　　通过观察所携带的荧光标记或者对外源插入片段进行免疫荧光标记可以判断稳定株是否混有非整合细胞。

　　15、为什么有的时候构建RNAi稳定株对达到高效的基因干扰效果是必须的？

　　RNA干扰效应主要是影响目的基因所表达的mRNA的稳定性或者翻译，并不影响已经存在的目的蛋白的状态。部分蛋白其稳定性异常高，即使mRNA的表达水平或者翻译受到干扰，目的蛋白仍然可以在很长一段时间内发挥功能。因此需要进行稳定株筛选，以挑取干扰效果好的细胞克隆进行实验。在一些极端情况下，甚至需要进行第2轮稳定株筛选，才能获得一个比较好的RNA Knock down细胞株。

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