三代测序技术兴起已经不是一天两天的事情，可是好多小伙伴对它的认知好像仅仅限于一个名词，没有具体去深入了解过，以为可能就是跟现在的二代测序技术没有什么差别，只是升级版而已，小编很负责任的告诉你，在你不知道的时间里，它已经成为科研领域不可或缺的一种主流技术，广泛应用于基因组Denovo、全长转录本检测、宏基因组、重测序和变异检测等多个方向，并且在染色体结构变异（SV）的检测中有着不可替代的优势。特别是随着近两年 eccDNA（extrachromosomal circular DNA）即染色体外环状DNA成为科研界的宠儿，三代测序技术geng是被推上了浪潮的尖端。第三代测序技术主要有两大技术：第1是单分子实时荧光测序，脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度；当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时在DNA链上被探测到；当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。优点：（1）可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，即如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来直接检测甲基化等信息（2）测序速度很快，每秒约10 个dNTP（3）读长长（约50kb）：超长读长可获得mRNA全长序列及完整结构信息，提高拼接效率，转录本无需拼接；克服无参考基因组物种转录本拼接短、信息不完整的难题；实现有参考基因组物种研究可变剪切及融合基因等结构变异。精-准重构转录组/基因组全貌（4）直接对原始DNA/RNA样本测序，无需PCR扩增，无GC偏好性（5）需要的样品量很少，样品制备时间花费少缺点：（1）测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错（2）依赖DNA聚合酶的活性（3）成本比二代测序较高第二是纳米孔测序，新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的；由于纳米孔的直径非常小，仅允许单个核苷酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的变化差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。优点：（1） 测序读长：大约在几十kb，甚至100 kb，理论上只要DNA分子不断开就可以一直通过纳米孔（比如很火的eccDNA，往往比较大，并且往往携带多个染色质来源的序列，因此仅用二代测序很难完整构建出eccDNA的全长序列。三代测序技术显著提高了测序中分子读长的问题，可以用于eccDNA的全长序列鉴定）（2） 可以直接读取甲基化的胞嘧啶，不必像二代测序那样需要对基因组进行bisulfite处理（怎么理解：也就是用三代测序做一个全基因组测序的话，可以同时有DNA甲基化的数据分析）（3） 测序通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);（4） 起始DNA在测序过程中不被破坏;（5） 以及样品制备简单又便宜缺点：（1） 测序准确率：Nanopore测序准确率和Pacbio持平，为86%左右。而且起始位置正确率偏低，在大约100nt位置达到稳定，且错误为随机测序错误。如果是对DNA正负链都进行测序，可以达到96%的准确率（2） 切断的核苷酸可能被读错方向

    做转染实验时小编就抱着一个信念，就是要给细胞点“颜色”看（荧光），但你知道吗？就这个简单的实验过程，小小的细胞却有着大大的能量，实验过程中带阳离子的脂质体充当着“搬运工”的角色将质粒从胞外“抓”到胞内，而细胞为质粒的复制、转录、翻译提供“场所和原材料”，自己也跟着“增光填色”,但“上色”过程中会遇到一些问题，总结下来主要有以下二个方面：    细胞状态差    转染效率低    Q1：转染后细胞状态较差    A：分析：主要是铺板和反应液配制的原因     细胞状态是整个实验的关键，如果细胞状态不好，则转染后细胞状态当然就好不了     铺板：过多或不均匀，细胞长的太满就会状态较差     脂质体本身有毒性，如果脂质体加入量太多，会导致细胞状态较差，或者细胞死亡，建议在做正式实验前，先做一下预实验，摸索一下质粒和脂质体的配比。    Q2：转染后荧光效率低    A：分析：主要是细胞原因和“搬运”过程中的问题     1、细胞状态仍然是重中之重，如果有一段时间转染效果很不理想，必须要换一批次细胞；     2、加入目的质粒后轻轻混匀，太用力会破坏混合液的结构，     3、质粒与转染试剂的比值： 过高一部分质粒不能进入细胞，过低“搬运工”太多，有毒性且浪费；     4、吸、打液体时注意枪头内液面高度，是否完全打出；     5、反应液配好后等待20min，质粒才会被完全包裹；     6、反应液滴加加入细胞，使“脂质体+质粒”均匀分布；     7、质粒反复冻融影响浓度，尽量减少冻融次数；脂质体 -20℃保存，用完应马上放回；     8、必要时需要检测一下质粒的浓度是否准确；

    一、标记基因和报告基因的概念     标记基因(marker gene)，是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。标记基因是选择标记基因的简称，是指其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素等的抗性，或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。在培养基中加入抗生素等选择试剂的条件下，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来的一类基因。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否；在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。     报告基因(reporter gene)，是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，主要用于判断目的基因是否成功导入到受体细胞，并在其中表达。故当报告基因被用来区分转化和非转化细胞、组织、器官时，也可将其称为标记基因。报告基因不仅能作为标记基因，此外，报告基因还能用于研究基因的表达调控，检测启动子的活性，发现新的启动子，观察报告基因和目的基因的融合蛋白在细胞内的位置等。     二、标记基因和报告基因的区别与联系     二者的联系在于：报告基因都可以看做是标记基因。报告基因也有标记的作用，标记目的基因是否成功转化的作用，但是它们又有着各自的特点。     标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。     而作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：1）已被克隆和全序列已测定；2）表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；3）表达产物唯1，对受体细胞无-毒，并且能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。

    什么是封闭血清？    封闭血清就是将养殖的非免疫的正常动物采血，然后不加抗凝剂，血液凝固，血块收缩，析出的淡黄色液体。经过特殊工艺处理后的血清，特别适在各类免疫学实验中用于封闭处理， 比如：ihc、if/icc、elisa等。    血清与血浆的区别？    血浆是指血液中除去细胞成分后剩下的淡黄色或无色半透明液体，一般需要经过抗凝处理 。血清与血浆的区别在于血清中不含某些在凝血过程中被消耗的凝血因子如纤维蛋白原，增添了在血液  凝固过程中由血管内皮细胞和血小板所释放的化学物质。    为什么需要封闭？    封闭步骤可减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号。理想情况是，封闭剂将占据样本中的“黏性”位点，比如暴露的带电性或疏水性蛋白表面，同时不会干扰一抗/二抗识别靶表位，从而尽可能提高信噪比(s/n)。    用封闭血清效果好吗？    封闭血清适用于免疫组化或者免疫荧光实验中样本的封闭。可以封闭待检样本中与蛋白质非特异性结合的位点，另外还可以封闭样品中内源性的fc片段结合位点，阻断抗体与样品中的fc受体结合，从而降低背景，减少假阳性。对于适用多抗的实验，二抗种属来源的正常血清是封闭处理的金标准。    为什么会推荐远慕生物的封闭血清？    作为生命科学领域专业的产品，远慕生物科技始终秉承着只推对的，不推贵的原则，为您提供高性价比产品，加速科研成果。我司封闭血清有如下优势：    1、 高品质：正常的血清是从未免疫的正常成年宿主体内采集的血液，经脂质萃取和透析加工而成。血液采集和血清提取过程中采用专利技术，极大地避免了溶血的发生。    2、 用途广泛：ihc、icc、if、elisa。    3、 适用便捷：液体形式产品（原液），无需溶解，适用pbs直接稀释即可使用。    4、 质量稳定：在-20℃保存的话，一般都是可以放2-3年。    5、 配方优良：与其它进口品牌比，减少了一倍的防腐剂含量，对细胞和蛋白的毒性/影 响更小。    6、 种属全：提供全套种属的封闭血清，满足绝大多数客户的需求。    7、 现货供应：大量现货储备，确保货期时效性。    8、性价比高：买得起的高品质产品（亲和价格， 国际品质 ）    封闭血清如何使用？    推荐用pbs将封闭血清原液稀释5-20倍，配成5%-20%的工作液，直接滴加在组织切片或者细胞涂片上，37℃度孵育10-30分钟，清除血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗工作液，37℃孵育1-2h或4℃过夜。    实用：    1、最佳的稀释比例需研究者通过实验来确定。建议的起始稀释比例如下：ihc-p（1：10-20）；if / icc（1：10-20）；elisa（1：100）。    2、封闭用血清中不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同，可用与二抗相同来源的封闭血清。    3、封闭结束后，用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加一抗。    4、 每张切片需要量，可以参考50ul pbs + 5ul 血清 来计算。    5、如何如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损：    将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。长时间储存在2～8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。如果开盖后未使用完，我们建议存放于4℃，但请勿超过一个月。

明明是一瓶优质的血清偏偏出现沉淀和血清质量有关吗？会影响细胞培养吗？如何避免沉淀？出现沉淀如何处理？  “血清沉淀，其实属于常见现象，并不会影响血清的品质，大家不必惊慌！但很多人对这一现象还不是很了解。”为此，我们对“血清沉淀”的几个常见问题进行了总结，供广大科研青年参考。 血清沉淀是什么？血清中经常会出现肉眼可见的沉淀，其成分有多种类型，产生的原因有很多，主要有纤维蛋白、磷酸钙还有一些其它成分。1. 纤维蛋白（Fibrin）血清中肉眼可见的沉淀物大多属于这一类型。由于在生产过程中，血清采集、过滤（3 次 0.1 μm过滤）和灌装处理都是在低温条件下快速完成, 此时血清中纤维蛋白原（Fibrinogen）处于溶解状态。但在解冻之后, 血清中纤维蛋白原往往会发生凝集，形成肉眼可见的沉淀。下图是血清因反复冻融而造成纤维蛋白原的凝集2. 磷酸钙（Calcium Phosphate）这是一种常见的沉淀成分，通常会造成血清出现云雾状浑浊。当产品在 37℃保存时，这种现象尤其明显，在倒置显微镜下可观察到小黑点的存在。这些小黑点在布朗运动的作用下四处游动，常被误认为是微生物污染。3. 其他成分（Other） 血清中的其他成分也会形成沉淀，例如胆固醇形成的油脂滴和其他蛋白沉淀等血清沉淀会影响细胞培养吗？1. 细胞生长我们在出厂前都会对血清进行一系列质检测试，确保血清质量达到严格标准。血清测试和细胞培养经验也表明，其沉淀成分不会影响血清作为细胞培养添加物的表现。这一点得到了众多客户和其他血清供应商的肯定。解冻之后, 血清中纤维蛋白原往往会发生凝集，形成肉眼可见的沉淀。2. 怀疑污染磷酸钙颗粒经常会被当成微生物污染而引发不必要的担忧。一般情况下，当操作人员融化血清后注意到有雾状浑浊时，常将其存放在 4℃冰箱中观察，并考虑接下来是否继续使用。但这样会使沉淀进一步增多，反而会使血清更加浑浊，进而误以为存在血清污染。并且，在倒置显微镜下，可在血清中观察到四处游动的小黑点（磷酸钙颗粒的布朗运动），更容易使人误以为存在微生物污染。为防止这类误解的产生，我们不建议客户培养血清来验证是否存在污染，而是将血清直接接种在细菌培养基上进行培养，以观察是否有细菌的增殖。并且，进行革兰氏染色，并在油镜（100 X 10 倍）下观察可直接确认是否存在微生物污染。怎样操作可以尽量避免沉淀出现？1. 正确解冻首先，应按照逐步解冻的方式正确解冻血清：从-20℃取出后，置于 4℃冰箱缓慢解冻，最后置于室温完成解冻。如果直接从-20℃拿到室温或 37 ℃水浴解冻，则非常容易产生沉淀。在解冻过程中，请注意时不时缓慢摇晃瓶子，减少沉淀的产生。为避免反复冻融，建议您将血清分装使用。2. 使用和保存注意事项血清沉淀很难预测和避免，出现沉淀后也无需担忧，这并不会影响血清的品质。已知血清沉淀在以下条件下会有增多的可能：1) 热灭活；2) 37℃培养；3) 反复冻融；4) 伽马射线照射； 5) 2-8℃长期保存； 6) 长期保存于可自动化霜的冰箱中（温度不稳定）。血清沉淀的形成机理多种多样，具体的机理尚不十分明确。我们尚不能准确预测和控制血清沉淀的产生。目前市面上所有品牌的血清产品都存在沉淀现象，这一点可以在各品牌官方网站上关于沉淀问题的声明上得到证实。出现血清沉淀该如何处理？我们建议您采用2000 rpm 离心5分钟，取上清使用就好，比过滤方便，不需要另外准备滤心和针筒，又不容易污染。总 结：血清产品中出现沉淀属于常见现象，但不会影响血清的品质，对细胞培养而言也是没有任何问题的，大家可以放心使用！

实验原理分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。实验试剂(1) 10×切口平移缓冲液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2)；  0.1M/L MgSO4； 10mM/L DTT；  100ug/ml BSA。(2) 未标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mM/L。(3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ：(4单位/ul)：溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。(5) DNA酶:1mg/ml。(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。(7) 10M/L NH4Ac。实验步骤(1) 按下列配比混合:未标记的dNTP 10ul10×切口平移缓冲液 5ul待标记的DNA 1ug[α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ulE.coli DNA聚合酶 4单位DAN酶 I 1ul加水至终体积 50ul(2) 置于15℃水浴60分钟。(3) 加入5ul EDTA终止反应。(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5M/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。注意事项1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

1.ELISA试剂盒生产流程2.包被2.1 将包被抗原用包被缓冲液配制包被液，每孔取100 mL加入酶标板，盖好盖板膜，包被条件如下表，4℃ 16-20h包被时酶标板可以叠放，而37℃ 2h包被时酶标板之间的间距应保持一致（一般为5cm）。根据培养箱的设计调节酶标板间的间距，如培养箱从底部产热，则应增加下层酶标板间的间距为10cm 。2.2  包被加样采取吸二打一的方式，应避免加在孔壁上部，若不慎滴加在孔壁上，根据该滴溶液是否应加入孔内再做判断，若应加入，则小心振荡使其落入孔底，反之则用吸水纸小心吸出，并注意不可溅出，不可产生气泡。2.3  包被前预吸查看枪头是否合格，水流是否一致，不一致者应更换枪头，包被应采用优质枪头，每包被一块板，应将枪头套紧，并且在包被的过程中要注意查看吸液是否一致，在包被过程中若出现任何小问题，都应将此块板做出记号，以便后期组装入库时淘汰。2.4 若采用37℃ 2h包被模式，则应给酶标板编码，保证每块板子的包被时间一致。3.洗板3.1 包被后要进行两次洗涤，250微升/孔，洗涤完毕后，应在毛巾上拍干参与液体，并及时进行下一步封闭。3.2 洗涤时要注意查看水流是否一致，在洗涤程中若出现任何小问题，都应将此块板做出记号，以便后期组装入库时淘汰。4.封闭4.1 封闭液应提前一小时取出初步回温，用前摇匀，每孔取180 mL加入酶标板，盖好盖板膜，37℃封闭 1.5h, 酶标板之间的间距应保持一致（一般为5cm）。根据培养箱的设计调节酶标板间的间距，如培养箱从底部产热，则应增加下层酶标板间的间距为10cm 。4.2  封闭加样采取吸一打一的方式，应避免加在孔壁上部，若不慎滴加在孔壁上，根据该滴溶液是否应加入孔内再做判断，若应加入，则小心振荡使其落入孔底，反之则用吸水纸小心吸出，残留在枪头内的溶液不要打出 以免产生气泡。并注意不可溅出，不可产生气泡4.3 封闭前预吸查看枪头是否合格，水流是否一致，不一致者应更换枪头，封闭应采用优质枪头，每封闭一块板，应将枪头套紧，并且在包被的过程中要注意查看吸液是否一致，在封闭过程中若出现任何小问题，都应将此块板做出记号，以便后期组装入库时淘汰。5.烘干装袋5.1 封闭完后，摔倒孔内液体，并在毛巾上拍干，接下来采取烘干或者晾干的方式彻底干燥酶标板。烘干：37 ℃倒置（不加盖板膜或用自封袋），每5块板烘干30 min，随着板子数量增多时间相应延长，如100块板，需要烘3 h，依次类推；晾干：底部铺一层干净的A4纸或者吸水纸，倒置板子，在顶层铺一层盖住避光，室温晾18-24h。5.2 板子干燥后，应及时装入自封袋，按照每块板1袋干燥剂的量装入，袋子外面写好板子制备日期，放入本成品库冷藏环境保存备用。

牛血清培养中为什么会有黑点生成你了解吗,我司经过详细分解，得出以下结论，为防止客户由于操作方面而使黑点生成的办法。对此一定要做好以下几点。方可使细胞培养顺利。（1） 尽可能地减少血清冻融次数。 （2） 培养基无需 37℃水浴。 （3） 培养基保持PH 值 7.0- 7.2。 （4） 严格控制配制培养基的水质，容器定期刷洗。 （5） 掌握细胞传代的时机，细胞切勿生长过老。1、化冻 将血清从-20 度冰箱中取出，室温（或浸于自来水中）化冻（约需要 30 分钟至 2 小时，也可放于 4 度冰箱化冻过夜；化冻后若不马上灭活，可以放入 4 度冰箱中暂时保存） 2、灭活 （1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个空的血清瓶，内装 100ml 自来水，插入一根温度 计，温度监控以此为准） （2）当温度计显示 56 度时，停止加热，改为间断加热，维持 56 度（±0.5 度）30 分钟（±3 分钟； 若不小心使温度上升超过 56 度，则：若仍未超过 60 度，且时间很短，比如不超过 5 分钟，则仍可使 用；若超过 60 度，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于一些普通细胞的培养） （3）取出，自然冷却至室温（约需 1-3 小时） ，可分装或-20 度继续冻存。 3、分装 （1）转入无菌间，在超净台内将血清分装入 10ml 离心管中（注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀； 用吸液管或吹大管吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果产生气泡， 则在酒精灯火焰上过一下） （2）放入-20 度冰箱冻存 （3）全部操作约需要 4-6 小时

 荧光染料是细胞生物学等科学研究中不可或缺的重要工具，荧光滤色块是荧光显微镜中至关重要的一个部件。我们大家在操作荧光染料亮度的时候，我们可以按照上面的比较方法去比较荧光染料的亮度，那么一般荧光染料亮度怎么进行比较?        荧光染料的亮度可以用来比较不同荧光染料的荧光标记效果，通过阴性细胞群与阳性细胞群的荧光信号之间的关系来表示。但阴性细胞群的荧光信号受到信号强度、自发荧光、非特异性染色、仪器的电子噪声等多个因素相关。        荧光染料染色指数是阳性细胞群的平均荧光强度与阴性细胞群的平均荧光强度之差与阴性细胞群荧光强度标准差之间比值的一半。荧光染料染色系数只和抗体克隆与质量、荧光团纯度与质量、荧光修饰比、激光线及其功率、长通和带通滤光片、目的细胞等因素相关。        荧光染料的染色指数与荧光染料的亮度呈正相关，也就是荧光染料亮度越高，染色系数也就高。        DNA染料：         图1.用Cell Navigator™脂质液滴荧光测定试剂盒（Cat＃22735）和Nuclear Green™LCS1（Cat＃17540）染色的油酸处理过的HeLa细胞的荧光图像。  染料名称 标记部位 激光 滤光片组 亮度 DAPI（17510） DNA 355 nm DAPI 6 Nuclear Blue（17548） DNA 355 nm DAPI 6 Nuclear Green（17540） DNA 488 nm FITC 6 Nuclear Orange（17541） DNA 488 nm Cy3 6 Propidium Iodide（17515） DNA 532 nm Texas Red 3 Nuclear Red（17542） DNA 633 nm Cy5.5 6         细胞增殖染料：         图2.用CytoTell™Green和CFSE进行的细胞增殖测定。在第0天，用CytoTell™Green或CFSE对Jurkat细胞（?2×106细胞/ mL）进行染色。在指定的那天，以1：1的比例连续通过细胞。在通过当天，在FITC通道中用ACEA NovoCyte 3000流式细胞仪测量荧光强度。连续几代人以不同的颜色代表。  染料名称 功能 激光 滤光片 亮度 CytoTell Blue（22251） 增殖 405 nm DAPI 6 CFSE（22022） 增殖 488 nm FITC 7 CytoTell Green（22253） 增殖 488 nm FITC 7 CytoTell Orange（22257） 增殖 488 nm Cy3/TRITC 7 CytoTell UltraGreen（22240） 增殖 488 nm FITC 7 CytoTell Red 590（22261） 增殖 561 nm Cy3 7 CytoTell Red 650（22255） 增殖 633 nm Cy5 7        细胞活力检测染料         图3.用CytoCalcein Violet 500（Cat＃22013）染色的活HeLa细胞图像。细胞核用Hoechst 33342（Blue，Cat＃17535）染色。  染料名称 功能 激光 滤光片 亮度 Calcein Blue（22006） 细胞活力 405 nm DAPI 6 Calcein UltraBlue（21908） 细胞活力 405 nm DAPI 6 CytoCalcein Violet 450（22012） 细胞活力 405 nm DAPI 7 CytoCalcein Violet 500（22013） 细胞活力 405 nm FITC 7 Calcein（22001） 细胞活力 488 nm FITC 7 Calcein Orange（22008） 细胞活力 488 nm TRITC 7 Calcein UltraGreen（21905） 细胞活力 488 nm FITC 7 7-AAD（17501） 细胞活力 532 nm Cy5 2 Calcein Red（21900） 细胞活力 561nm Cy3/TRITC 7 Calcein Deep Red（21902） 细胞活力 633 nm Cy5 7         荧光标记染料        图4.将 HeLa细胞与（Tubulin +）或不与（Tubulin-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后与iFluor™488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色，左）或AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色，右）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。

    1.准备工作    准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。    2.取材    在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。    3.培养    将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。    正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH 是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2 浓度也要定时检查。    一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。    4.冻存及复苏    为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。    复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。    冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

    一、直接法    将抗原直接固定在固相载体上，参加酶符号的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。    1. 优势：操作手续简略，因无须运用二抗可防止交互反响。    2. 缺陷：实验中的一抗都得用酶符号，但不是每种抗体都适合做符号，费用相对进步。    二、间接法    此测定办法与直接法相似，不一样在于一级抗体没有酶符号，改用酶符号的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。    1. 优势：二抗能够加强信号，并且有多种挑选能做不一样的测定剖析。不加酶符号的一级抗体则能保存它最多的免疫反响性。    2. 缺陷：交互反响发作的机率较高。    三、双抗体夹心法    被检测的抗原包被在两个抗体之间，其间一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶符号后直接测定抗原的量；或不符号，再透过酶符的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体有必要当心选择，才可防止交互反响或竞争一样的抗原部位。    1. 优势：高活络、高专一性，抗原无须事前纯化。    2. 缺陷：抗原必定得具有两个以上的抗体部位。    四、根据细胞法(最新ELISA技术)    是一种新的定性蛋白检测技术，将细胞直接在微孔板里培育，待检测时，不需抽提蛋白和裂解细胞，便可直接丈量微孔板里蛋白经影响或抑制作用后的改变。    1. 优势：无需裂解细胞，所以方针蛋白丢失最少，可测定完好细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。    2. 缺陷：不能测定抗原量。    五、竞争法    样本里的抗原（自在抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一同竞争一样的抗体，当样品里的自在抗原越多，就能够越多的抗体，而固定抗原就只能到较少的抗体，反之亦然。经清洁过程，洗去自在抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只要固定抗原的对照组成果相比拟，依据呈色区别就可计算出样品里的抗原含量。    1. 优势：可适用比拟不纯的样本，并且数据再现性很高。    2. 缺陷：全体的敏感性和专一性都较差。

    蛋白质作为生命活动的直接执行者，参与生命的几乎所有过程，如遗传、发育、繁殖、物质和能量的代谢、应激等等。揭示生物体内成千上万种蛋白质的具体功能机制等是蛋白质研究的核心内容，也是后基因组时代生命科学研究极富挑战的领域之一。    蛋白研究贯穿科学研究的各个领域，至关重要，并且存在巨大的研究空间。以转化医学的诊断和生物治疗为例：    在诊断领域，通过检测血清中AFP、CEA、GP73、HE4的含量可以较早地预测各种癌症的出现，目前已经商业化用于诊断的蛋白指标仅有数十种，与已经研究定义的蛋白数量一万七千余种来说只是冰山一角。随着蛋白质组学技术日新月异的积累，通过大量病人和正常人的体液样本研究，特别是针对具有不同年龄段、不同疾病、不同病程的病人体液样本的研究将会产生越来越有价值的诊断检测蛋白标志物，这些指标的发现大大提高了肿瘤的早期发现率。    在生物治疗领域，基于PD-1和PD-L1的人源化抗体和基于CD19、CD20、CD138等的白血病CarT细胞疗法，其靶点都是细胞表面的蛋白质。科研界也在投入大量的经费用于肿瘤发生和进展过程中肿瘤细胞和免疫细胞的表面蛋白变化研究，以期寻找到特异性的治疗用于蛋白靶点。    以上提到的诊断和治疗的靶点，其实更多是一个“果”，到底什么原因造成了果，找到了他们形成的原因对于我们预防疾病和治疗疾病具有更大的价值，这就需要我们对于蛋白整个的信号通路进行研究。    目前，我们已经有了很多蛋白研究的方法和工具，也有越来越多的人加入到蛋白研究的行列当中。但是，设备的不齐全、样品的难获取、操作的复杂性等难题，成为了蛋白研究过程中的拦路虎。金开瑞关注蛋白整体研究思路，建立起蛋白质组、检测分析、病毒包装、基因服务、蛋白表达、抗体制备六大服务平台，提供从蛋白筛选鉴定、蛋白上游研究、目标蛋白制备到互作蛋白发现的一系列蛋白研究技术服务，致力为广大蛋白研究工作者提供最zhuan业、最you质的服务。    “读”——是指对生物样本中未知单一蛋白或者复杂蛋白的鉴定或定量检测，我们主要是借助基于质谱仪开发的各种生物学技术。    “解”——是指对预测的蛋白信息进行确证和深入的解读，这过程可能需要一些干预手段，让内源性的蛋白表达量升高或者减少，比如干扰、敲除或者过表达，抑或采用其他的手段在体外进行模拟验证研究。    “写”——是指通过体外重组制备出来，并通过系列的实验确认其结构与功能尽可能地接近天然的状态，以期作为一个工具进行后续的研究。    “用”——是指和客户合作将蛋白的检测和合成领域的成果开发到市场需求标准的产品或平台，共同打破研究和应用的壁垒，帮助客户研究成果推向市场化，让其研究成果的应用价值最大化，从而实现蛋白领域对生命科学领域的价值。

1.冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管的爆裂。2.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。 3.可否使用与原先培养条件不同的培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5.何谓 FBS，FCS，CS，HS？FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 是错误的使用字眼，请不要再使用。CS （calf serum） 则是指小牛血清。HS （ 则是指马血清。6.培养细胞时应使用 5% 或 10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10% CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时，则应使用 5% CO2 培养细胞。7.何时须更换培养基？培养基中是否须添加抗生素？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。一 ℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 长期储存。

    一、概述    实际工作中，一般用用液相色谱仪进行分析实验要用到对照品，标准品可以从试剂公司买，但有的物质是没有标准品的，大家就常说那是对照品，纯度都可以达到98%，那么对照品和标准品有没有一个严格的界定呢?还有做内标法说用的是内标物，这个内标物和对照品、标准品又有什么不同呢?    本文主要介绍对照品、标准品、内标物的区别。    二、详细区别介绍    1、内标物    将一个已知质量，样品中不含有杂质的纯物质，加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。    内标物需满足下列要求：能完全溶解于样品中，且不与待测组分发生化学作用;峰位尽可能与待测组分的峰位靠近，但能与待测组分完全分开(分离度R≥1.5)的纯物质。若得不到纯品，必须预先测定其准确含量，且杂质峰不得干扰待测组分峰。    此外，还应满足以下条件：    （1）内标物应是该试样中不存在的纯物质;    （2）它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;    （3）加入内标物的量应接近于被测组分;    （4）色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。    2、对照品    对照品是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，采用化学方法来测定，即是一般仪器的都叫做对照品。    对照品分为官方标准品和工作对照品，试剂公司买的不能作为正常的对照品使用，必须经过标定之后才可使用。    举个例子，药典规定若是血液制品，用来对照的叫标准品，若是药材，用作对照的叫对照品。    3、标准品    标准品系指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位(或μg)计, 以国际标准品进行标定;对照品除另有规定外,均按干燥品(或无水物)进行计算后使用。    引申阅读：    标准品、对照品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质。标准品与对照品(不包括色谱用的内标物质)均由国务院药品监督管理部门指定的单位制备、标定和供应。    标准品与对照品的建立或变geng其原有活性成分和含量，应与原标准品、对照品或国际标准品进行对比，并经过协作标定和一定的工作程序进行技术审定。标准品与对照品均应附有使用说明书，标明批号、用途、使用方法、贮藏条件和装量等。

    对照品（标准品）是执行药品质量标准的实物对照，是量值传递的重要载体，是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具、测量药品质量的基准、确定药品真伪优劣的物质对照，也是作为校正测试仪器与方法的物质标准。    对国家药品标准而言，它是国家颁发的一种药品计量、定性的标准物质。药品标准物质必须具备材料均匀、性能稳定、量值准确等条件，才能发挥其统一量值的作用。在药物研发当中，对照品（标准品）涉及量值溯源、产品定性、杂质控制等重要环节，其制备和标定情况与药品的质量研究、稳定性研究乃至药理毒理学研究中剂量的确定等临床前基础研究间存在密切关系，因此，药品对照品（标准品）的制备与标定是药品技术审评的一项重要内容。一般来讲，药品研发中标准物质的使用一般可参照如下原则：    1、所用对照品（标准品）中检院已有发放提供（可参阅中国药典2010年版二部附录ⅩⅤ　G），且使用方法相同时，应使用中检院提供的现行批号对照品（标准品），并提供其标签和使用说明书，说明其批号，不应使用其他来源的标准物质；使用方法与说明书使用方法不同时，如定性对照品用作定量用、效价测定用标准品用作理化测定法定量、UV法或容量法对照品用作色谱法定量等，应采用适当并经验证的方法重新标定，并提供标定方法和数据；若色谱法含量测定用对照品用作UV法或容量法，定量用对照品用作定性等，则可直接应用，不必重新标定。    2. 中检院尚无对照品（标准品）供应时，可使用如下标准物质进行标准制订和其他前期基础性研究工作：    （1）国外药品管理当局或药典委员会发放的对照品（标准品）或国外制药企业的工作对照品（标准品），但应提供其包装标签的彩色照片及使用说明的复印件，说明批号、有效期、使用方法等信息，能保证其量值溯源性；    （2）申请人自行标定或委托省所完成对照品（标准品）的标定，申报时提供标准物质的研究资料及相关信息，一般包括如下内容：    ①主成分对照品--制备工艺、结构及含量方面的研究资料以及通用名、化学名、结构式、分子式、分子量、各种杂质含量（水分、残留溶剂、无机盐等）、主成分含量测定数据（不同分析技术）、用途、贮藏条件等信息。    ②杂质对照品--制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及含量（不同分析技术）方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、用途、贮藏条件等信息。    ③混合对照品（定位）--各组分制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及纯度方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、含量（如必要）、定性具体方法与限度要求。    同时，申请人应及时与中检院接洽对照品（标准品）的标定事宜，以便产品上市后可以及时获得法定标准物质。    3、质量标准中用到的对照品如中检院在目前情况下尚不能正常提供，建议申请人在申报资料中明确产品上市后，标准物质的可获得性及相应措施。    4、质量标准中涉及到的各已知杂质，应在质量标准中明确其通用名称（或化学名称）、化学结构式、分子式、分子量等相关信息，以准确指称、控制各特定已知杂质。    5、一般情况下，为确保标准物质的准确使用和控制，尚需提供对照品（标准品）的质量标准，并规定专属性控制项目，如非对映异构体杂质的比旋度等。

实验原理琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子；聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA-片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最hao，且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶，可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整体效果都若于传统的EB。材料、试剂及器具1、材料合适的Marker（分子量标准）；DNA 样品2、试剂加样缓冲液（6x或10x）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）。3、器具（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。（2）凝胶成像系统或紫外透射仪。实验过程1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，选择合适的比例的凝胶，称取适量的琼脂粉，放到一锥形瓶中，加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。待胶液却至 60℃左右，在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。3、待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。4、在槽内加入TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。5、把待检样品，按合适比例与加样缓冲液混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节合适电压，稳压输出，开始电泳。7、观察溴酚兰的带（蓝色）的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时，可停止电泳。8、在紫外透shi仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm 或 254nm），通过观察孔进行观察。注意事项1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右，且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加 EB，建议选择EB溶液浸泡染色。3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度，已实际电泳条带运动速度为准。常见问题分析常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白DNA变性电泳前勿加热，用TE缓冲液稀释DNA出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往PCR体系需要优化，PCR程序需要摸索。其对策有：调整PCR体系和PCR程序，摸索出合适的条件。不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换DNA变性电泳前勿加热，用TE缓冲液稀释DNA带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低DNA降解实验过程避免核酸酶污染DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA带缺失DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNADNA链巨大，常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析电泳时Ladder扭曲配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可电泳时电压过高电泳时电压不应超过6V/CM

实验原理现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（＜15Kb），而去污剂裂解法则比较温合，一般用于分子量较大的质粒（＞15Kb）。碱裂解法是一种最广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为：染色体DNA远大于质粒DNA，且染色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状分子。当pH值为 12.0-12.6，碱性环境中，线性的大分子的染色体DNA完全变性且无法复性，而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可恢复其天然构象；在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA仍在上清中。残留的杂质可以通过酚氯仿处理掉。实验过程1、实验试剂（1）溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0；（2）溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS；（3）溶液Ⅲ 3Ml 醋酸钾 / 2Ml 醋酸；（4）异丙醇，无水乙醇，75%乙醇应放-20℃冰箱预冷备用；酚氯仿放4℃冰箱预存；（5）摇菌，2-3ml相应抗性的LB培养液，在37℃温度下过夜培养。2、质粒提取（1）菌液12000rcf离心5min，弃掉上清，加入0.2ml溶液I（已加入RNase），充分混匀后，加入0.25ml溶液II，颠倒混匀，室温放置5min，加入0.4ml 溶液III，颠倒混匀后，13000rcf 离心30min。（2）上清转入新的1.5mlEP管中，加入等体积的酚氯仿混合液，充分混匀。10000rcf 离心10min。（3）取上清，转入新的EP管，加入等体积、预冷的异丙醇，充分混匀后，13000rcf 离心 6min。（4）倒掉上清液，用1ml预冷的75%乙醇，颠倒后，13000rcf 离心 1min。（5）倒掉上清液，沿壁加入1ml预冷的75%乙醇，直接倒掉。（6）沿壁加入1ml预冷的乙醇，直接倒掉。倒扣5min后，室温下放置10min。待管内液体会发干净后，向管内加入100ul水，55℃孵育5min。      （7）所得质粒溶液可以放入-20℃中长期保存。注意事项若菌株为革兰氏阳性菌，该菌有一层细胞壁，必须加入溶菌酶才能使之溶解。摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5即可。溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存，以防酶失活。溶液II和溶液III使用前需注意观察是否有沉淀，如有沉淀可37℃水浴处理。溶液II处理菌体时间应控制在5分钟以内。常见问题及解决方法常见问题原因解决办法质粒浓度低溶液处理不充分增加溶液I/II/III的加入量，或降低菌液体积。质粒拷贝数低增加摇菌量，并降低最后的溶解体积菌体老化重新质粒转化或划线后挑取单克隆摇菌乙醇残留乙醇的存在会影响质粒的溶解和回收，须延长乙醇挥发时间洗脱液不合适可配置合适的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5）洗脱体积较小在保证质粒浓度的前提下，增加洗脱液的体积质粒有杂带菌液污染重新质粒转化或划线后挑取单克隆摇菌试剂污染质粒提取溶液重新配置，最后溶解液高压灭菌后使用

细胞培养时中常遇到的那些不可忽视的问题，及我们该如何解决呢？一、细胞的营养来源针对大多数肿瘤细胞，营养配方一般为：90%合成培养基（dmem、rpmi1640、mem等）和10%胎牛血清(fbs)；为了防止污染，可以加1%双抗！常见问题解答：q：针对不同细胞，细胞培养基配方一样吗？如何获知呢？a：不同细胞的培养基是不同的。一般atcc购买的细胞，针对不同细胞株，会有详细介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源ru腺癌细胞mcf-7细胞一般为1640，人源肺癌细胞a549可用dmem培养基。q：培养基为什么一般都是偏红色？a：因为培养基加了酚红来显示颜色，指示ph范围为6-8，颜色会由黄变为紫红。这是为了我们能更直观观察培养液的变化，如变黄，则代表偏酸，偏碱性了就显示偏紫色。一般来说，细胞吸收营养后，变黄后就暗示我们要换培养基啦！所以密切观察很重要哦！q：大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长，那可以替换吗？a：不建议更换atcc指定的培养基，因为当培养基改变时，细胞的性质可能也会变化。q：若是细胞生长缓慢，是否可以增加血清比例？a：可以！二、细胞的居住环境舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。如下图为培养细胞的器皿，包括形状、规格、用途多样的培养瓶、培养皿及培养板。最终住进37℃，5%co2的恒温培养箱。常见问题解答：q：细胞培养板规格不一，如何正确选用？a：根据不同规格的细胞培养皿/板容量及用途，如流式一般用 6 孔，爬片一般用 24 孔，mtt 一般用 96 孔，等。q：细胞培养皿和培养瓶区别？a：就细胞培养状态来说，培养瓶和培养皿没有太大区别，主要在于安全系数（培养瓶＞培养皿）、培养细胞数量（大培养瓶＞培养皿）。但是培养瓶成本也会相对较高，因此无特殊要求，一般选择培养皿即可。三、细胞的复苏与冻存（原则是慢冻速融）1. 细胞复苏：指将冻存的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。常见问题解答：q：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁？a：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。q：为什么细胞贴壁了，却长不起来？a：此时需要考虑的是细胞密度问题，一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。                                          2. 细胞冻存 将细胞放在低温环境（-70℃~-196℃），细胞内的代谢降低，可最大限度的保存细胞活力，以便长期储存。常见问题解答：q：目前细胞冻存液多采用的什么配方？a：目前细胞冻存多采用dmso二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：dmso=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：dmso=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。q：若没有细胞冻存盒，我们该怎么办？a：可先将冻存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或过夜，最后放入液氮罐内。为了节约时间，还可直接在冻存盒外包裹一团棉花，用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点，将细胞转移至-80℃冰箱过夜，再转移至液氮保存。q：细胞冻存时对细胞量有要求吗？a：细胞复苏时会有一定的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，起始浓度106—107个/ml/管；四、细胞的传代培养细胞传代：细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到抑制，影响细胞状态，因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。常见问题解答：q：为什么我们总说选择对数期细胞传代？a：细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。q：那如何确定细胞对数期？a：根据上述细胞生长曲线，为了确保活力，必须使细胞保持在对数期就传代，所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。q：一般细胞传代都是1分2吗？a：要根据不同细胞而定，如有的生长很快，比如说4t1细胞，传代取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又特别慢，比如 bt474。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。q：消化很关键吗？a：不得不说，细胞状态差，很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同，因此对胰酶的反应也不同，我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止；而非细胞全部分散成单个。q：部分比较难消化的细胞怎么办？a：可放于37℃培养箱消化。以mda-mb-231/pax紫杉醇耐受细胞为例，放于37℃培养箱消化5-8min，轻轻拍打，才见细胞成片移动，因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。q：几天换培养基？a：正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在ph6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。q：每天观察细胞有必要吗？a：一般的肿瘤细胞我们是隔天传代，但是切不可忽略对细胞的观察，一定要每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住，是每天。q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理？a：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者pbs洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。q：细胞污染怎么办？a：如发现细胞有污染，一般应立即丢弃。如果细胞非常宝贵，可试着加入含抗生素的培养基反复清洗，并用抗生素含量高的培养基培养，并经常更换培养基.

1．斜面低温保藏法（1）将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。（2）保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。2．液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。3．滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。（3）取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。（6）将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于低温下。（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。4．沙土保藏法（1）取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。（9）于每支沙土管中加入约0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。5．液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液体的。（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟。（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。6．冷冻干燥保藏法（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6-7.5mm，长105mm，球部直径9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，备用。（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24-48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7-10天。（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6-8小时即可。（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

    一、常用培养基1、lb培养基将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要用1nnaoh（～1ml）调整ph至7.0，再补足水至1l。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/l,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/l。2、sob培养基将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨20g酵母提取物5g氯化钠0.5g1mol/l氯化-钾2.5ml用水补足体积到1l。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/l氯化镁。3、soc培养基成分、方法同sob培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/l氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/l葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。4、tb培养基将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨12g酵母提取物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/lkh2po4/0.72mol/lk2hpo4的溶液（2.31g的kh2po4和12.54gk2hpo4溶在足量的水中，使终体积为100ml。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。5、2×yt培养基将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要用1nnaoh（～1ml）调整ph至7.0，再补足水至1l。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/l,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/l。6、ypd培养基将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨20g酵母提取物10g葡萄糖20g用水补足体积为1l后，高压灭菌。建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸，因为ypd培养基是色氨酸限制型培养基。为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。二、常用抗生素氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）溶解0.1g卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解0.25g氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。链霉素（streptomycin）（50mg/ml）溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。萘啶酮酸（nalidixicacid）（5mg/ml）溶解0.05g萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。四环素（tetracyyline）（10mg/ml）溶解0.1g四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。小技巧：如配制10mg/ml卡那霉素，先在盐水瓶或血清瓶加入10ml双蒸水，高压，冷却后加入0.1g卡那霉素，混匀，滤膜过滤到试管中，再以1ml/管分装到ep管中待用。

一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。2、掌握无菌操作基本环节。二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。三、实验材料1、恒温培养箱。2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。3、培养基（上次实验配制的）。4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。。（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。（9）将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。2、液体接种（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管或滴管。接种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀即可。3、平板接种将菌在平板上划线和涂布。（1）划线接种 见分离划线法。（2）涂布接种 用无菌吸管吸取菌液注入平板后，用灭菌的玻棒在平板表面作均匀涂布。4、穿刺接种把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。（二）分离的操作方法1、稀释分离法通过不断稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板与温度适合溶化了的琼脂培养基混合，这样分散的细菌被固定在原处而形成单菌落。（1）将大肠杆菌或酵母菌用无菌水制作菌悬液。（2）取若干支无菌试管，每支内盛9ml无菌水。（3）吸取1ml制备好的菌悬液，置于第一支含有9ml无菌水的试管内，这样就稀释了10倍，也就是10-2。（4）从第一支试管内（10-2）吸取1ml注入第二支含有无菌水的试管内，这样就稀释了100倍，也就是10-2。（5）用同样方法操作，直至稀释至10-5-10-6。（6）分别精确吸取10-5-10-6各稀释度菌液0.2ml加入编好号的空无菌平皿中，同一稀释度重复做三个平皿。（7）将已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基倒入上述各平皿内，轻轻旋转使培养基与菌悬液充分混匀，凝固后倒置于37℃或38℃度恒温箱中培养24-48小时，观察平板上菌落生长和分布情况。2、平板划线分离法平板划线分离法是接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。（1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，水平静置待凝。（2）在酒精灯光焰上灼烧接种环，待冷，取一接种环金黄葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液。（3）左手握琼脂平板稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作之形回划线，划线时例接种环与平板表面成30-40°角度轻轻接触，以腕力在表面作轻快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进增基内。（4）灼烧接种杯，以杀灭接种环上尚残余的菌液，待冷却后，再将接种环伸入皿内，在第一区域划过线的地方稍接触一下后，转动90°，在第二区域继续划线。（5）划毕后再灼烧接种杯，冷却后用同样方法在其他区域划线。（6）全部划线完毕后，在平皿底用特种蜡笔注明菌种、日期、组别、姓名。将整个培养皿倒置放入恒温箱培养。（7）37℃经过24-48小时培养后取出观察。注意菌落的开关、大小、颜色、边缘、表面结构、透明度等性状。附一 无菌操作环节（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。（5）培养箱应经常清洁消毒。

微生物组研究通常归结于两类问题：谁在那儿以及它们在干什么。为了回答这些问题，生物学家往往使用新一代测序。16S rRNA测序能够揭示微生物的身份，而转录本测序又能够提供线索，说明这些微生物在干什么。不过，除了测序，研究人员也利用改造的遗传工具来研究微生物组。下面，我们就来看看他们如何利用质粒工具来开展微生物组研究。尽管人们能够通过测序来监控微生物组，但遗传改造其成员的能力还十分有限，而且许多微生物难以在其天然环境以外的地方培养。因此，哥伦比亚大学的Harris Wang实验室开发了一种原位改造肠道微生物组成员的方法，并发表在《Nature Methods》杂志上。他们将这种方法称为MAGIC（通过原位接合来改造肠道微生物组）。在MAGIC方法中，研究人员将大肠杆菌供体菌株引入微生物组，从而利用IncPα-family-RP4接合系统将遗传负荷导入受体。此系统可将质粒引入革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。研究人员进一步开发出一套pGT质粒，带有各种复制起点，适用于各种微生物。它们还含有RP4转移起点、可选择的标记以及所需的遗传负荷（如GFP）。因此，细胞可利用FACS进行分选，并通过抗生素选择进行分离。他们在体外和体内测试了该系统。他们在体内实验中发现19个属的细胞通过接合系统摄取了质粒，不过在体外实验中只鉴定出7个属，这可能是因为体外条件不能很好地支持有些物种的生长。这些结果也突出了微生物组研究需要原位改造工具。分析肠道菌群的纸片法对于临床和诊断实验室而言，在处理大量微生物组样本时，深度测序和qPCR方法都过于昂贵和耗时。为了实现大规模的肠道微生物组研究，麻省理工学院的James Collins实验室开发出一种“纸片法”，可检测纸上的微生物和生物标志物。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上。这种方法的核心在于一种RNA Toehold开关，这是一种RNA发夹结构，可结合和检测几乎任何RNA序列。发夹的下游是核糖体结合位点（RBS），接着是报告基因。发夹通过隔离RBS而阻断翻译，但“trigger RNA”的结合能够暴露出RBS，让报告基因得以翻译，从而产生GFP信号。通过标准品的使用，这种方法可估算出样品中mRNA的浓度。Collins实验室选择了10种与疾病相关的细菌，并设计出Toehold开关传感器（TSS），可对菌种特异的mRNA进行半定量检测。另外，他们还针对钙网蛋白和抑癌蛋白M等四种生物标志物开发出TSS，以分析炎症性肠病患者的粪便样本，并用RT-qPCR方法进行验证。研究人员还证明，利用此平台可以检测艰难梭菌（Clostridium difficile）毒素mRNA的表达。由于mRNA表达无法通过qPCR方法来鉴定，故他们认为这种检测毒素mRNA转录本及其他转录本的能力具有潜在价值。研究蜂类的微生物组对动物微生物组中存在的细菌进行改造，有望在农业和医学方面取得突破，不过对于蜂类微生物组，目前就缺乏这样的工具。德克萨斯大学奥斯汀分校的Nancy Moran和Jeffrey Barrick实验室开发出Bee Microbiome Toolkit（BTK）来研究大黄蜂和蜜蜂的微生物组。这个工具箱含有模块化的组件，可通过Golden Gate组装技术组装在一起，从而快速检验新分离细菌的多种抗生素抗性标记、启动子、荧光报告蛋白及其他编码序列。研究人员利用BTK来操控蜜蜂和大黄蜂肠道内固有的变形菌，在一系列变形菌中表达荧光蛋白，让人们能够观察到这些细菌如何在蜂类的肠道内定植。此外，他们还能够利用BTK来导入CRISPR组分，实现基因功能的破坏或干扰。尽管这些质粒是为蜂类设计的，但它们适合广泛的宿主，也可用来研究其他动物的微生物组。对细胞分裂进行计数监控肠道内微生物群体的动态，有助于研究人员了解微生物组如何应对感染、失调和抗生素治疗。为了促进这方面的研究，哈佛医学院的Pamela Silver实验室开发出一种合成标记和重新捕获策略，对细胞分裂进行计数。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上。这种技术称为分布式细胞分裂计数（DCDC），它是将荧光蛋白在细胞内组装成明亮的颗粒。为了实现这一点，实验室将红色荧光蛋白（RFP）与自组装蛋白（SAP）相融合，比如噬菌体衣壳蛋白。这种融合蛋白的表达受到阿拉伯糖诱导型启动子的控制。在实验过程中，首先用阿拉伯糖诱导细胞，让SAP-RFP融合体开始表达。然后，洗涤细胞，不再产生新的颗粒。在后续细胞分裂的过程中，含有颗粒的细胞随时间的变化呈指数下降，以此确定细胞分裂的次数。这种方法可用于体内和体外研究。

大脑是我们最需要能量和代谢活跃的器官。它对我们的思想、四维、行动和学习能力负责。我们的大脑由600公里长的血管提供能量，这些血管为大脑提供营养并清除废物。然而，大脑也非常脆弱。因此，大脑中的血管进化出了一种严密的保护屏障——血脑屏障，它限制了分子在大脑中的进出运动。一方面，病原体或毒素被有效地阻止进入大脑，另一方面，所需的信使或营养素可以畅通无阻地通过它们。大脑及其血管之间的广泛交流是很重要的。最近Asifa Akhtar实验室的研究表明，血管可以感知邻近神经细胞的代谢状态。研究人员发现，表观遗传调节因子MOF是为神经元提供加工脂肪酸所需的正确代谢酶所必需的。研究的主要作者Bilal Sheikh解释说：“必须通过什么物质告诉神经细胞周围有营养物质，它们应该启动处理这些营养物质所需的程序。MOF进入DNA，启动基因程序，让细胞处理大脑中的脂肪酸。”脂肪酸存在于食物中，用于产生能量和组装细胞膜所需的复杂脂质。当MOF的活性有缺陷时，如神经发育障碍时，神经元就不能处理脂肪酸。这导致它们在脑细胞间的间隙积聚。在他们的研究中，Asifa Akhtar的团队发现脂肪酸的这种不平衡是由神经血管感知的，通过放松血脑屏障刺激神经血管产生应激反应。如果代谢失衡仍然存在，血脑屏障的渗漏会导致疾病状态。神经血管破裂这项研究为更好地理解神经细胞和血管在大脑中的相互作用奠定了基础，并阐明了复杂器官中一种细胞类型的代谢环境的变化会直接影响周围细胞的功能，从而影响整个器官功能。“我们的研究表明，大脑的适当新陈代谢对其健康至关重要。有缺陷的神经代谢环境可导致血管炎症、形成血脑屏障的细胞功能障碍和通透性增加。接下来会发生神经血管破裂，”Asifa Akhtar解释说。“这一点尤为重要，因为神经血管破裂是老年痴呆症和血管性痴呆等老年相关疾病发病的一个特征。更好地描述导致血管功能障碍的分子变化将有助于设计更好的治疗方法来治疗这些衰弱的病理。”

 过去100年来，生物学家一直想知道是什么决定了细胞的大小。在近代，虽然科学家们知道了大部分控制细菌细胞周期和细胞分裂的分子，但仍不知道细菌细胞的大小是如何确定的。5月18日，中国科学院深圳先进技术研究院（以下简称中科院深圳先进院）、深圳合成生物学创新研究院刘陈立研究团队以大肠杆菌为模式生物，揭秘了细菌大小的决定因素，相关成果发表于《自然—微生物学》。该研究推导出了全新的“个体生长分裂方程”，修正了该领域原有的两大生长法则，并对合成生物学领域生命体理性设计提供了相关建构基础原理。每种细菌都有各式各样的可遗传继承的大小，这些微小细胞的体积有时可以相差106-108倍，当然，较大的细菌是极少数的，大多数已知细菌的直径在0.4至2微米之间，长度在0.5至5微米之间。细菌的大小不仅呈现多样化，而且很稳定。即使在温度高达100度以上的热液口、盐浓度高达5摩尔的盐湖、离子放射性强度超过人类致死剂量1000倍等条件下，这些环境中的细菌细胞仍然保持特定大小。长久以来，细菌的大小一直是细菌分类学中一个不可缺少的性状，同时特定的大小使得细菌能适应其生存环境。那么细菌的大小究竟是怎么决定的？。一测到底 展开三年漫长研究早在上世纪50年代，美国科学家schaechter等发现细菌细胞长得越快，细胞就越大。为重要的是，该研究突破性地用一个数学公式描述了细菌细胞生长速度和细胞大小之间的定量关系，即是说只要知道细胞生长快慢，就可以准确推断出细胞大小，反之亦然。这一公式后被称为"smk生长法则"。那么，细胞大小和生长速度为什么存在这样的关系呢？1968年，donachie在《自然》杂志上发表了他的观点。他认为，细胞大小决定了细胞内dna何时开始新一轮复制。当细胞进入复制阶段时，细胞大小和复制起点数的比值是恒定不变的。这一比值被称为“起始质量”，且“起始质量”与生长速率无关。开始新一轮dna复制后，经过恒定的时间周期，细胞分裂。由于细胞是指数生长，起始质量及时间周期恒定，因此分裂时细胞的大小与生长速率的指数次方成正比。这一观点很好的契合了smk生长法则，回答了“细菌大小是怎么决定的”这一基础科学问题，被称为“恒定起始质量假说”。这两个统治了学术界半个世纪的生长法则环环相扣，就像科研道路上的“指路牌”，在该领域树立权威六十年，多年来许许多多的研究在两大法则的指引下开展；也有一些研究团队对这两个法则的准确性提出过质疑，但由于缺乏系统全面的实验数据，相关结论并未引起领域内大部分研究人员的重视。要想修正主流细胞生长法则，必须要确保实验数据完整的覆盖度以及高度的可重复性，刘陈立团队潜心研究3年多，对两大法则进行了系统性重复实验。“通常该类研究会选取1种或少数几种培养基，而我们选择了超过30种培养基开展实验，我们采用早晚轮班制，对细胞的生长状态进行实时监控，以确保每次取样都是在细胞稳定状态下进行的，”该文章的第一作者郑海博士介绍说，“在低生长速率条件下，完成一次实验所需时间长达一周，而为确保数据可靠，实验还需要重复，重复次数多的超过9次以上。”这是迄今为止有报道的类似研究工作中选用培养基种类多、覆盖生长速率范围广的一次。带着极大的耐心和严谨的态度，团队终发现，原有的两大法则并不准确，被奉为经典的“指路牌”可能将大家的研究引向了偏离的方向。“虽然生长速度越快，细胞越大，但二者之间的关系并不符合smk生长法则的预期”，该文章通讯作者刘陈立研究员说，“按照法则描述，无论细胞生长快慢，一旦达到‘起始质量’，就应该开始新一轮的dna复制，然而，我们却在实验中观察到，细菌细胞没有遵循假说，不同培养条件下，‘起始质量’有高有低。”如果两大法则并不准确，那么细菌大小是怎么决定的呢？我们能否修正“指路牌”呢？玩转数据 推导全新定量关系为了回答“细菌大小是怎么决定的”这一科学问题。刘陈立这样描述实验数据分析的过程：“要和数据呆在一起，揣摩它。”研究团队通过寻找大量科研实验数据背后的量化关系，终推演出一个全新且适用于不同生长速率条件的“个体生长分裂方程”。新的方程统一了不同生长速率条件下的细菌细胞周期调控机制，这一定量公式的提出也使得细菌个体大小、生长速率等自然现象具有了一定的可预测性，例如：当得知细菌生长速率和dna复制周期，便可准确预测出细菌的大小。该分裂方程为研究人员提供了新的研究范式和思维方法，解答了细菌细胞大小和dna复制周期以及生长速度之间的关系，具有广泛应用价值。“个体生长方程”对理解细菌细胞周期的控制机制有什么意义呢？在“个体生长方程”的约束下，研究团队对细菌细胞分裂的控制机制进行了探讨。并以此为基础提出了一个全新的分子机制假说，认为存在一种“分裂许可物”，它与“细胞生长”和“染色体复制分离”相关。当它积累达到一定阈值时，细胞就会分裂。研究团队在此基础上建立了相应的数学模型，进一步的实验验证了理论预测。从数学公式到建构生命体理性设计基础在物理世界，“伯努利方程”指导了飞机的设计，“阿基米德浮力定律”推动了潜艇的面世，“牛顿第二定律”是人类得以翱翔太空的理论基石，合成生物学的终极目标就是生物世界实现理性设计、改造现有生命形式或者创造全新的生命形式以满足人类不同的需求。以“合成生物学”为研究导向，刘陈立团队继去年揭示细菌群体迁徙公式后，在定量生物学领域再度实现突破，“研究再次证实了定量的思维方法在生命科学研究中的重要性，我们找到的每一个运行规律，都是试图找到可用于指导设计、改造、重建生命形式的‘图纸’。”刘陈立表示。此次对细菌个体细胞相关定量规律和法则的基础科学问题研究，对人类揭示并理解生命体内在原理提供了重要的参考依据，此研究也有助于未来合成生物学领域的理性设计和建构，以满足细菌治疗疾病、抗生素替代、绿色生物制造等多个应用层面的需要。

要选一款合适的支原体检测试剂盒，有如下几个评价指标：1. 灵敏度。灵敏度常用支原体基因组的拷贝数或支原体菌株的CFU表示。2. 特异性和广谱性。质量好的试剂盒应检测的支原体物种越多越多，并且特异性强，即只针对支原体，不针对其他细菌等微生物，没有交叉反应。3. 稳定性。冻干粉比液体试剂的稳定性高。4. 样本类型及样本处理。一款好的试剂盒，会标出它适合的样本类型，也会说明如何处理样本。要注意有的样本含有抑制PCR反应的物质，因此需要处理。5. 对照品。一个好的试剂盒，会带有阳性对照和内控对照。内控对照是用于监测PCR是否正常。如果样本含有抑制PCR的物质，则内控对照的条带会发生缺失。有严重支原体污染的样本由于样本中的支原体对内控对照产生了竞争性抑制，因此支原体条带越强，内控条带越弱（下图）。图. 1. 100 bp DNA Ladder；2. 阴性对照，有内控条带；3. 阳性对照，有支原体阳性条带；4. 样本有PCR抑制剂；5.阴性样本；6.阳性样本，支原体污染较轻；7.阳性样本，支原体污染较重。图片来自Minerva Biolabs公司生产的Venor®GeM Advance支原体检测试剂盒说明书但支原体核酸检测法（NAT）并没有载入我国药典。我们药典指定的是支原体培养法和DNA染色法。但2018年《中国药事》第8期上，中国食品药品检定研究院刊发了一篇文章——《支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考》，提出提出要与国际接轨，逐渐推进NAT的开展，因其“具有快速、灵敏、便捷等特点”。欧洲药典规定，核酸法如替代培养基，核酸法的灵敏度需达到10 CFU·mL-1；如替代DNA染色法，核酸法的灵敏度需达到100 CFU·mL-1。该文也提出，需对NAT进行特异性、最低检出限和耐用性的验证。因此，对于需要NAT法检查支原体的生物制品和细胞治疗产品企业，可选择试剂盒已经验证并提供有参比物质的知名品牌厂家，尽管后续仍需按照待测样本类型进行方法的适用性验证，并同步开展药典方法的平行检测研究，但已为NAT法检查支原体带来极大的方便。

1、Q：Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？A：可以。因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。请问这是什么原因导致的？A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA片段化。而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。基线稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，给你的建议是在经费、时间允许的范围内再多做几次吧。感觉这么大的差异，可能这两种方法都会存在问题。还有，去流式的路上，装细胞的ep管最好插在冰上，拿着冰盒。3、Q：可以用液氮保存瘤组织块，然后再做流式细胞分析吗？A：我认为是不能的。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这样才能区分死亡、凋亡和活性细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测了，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。我以前也试图将组织存入-80℃，然后进行流式检测，结果发现后来处理的组织细胞不是粘团就是破碎，根本无法检测。如果你实在找不到可以检测的流式细胞仪，我建议你可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。我们实验室的肿瘤组织块一部分冻存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫组化。4、Q：有关流式前收集细胞的问题1、贴壁细胞做流式前用胰酶消化下来对细胞膜损伤小还是用细胞刮刮下来损伤小？种在板里的贴壁细胞可以先染PI然后再消化下来吗？这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的PI的误差？A：我想做NK细胞对肿瘤细胞的杀伤实验，用MTT做了很多回，但只有NK细胞的对照组OD值就和肿瘤对照组差不多高了，这样NK细胞杀伤肿瘤细胞后自身的变化对抑制率的影响会很大，所以想用流式来测肿瘤细胞的凋亡。我担心胰酶消化会造成细胞膜的损伤，这样就会有一些细胞因消化的原因染上PI，所以想尝试先染PI，洗掉多余的PI后再用胰酶把细胞消化下来，不知道可不可以。低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，吊桶式离心机4度1000rpm 3～5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。而先加PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且PI本身对细胞也是有毒性的，对你的实验结果影响会比胰酶大，个人不建议这样做。5、Q：做流式细胞过程中，由于不能用胰酶消化贴壁细胞，还有其他什么方法吗？由于293细胞贴壁能力很强，现在要做流式，要把贴在培养皿壁上的细胞消化下来。但又不能用胰酶消化，我试着用1毫升的1mM的EDTA消化20min，结果细胞很难消化下来。最后，去做流式检测结果很差。不知道还有其他什么更好的消化方法，但又不破坏细胞膜的表面结构。A：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因为annexinV是Ca依赖的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV，进而影响结果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入温箱内进行消化，时间可以长一点，随时观察细胞情况，避免消化过度。建议用细胞刮子把细胞刮下来，然后用枪吹匀，比消化还简单，而且也避免了胰酶带来的损伤，机械的损伤还是很小的因为细胞大多呈大片大片地被刮下来。6、Q：流式测凋亡为何左上象限出奇的高？A：看了你的数据，我觉得第一跟你的细胞状态很有关系，你说对照组中间也有很多死细胞，而且你做实验时也吸上来了，坏死的细胞和凋亡的细胞是不一样的，如果细胞坏死破裂很多的话这时左上象限PI就很高了，再则，PI染的时间5-10分钟就可以了。我做的时候是采用PI和Annexin V分开染，PI先染或离心去掉染液，然后再加结合液和Annexin V10分钟后上机检测。PBS洗的目的有利于Annexin V的结合反应，为了缩短实验时间和较少细胞损失，我一般也就洗一次。最后，我个人的观点是做实验时，细胞状态一定要好的情况下去做，不要勉强，这一既浪费试剂和时间，也往往得不到好的可靠的结果。你做的是贴壁细胞，中间有好多死的细胞，你可以先接种细胞，待细胞贴壁好了，然后再换一次液，这样就把那些死细胞去掉，接下来再加药物。7、Q：请教做流细胞凋亡，那种方法比较好？也比较经济实惠？Annexin V/PI双染色法和Hoechst/PI双染法哪种更好一点？A：Hoechst/PI染色在流式分析中并不常见。Hoechst需要紫外激发，因此只有在配备了相应激发光源的流式细胞仪上才能使用。我的印象中，不少地方的分选用流式为了用Hoechst分析sp表型的干细胞，配备了此激发光源，但是普通的分析用流式，多半是没有配备的。8、Q：流式细胞仪检测凋亡如何算是否有统计学意义？A：用流式检测凋亡时，PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般的说明书都会标明，PI在上机前5分钟加，然后在一个小时内检测。根据以前做流式凋亡时的经验，我个人认为，一般每组实验一次可以先做三个复孔，上机前5分钟加PI，最好在半小时内检测完毕。这时可以先分析下三个复孔的差异。等待摸索的实验条件成熟后，每组实验一次可以做6~8个复孔，然后做统计学分析。严格说来，当做出统计学差异时，这样的实验还要重复三次。但是因检测凋亡时，受细胞状态，PI染色时间，流式检测时间，以及每次实验时的误差等的影响外，很难保证能够完全重复出上次的结果，甚至即使在保证了实验条件几乎相同的情况下，每次重复的差异也会出现加大的情况。这时可以适当重复2~3次，尽量使差异减小。9、Q：如何用Hoechst33342/PI流式检测凋亡？A：标记完以后，若用流式检测，坏死细胞与凋亡细胞的峰形是不一样的，坏死细胞呈反抛物线，而凋亡细胞呈正常，应是双曲线吧，很容易区分的。关于PI与Hoechst33342作用：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

牛血清白蛋白，称牛血清蛋白，又称第五组分，英文名称为Bovine Serum Albumin，也称Bovine albumin，或Cohn Fraction V，简称BSA。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。产品特点状态： 白色结晶或类白色冷冻干燥粉末；溶解性：溶于水，难于盐析分子量：66.430 kDa等电点：4.7纯度： 98%产品应用:酶切反应的应用；ELISA及WB实验中，用作封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液；生化研究，遗传工程和药物研究；产品信息:标准级别的牛血清白蛋白（BSA, Standard Grade），可以满足大部分常规实验需求，如用作免疫封闭剂、组织细胞（微生物动物及昆虫细胞等）培养养料和培养成分、蛋白/酶稳定剂以及蛋白定量标准品。诊断级别的牛血清白蛋白（BSA，Diagnostic Grade），可以满足大部分常规实验需求，如用作免疫封闭剂、蛋白/酶稳定剂、稀释剂、载体以及蛋白标准品。另外，还可用于具高灵敏度要求的免疫检测、细胞培养和杂交实验。无IgG、蛋白酶、DNase的牛血清白蛋白，适用于RIA和ELISA检测中用作稀释液和封闭剂。也可用于干细胞培养、杂交瘤细胞培养。无脂肪酸的牛血清白蛋白（Fatty Acid Free BSA），其内的脂肪酸含量非常低（0.02%），几乎可忽略，且易溶解。通常用作微量元素，脂肪酸，激素和生长因子的载体蛋白，加入无血清培养体系。本品允许BSA内加入某些特定的脂肪酸以促进细胞生长。适用于避免脂类或脂肪酸干扰结果的激素或胆固醇分析检测。无蛋白酶的牛血清白蛋白（BSA, Protease Free），，经检测无蛋白酶残留。主要用于重组蛋白生产，更适合用于RIA/ELISA实验封闭剂以及抗体稀释液。低内毒素的牛血清白蛋白（BSA, Low Endotoxin），产品中内毒素含量低于2.0 EU/mg，在内毒素水平敏感的细胞培养中，该产品可作为天然载体蛋白使用；适用于无血清或化学成分限定的细胞和组织培养中；有效的稳定和稀释敏感蛋白溶液；也可用于ELISA等诊断检测。

    一、万物的生长离不开水，细胞也是一样的，若要它生长，必须要用新鲜的双蒸水，不含任何杂质和有离子等成分。    二、PBS（也可用BBS、如：Hanks D-Hanks液配置）-此产品主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗。Sciencell的DPBS（SicenCell No.0303）是一种无毒、无渗合物的缓冲液，它不包含Ca2 +, Mg2 和酚红并且通过0.2μm过滤消毒，可用于冲洗细胞而不会造成损伤。    三、胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样，胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在PH值为8.0，温度为37度时，胰酶溶液的作用能力最强。所以使用胰酶时。应当把握好时间，浓度和温度。因Ca2 +, Mg2，血清和蛋白质会降低胰酶的活性，所以配置胰酶时尽量避免使用含有这些物质的水剂。sciencell 胰酶（SCIENCELL No.0103）含有0.25%EDTA，(EDTA)是一种螯合剂，能螯合Ca+2、Mg+2等金属离子，促进胰蛋白酶化反应。（ScienCell No.0183）0.05%胰蛋白酶加EDTA溶液(T/E)是一种无菌、磷酸盐和缓冲盐水溶液。此胰酶适用于原代细胞的消化。终止消化时，可用含血清的培养基或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞产生的作用。    四、内皮细胞涉及多个血管生物学的范畴，是众多科研研究的热点，它不仅能完成血浆和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。原代的内皮培养除了需要特制的内皮细胞完全培养基外在培养的时候还需要使用包被液，以促进细胞的贴壁和增殖能力，能更大量的得到更多的细胞。ScienCell牛血浆纤维连接蛋白直接从牛血浆纯化而来，未经过任何化合物干扰，使用可让细胞更自然的生长。    五、 原代细胞冻存很关键 ，因为一不留神就会复苏不活 ，一冻回到解放前，DMSO是常用的冻存细胞的试剂，但是因为其具有挥发性，毒性，不好掌控，而导致很多科研者在细胞冻存之后自我感觉冻存没有问题，但是复苏起来却一个活细胞也见不着。为了避免这种尴尬的问题出现，sciencell细胞冻存液 专为人源及动物源细胞冻存提供，此产品含DMSO、胎牛血清等细胞内外保护剂，在冷冻保存过程中进一步提高细胞活力。

细胞收到后，很多同学都会措手不及，这么个脆弱的东东，该怎么办，以下是我们整理的一些经验分享给大家。1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C，隔夜后，移到liq N2)。2. 冷冻细胞解冻程序:一、根据细胞说明书来配置培养基，不同的细胞株适应的培养基不同，请务必按细胞需求来配置。绝大多数的细胞均无法立即适应不同的基础培养基或不同的血清种类，所以当细胞换成你们自己的培养基生长状态变差或者速度变缓的时候，不要着急，可以静养一段时间。给细胞一个适应的时间，不要一日看三回，操之过急；如实验确实紧张，可以使用中乔新舟细胞株完全培养基，此培养基是按细胞精心优化，种类丰富，适合中乔新舟任意一株细胞的培养。若因实验需要，必须有所不同时， 请务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞生长适应后，方进行实验。二、FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞说明书选择相应的血清 ，这点很重要。细胞复苏的方法：三 、将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，以70%ethanol擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下的冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻的 细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO ， 去除DMSO的方法如下：可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。活细胞的处理方式︰1. 细胞在寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。收到后，请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知我们。2. 将原封的T25 flask细胞 静置于细胞 培养箱中，让细胞稳定一下，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。2-4小时后，无菌操作箱内取出flask内之培养基，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，如无需传代，请置于培养箱中继续培养，如细胞已达到85%以上的密度，请立即将细胞做传代处理。

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