自然界中许多生物会自主分泌RNase
RNase是生物体的“保护伞”,可防止外源RNA入侵。如:生物眼泪、唾液、汗液等体液中均会分泌RNase。
环境中的RNase稳定性非常好
环境中存在的RNase主要是由微生物(细菌和真菌)所分泌,由一种微小紧凑的蛋白组成。它的结构中具有二硫键,因此具有稳定性极强的天然属性,极难灭活,热变性后也可以很快恢复构象。并且,RNase耐热、耐酸、耐碱,因此,它对众多去污方法均具有抵抗作用。
检测RNase污染的小Tips
由于RNase污染而导致实验失败,如何有效检测RNase污染源,是令实验人员头疼的事情。建议从以下几点进行排查:
检测缓冲体系、溶液:可启用全新批次的RNase-free试剂测试比对,也可检测疑似污染溶液中的RNase。
检测RNA样品:RNase进入RNA样本可在多种情况下发生,如RNA分离时(少量RNase在RNA制备过程中引入),或日常取用时(会不可避免地需要重复开关样品管并插入可能被污染的加样枪头)。
可用GAPDH、cyclophilin、或beta-actin等管家基因的探针,通过northern分析来评估poly(A)RNA样品的完整性。
从源头开始,避免RNase的污染
RNase的无处不在,使得实验过程中,难以保存RNA样本的完整性。因此,可以从源头入手,一方面要严格控制外源性RNase的污染,另一方面要最大限度地抑制内源性的RNase。
常见的污染源及其控制方法:
外源性
外源性污染源:
体液、水与缓冲液等溶液,枪头,离心管。
控制外源性RNase污染的方法:
操作人员全副武装
在实验过程中戴手套可避免源自人手的RNase污染;触摸皮肤、门把手及普通物体表面后更换手套;
使用专业仪器与试剂
RNA操作专用的移液枪;使用RNase-free的枪头和离心管;使用RNase-free的化合物与试剂;
选择实验操作环境
远离/遮蔽通风孔或开放窗口,走动较少的区域作为RNase-free区域;
其他注意的点
在RNA提取和分析期间,不要进行其他可能引起RNase污染的实验。
内源性
内源性污染源:
所有组织样品均含有内源性RNase。
抑制内源性RNase活性的方法:
样本保存
组织取样后若不直接提取RNA,要及时用液氮迅速冷冻存于-80°C环境,并尽早进行实验,这样可使RNA的降解达到最少。
添加抑制剂
在细胞裂解液中加入RNase抑制剂(RNaseinhibitor),使破碎细胞与灭活RNase同步进行,最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNase的活性。
远慕RNase抑制剂可有效避免RNase污染
RNasin能够保护mRNA的完整,有利于提高转录及翻译的效率,同时避免了使用有机化合物抑制剂可能带来的影响。
RNasin是从人胎盘或大鼠肝中提取的一种特异的酸性糖蛋白。其分子量为51kDa,等电点pH值为4.7。RNasin对RNaseA、RNaseB或RNaseC抑制能力极强,可快速特异地与它们以非共价键结合形成1:1的复合物,从而抑制RNase的活性,防止RNA被其降解。但需注意,RNasin不能抑制RNaseI、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。
目前,RNasin主要用于cDNA合成,体外转录,体外翻译,以及mRNA-protein复合物分离纯化等过程中保护RNA不被降解;还可用于特定RNase活性的鉴定等。
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