微生物多糖的提取和纯化方法

　　经过前期对多糖的提取，去除蛋白质、色素、小分子等物质得到粗多糖，而这些粗多糖其实是由很多分子量、结构不同的多糖混合而成。为了得到纯的多糖即均一性多糖，仍需进一步对这些粗多糖进行分离纯化。

　　1、分步沉淀法

　　多糖的结构和分子量不同，其极性大小不同，在有机溶剂（如醇或酮）中的溶解度不同，根据这一原理，可以依此增加醇浓度，从而将多糖按分子量从大到小的沉淀出来。但是分级沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱层析法等进一步纯化，方可得到均一性的多糖。

　　2、柱层析法

　　要获得均一性的多糖，一般是先经过阴离子交换柱进行粗步纯化，然后再用凝胶柱进一步纯化。有些多糖也采用大孔树脂柱进行纯化。下面对这三种柱层析法进行详细介绍。

　　3、阴离子交换法

　　一般使用阴离子交换柱对真菌、藻类和高等植物的多糖进行初步分离。阴离子交换色谱常用的介质有DEAE-纤维素、DEAE-琼脂糖凝胶、DEAE-葡萄糖凝胶。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱对大杯香菇等菌类、玉米等植物、桑黄等藻类粗多糖进行分离纯化。使用DEAE-52填料进行多糖的初步分离纯化，该柱子一般直径偏大，其中以2.6cm最多，操作过程中流动相的流速也较快，流速一般在0.7-2ml/min之间，以1ml/min最多，至于柱子的长度，选择范围较广，从25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在对菌类、植物和藻类粗多糖的初步分离纯化中，在选择层析柱的直径、流速和长度的方面与DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流动相都是纯水和不同浓度的NaCl溶液。

　　4、凝胶色谱法

　　凝胶色谱法根据被分离组分尺寸大小与凝胶的孔径关系实现分离，类似于分子筛的作用。常用的凝胶有葡聚糖凝胶（SephadexG）、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝胶ToyopearlHW等。多糖的进一步分离往往会选择用各种凝胶进行分离纯化。选择使用哪一种凝胶对多糖进行纯化的标准是多糖的分子量，不同种类和型号的凝胶能够分离多糖类型和分子量范围不同。凝胶柱的柱子规格常具有长而细的特点，直径以1.6cm偏多。无论什么类型的凝胶柱，流动相多为蒸馏水或者一定浓度的NaCl溶液。