凝胶过滤层析又称凝胶排阻色谱, 分子筛色谱法,
凝胶过滤法等。利用凝胶过滤介质为固定相,根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。只依据尺寸大小分离,大组分最先被洗提出。色谱固定相是多孔性凝胶,只有直径小于孔径的组分可以进入凝胶孔道。大组分不能进入凝胶孔洞而被排阻,只能沿着凝胶粒子之间的空隙通过,因而最大的组分最先被洗提出来。小组分可进入大部分凝胶孔洞,在色谱柱中滞留时间长,会更慢被洗提出来。溶剂分子因体积最小,可进入所有凝胶孔洞,因而是最后从色谱柱中洗提出。这也是与其他色谱法最大的不同。
凝胶过滤层析常见问题解答:
1. 色谱峰对称性差
出峰上升时,上升缓慢是填料装填过紧,而拖尾是因为装填的太松,此时对称因子及柱效都很差,出现这种情况就要重现装柱。装柱前要了解填料的压缩系数(压缩因子)如Focurose FF系列的填料的压缩系数是1.15,且装完后要测柱效。
2. 柱床有裂缝或干涸等塌柱现象
检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡,必要时重现装柱。
3. 分离度差
(1) 样品和选择的填料不匹配
待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于2倍且都在选择的填料的排阻极限之外或者之内。若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于2倍时,建议尝试其它方法分离,反之选择凝胶过滤层析时,填料的选择应根据样品中目标分子的大小选择最接近(大或小都可以)目标分子排阻极限的填料进行分离。
(2) 柱床装填的效果差
通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。
(3) 上样量过大
根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量,如脱盐等样品中目标分子和杂质的分子量大于50倍时,上样量可以达到柱床体积的25%,最高不超过30%,若样品中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时,通常上样量控制在柱床体积的5%以内。
(4) 流速过快
凝胶过滤的过程流速不宜过快,降低流速在一定程度上可以提高分离度。
(5) 层析填料被污染或老化
随着填料的使用,一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化(如堵塞,非特异性吸附积累,微生物污染,破碎等),导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行CIP清洗,若清洗后还不能达到分离要求,就要更换新的填料。
(6) 样品自身的问题
样品粘度过大也会导致分离度下降,粘度大的样品在凝胶过滤时要对其进行稀释处理在凝胶过滤;
样品中目标物质和其它杂质的非特异性结合或者作用力,此时就要尝试添加一些添加剂(如2%的Triton x-100,150mM NaCl等),减少样品中各组份之间的作用力;
样品的pH,离子强度对某些填料的柱床体积会产生一些影响,也会影响分离度,必要时可以优化样品的缓冲液。
4、反压大,液流慢
凝胶过滤层析柱的装填应控制在60-100cm,太低影响分离度,太高反压增大。另外填料的清洁程度及样品的粘度,pH,离子强度也会影响液流速度。
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