经过前期对多糖的提取,去除蛋白质、色素、小分子等物质得到粗多糖,而这些粗多糖其实是由很多分子量、结构不同的多糖混合而成。为了得到纯的多糖即均一性多糖,仍需进一步对这些粗多糖进行分离纯化。
1、分步沉淀法
多糖的结构和分子量不同,其极性大小不同,在有机溶剂(如醇或酮)中的溶解度不同,根据这一原理,可以依此增加醇浓度,从而将多糖按分子量从大到小的沉淀出来。但是分级沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱层析法等进一步纯化,方可得到均一性的多糖。
2、柱层析法
要获得均一性的多糖,一般是先经过阴离子交换柱进行粗步纯化,然后再用凝胶柱进一步纯化。有些多糖也采用大孔树脂柱进行纯化。下面对这三种柱层析法进行详细介绍。
3、阴离子交换法
一般使用阴离子交换柱对真菌、藻类和高等植物的多糖进行初步分离。阴离子交换色谱常用的介质有DEAE-纤维素、DEAE-琼脂糖凝胶、DEAE-葡萄糖凝胶。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱对大杯香菇等菌类、玉米等植物、桑黄等藻类粗多糖进行分离纯化。使用DEAE-52填料进行多糖的初步分离纯化,该柱子一般直径偏大,其中以2.6cm最多,操作过程中流动相的流速也较快,流速一般在0.7-2ml/min之间,以1ml/min最多,至于柱子的长度,选择范围较广,从25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在对菌类、植物和藻类粗多糖的初步分离纯化中,在选择层析柱的直径、流速和长度的方面与DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流动相都是纯水和不同浓度的NaCl溶液。
4、凝胶色谱法
凝胶色谱法根据被分离组分尺寸大小与凝胶的孔径关系实现分离,类似于分子筛的作用。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(SephadexG)、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝胶ToyopearlHW等。多糖的进一步分离往往会选择用各种凝胶进行分离纯化。选择使用哪一种凝胶对多糖进行纯化的标准是多糖的分子量,不同种类和型号的凝胶能够分离多糖类型和分子量范围不同。凝胶柱的柱子规格常具有长而细的特点,直径以1.6cm偏多。无论什么类型的凝胶柱,流动相多为蒸馏水或者一定浓度的NaCl溶液。
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