全球平均有约15~35%细胞实验室发生支原体污染(65~80%严重污染),超过一半实验室有两种支原体污染;而全球各地的细胞库中,也有发现5~35%不等的支原体感染率,日本甚至高达60%。但!全球目前有在做常规支原体监控的细胞实验室却不到50%!
支原体为细菌的一类,最早在1898年由法国
E. Nocard 及 E.R.Roux 从肺疫牛只中分离出来,1956年才正式命名为支原体
(Mycoplasma);支原体大小介于细菌与病毒之间
(直径介于0.15-0.3?m),为目前发现最小最简单的原核微生物,唯1可见的胞器是核糖体,没有细胞壁,只有三层结构的细胞膜 ,所以呈高度多形性,有球形、杆形、丝状,分枝状等多种态 。
大多支原体基因组只有0.58-1.38百万碱基,这使得它的生物合成能力薄弱,必须利用本身细胞膜表面高密度的黏附素附着于宿主细胞表面,并交换宿主的细胞质及细胞膜成分,来获取增殖需要的物质。但由于支原体生长条件复杂,使得菌体培养困难重重,导致过去支原体一直不受关注;近几年,拜分子生物学与基因组学的进步所赐,基因构造简单的支原体已引起了较为广大注意。
实验室污染种类
至今,共有超过180种支原体被发现,有超过20种能感染体外培养的细胞,而目前实验室最常见(95% 以上)的支原体则来自其中6种:
源自于实验人员鼻腔、口腔,并经由飞沫传至培养细胞中的口腔支原体(M.orale)、猪鼻支原体(M.fermentans)及人型支原体(M.hominis),居于首位(占总体的50%以上)。
其次则为大多来自牛血清的精氨酸支原体(M. Arginini)、莱氏无胆甾支原体(A. Laidlawii)、及来自猪源胰酶的猪鼻支原体(M. Hyorhinis)。
PS:BI胰酶经过辐照,不含活的支原体。
既然支原体是细菌的一种,抗生素一加不就好了吗?为什么可以搞到全球这么多细胞库污染?
1.支原体体积非常小, 极易通过0.22um滤膜, 且一般光学显微镜无法观察到。
2.支原体能附着并存活在器物表面(操作台, 培养箱,显微镜等), 提高操作污染概率。
3.支原体生长缓慢,通常不破坏宿主细胞但默默改变了细胞生长代谢,且对传统抗生素具抗性,因为抗生素大多破坏细菌细胞壁, 而支原体恰恰没有细胞壁。
4.支原体污染初期, 培养基不变色, 细胞形态正常,但等大量污染时, 为时已晚, 耗时又耗力。
目前检测方法可大致分成四种:
1.微生物培养法
将样品培养在特殊琼脂培养基上,在37?C有氧环境中孵育2周,阳性培养基上会长出100~400um大小的“煎蛋状”菌落。
2.DNA萤光染色法
支原体DNA中A-T含量占多数(55~80%),容易被Hoechst 33258此荧光剂染上,被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点。
3.ELISA法
将支原体16S核糖体RNA标上标签,然后用特定抗体预包被过的微孔板对标签进行捕获,再加入显色用的抗体及底物,最后通过比色法得出检测结果。
4.PCR法
原理为扩增支原体16S核糖体RNA的基因,能检测多达19种支原体,操作快速、准确性高
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