【目的】掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。【原理】BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他 试剂组成的 试剂 ，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ，一个Cu+ 螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。【计算】（一） 绘制标准曲线。（二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。（三） 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。【优缺点】(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。(三) 经济实用，除 试管 外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响【器材】（一） 7220型分光光度计（二） 恒温水浴 箱（三） 中试管7支（四） 枪式移液管【试剂】1、 试剂A：1％BCA二钠盐2％无水碳酸钠0.16%酒石酸钠0.4％氢氧化钠0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25。2、 试剂B：4％硫酸铜。3、 BCA工作液：试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml混合4、 蛋白质标准液：用结晶牛 血清 白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）5、 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。

    酒精灯的火焰分为外焰、内焰、焰心三个部分。酒精灯火焰的外焰部分温度最高，焰心部分的温度最低。加热时应该用外焰部分加热。    给液体加热可以用试管、烧瓶、烧杯、蒸发皿；给固体加热可以用干燥的试管、坩埚、烧瓶等。    1、给试管里的物质加热，必须用试管夹夹持，将试管夹从试管底部往上套，夹持在试管中上部，手握试管夹的长柄，不要把拇指按在短柄上。给烧瓶或烧杯里的物质加热，要放在铁架台的铁圈上，垫上石棉网，使烧瓶或烧杯受热均匀，不致破裂。    2、如果被加热的玻璃容器外壁有水，应在加热前擦拭干净，然后加热，以免容器炸裂。    3、给试管里的固体加热，应该使试管在火焰上来回移动，如果试管需要固定，可移动酒精灯，试管均匀受热后，再将火焰固定在放固体的部分加热。    4、给试管里的液体加热，液体体积一般不要超过试管容积的1/3，加热时试管要倾斜（跟桌面成45°）角。加热时要先使试管均匀受热，再小心地对液体的中下部加热，并且不时地上下移动试管。为避免试管里液体沸腾喷出伤人，加热时切不可使试管口对着自己或旁人。    5、热的试管不能立刻用冷水冲洗。    管理窍门：    一般按用途可以分为通用试剂、高纯试剂、分析试剂、仪器分析试剂、临床诊断试剂、生化试剂、无机离子显色剂试剂等。有四种常用规格：    1.优级纯或一级品(GR 精密分析和科学研究工作)；    2.分析纯或二级品(AR 重要分析和一般研究工作)；    3.化学纯或三级品(CP 工矿及学校一般化学实验)；    4.实验试剂(L.P.)。大多数的试剂具有一定的毒性及危险性。对科研试剂的加强管理，不仅是保证分析结果质量的需要，也是确保人民生命财产安全的需要。试剂应根据毒性、易燃性、腐蚀性和潮解性等不同的特点，以不同的方式妥善管理。保存注意事项：低温、避光、干燥阴凉处封闭贮存，严禁与有毒、有害物品混放、混运。本品为非危险品，可按一般化学品运输，轻搬动轻放，防止日晒、雨淋。    我们提供的试剂产品品质优良，都是通过严格的检测体系认证。

(1)酸式滴定管不能装碱性溶液，碱式滴定管不能装酸性及氧化性溶液。(2)容量瓶不能长期存放溶液，更不能作为反应容器，也不可加热，瓶塞不可互换。(3)烧瓶、烧杯、锥形瓶不可直接加热。(4)用 pH试纸检测溶液时不能先润湿，不能用试纸直接蘸取待测液。试纸检验气体前需先湿润，试纸不能直接用手拿，要用镊子夹取。(5)药品不能入口和用手直接接触，实验剩余药品不能放回原处(K、Na等除外)，不能随意丢弃，要放入指定容器中。(6)中和滴定实验中锥形瓶不能用待测液润洗。(7)温度计不能代替玻璃棒用于搅拌，测液体温度时不能与容器内壁接触。(8)量筒不能用来配制溶液或用作反应容器，更不能用来加热或量取热的溶液。(9)用天平称量药品时，药品不能直接放在托盘上。(10)试纸不能直接用手拿，要用镊子夹取。(11)配制一定物质的量浓度的溶液时，定容摇匀后液面低于刻度线时不能再加蒸馏水。(12)做有毒气体的实验时，应在通风橱中进行，并注意对尾气进行适当处理，如吸收或点燃等。(13)检查装置气密性：构成密闭体系→改变体系压强→体系内是否出气或进气→通过现象判断气密性是否良好。

一.常用贮液与溶液1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。1mol/L氯-化钾（KCl）：溶解7.46g氯-化钾于足量的水中，加水定容到100ml。3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基-磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹或贮存于-20℃。20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。10％SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。100％三氯-乙酸（TCA）:在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。（稀释液应在临用前配制）2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液电泳缓冲液50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 2mol/L Tris碱 1mol/L 乙酸 100 mmol/L EDTA 水  242g 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L） 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L  5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 445 mmol/L 硼酸盐 10 mmol/L EDTA 水  54g 27.5g 硼酸 20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L  染料1％溴酚蓝（bromophenol blue）加1G-水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。凝胶上样液（gel loading solutions）6×碱性凝胶上样液（室温贮存）成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.3 N 氢氧化钠 6 mmol/L EDTA 18％聚蔗糖（400型） 0.15％溴甲酚绿 0.25％二甲苯青FF 水  300ul 10N 氢氧化钠 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.8g 15mg 25mg 补足到10ml  6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）成分及终浓度配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 15％聚蔗糖（400型） 水  1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.5g 补足到10ml  6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）成分及终浓度配制10ml溶液各成分用量 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型） 水  2.5ml 1％溴酚蓝 2.5ml 1％二甲苯青FF 1.5g  补足到10ml  6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）成分及终浓度配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 50％甘油 水  1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 3ml  3.9ml  6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存）成分及终浓度配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 40％聚蔗糖 水  1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 4g  补足到10ml  10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存）成分及终浓度配制10ml溶液各成分用量 0.2％溴酚蓝 0.2％二甲苯青FF 200 mmol/L EDTA 0.1％SDS 50％甘油  水  20mg 20mg 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100ul 10％ SDS 5ml 补足到10ml  三、常用抗生素1.  氨苄青霉素（ampicillin）（100 mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。2.  羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。3.  甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。4.  卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。5.  氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。6.  链霉素（streptomycin）（50mg/ml）溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。7.  萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。8.  四环素（tetracyyline）（10mg/ml）溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于 - 196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无-毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。二、细胞冻存与复苏操作步骤（一）冻存 1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm 离心 10 分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至 5×106/ml 左右。4、将悬液分至冻存管中，每管 1 ml。5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温→4℃（20 分钟)→冰箱冷冻室（30 分钟）→低温冰箱 (－30℃ 1 小时）→气态氮（30 分钟）→液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，不能挥发干净，一般 30 立升的液氮能用 1～1.5 月。（二）复苏 1.  细胞实验室进行常规消毒，紫外照射 40min 以上。2.  培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱 37°C 预热 20min，备用。3.  二甲基亚砜（DMSO) 在 40°C 冰箱中冷藏 30min，备用。4.  从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入 400°C 水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。5.  将细胞悬液移入 15ml 离心管，缓慢加入 4ml 培养液，离心（1000r/min，5min）。6.  用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。7.  记录复苏日期。三、注意事项1.  取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2.  冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无-毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在 1-2min 内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）选择进口产品。3.  离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4.  离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO 对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。5.  细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时 1ml 细胞液要加 10ml－15m 培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6.  复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏 1 管细胞一般可分装到 1-2 只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7.  加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是 DMSO 的浓度，从如果你加培养基的太少，那么 DMSO 的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO 的浓度在小于 0.5% 的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是 1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO 的话那么加 10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

植物DNA的提取和纯化是植物基因工程研究的基础操作。实施分子标记、基因图谱、基因指纹图谱、基因文库构建、遗传多态性分析、DNA重组、RAPD（随机引物多态性DNA）、RFLP（限制性酶多态性）、基因分离及遗传转化和鉴定等都以提取DNA为前提。目前，对从植物组织中提取DNA方法的要求是：简便、有效、快捷以及经济。与动物组织相比，植物组织含有较多的多糖和其他次生代谢产物（酚、酯、萜、色素等），这给高质量的DNA提取带来较多的困难。尤其是多糖成分是影响DNA纯度最常见的问题。如何做到既去除这些污染物又能相对保持高的产量，并且能简捷有效地提纯，一直是植物生物技术研究者探索的问题。对于普通的植物（低酚、低酯、低糖等）如：水稻、白菜、苋菜、南瓜、黄瓜、西红柿、上海青、菠菜、笋瓜、冬瓜、莲藕、山药、竹笋等；我们可以选用普通植物DNA提取试剂盒（磁珠法）试剂对于多糖、多酚类植物（香蕉、西瓜、苹果、梨等果肉，红薯、马铃薯等块茎，棉花、月季、枇杷、益母草、夏枯草等人参、曼陀罗、向天果、射干、桔梗、满山红、金鸡纳霜等药用植物）可以选用多酚植物DNA提取试剂盒（磁珠法）试剂，针对类似的植物我们经过长期的优化，可以得到较好的实验结果。以叶片为例，叶片需先剪碎成小块，以便放入1.5ml离心管。最佳样本的长度应在1cm 以下。重量不超过250mg，推荐使用50mg，如果是植物种子粉末可以使用10mg-20mg粉末即可。一、匀浆介质 一般采用 0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS），客户可根据样本及测定方针的状况自行设定浓度，目的是坚持样本的等渗环境。 二、组织匀浆的制备 1、取组织块（0.2g～0.5g）可到 5～10mg 在严寒的 PBS 中漂洗，滤纸拭干，称重，放入 5ml 的匀浆管中。 2、按重量 (g)：体积 (ml)=1:4 的比例参与 4 倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下，用眼科小剪赶快剪碎组织块。  3、匀浆的方法：手工匀浆，机器匀浆。 ① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端刺进盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆笔直刺进套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充沛研碎，制成 20% 的匀浆液。 ② 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000 转 / 分 上下研磨制成 20% 组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒 / 次，空隙 30 秒，接连 3～5 次，在冰水中进行，可适当延伸匀浆时间），4、将制备好的 20% 匀浆液用一般离心机或低温低速离心机 4000 转 / 分左右，离心 10～15 分钟，取上清液进行测定. 三、样本保存植物组织样本暂时不测定，可立即低温冻存，温度越低越好，中心如不重复冻融，-20 ℃ 以下可保存三个月，-70 ℃ 以下可保存六个月。 制备好的匀浆液主张不要冻存，当天进行测定，如放置时间过长相关酶活会有所下降，部分方针 4 ℃ 可存放 3～5 天（如 SOD 要存放 2～3 天，MDA 可存放 3～5天，总蛋白测定可存 5～7 天）。

临床常用的抗生素包括β- 内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类、抗结核药、抗真菌药及其他抗生素。β- 内酰胺类此类属于繁殖期杀菌剂。其特点是：血药浓度高、抗菌谱广和毒性低。包括青霉素类、头孢菌素类、新型β- 内酰胺类及β- 内酰胺类与β- 内酰胺酶抑制剂组成的复合制剂。青霉素类青霉素 G：临床上主要用于肺炎球菌、溶血性链球菌及厌氧菌感染，金黄色葡萄球菌和流感杆菌多数对其耐药。普鲁卡因青霉素 G 半衰期较青霉素长。青霉素 V 钾片耐酸，可口服，使用方便。双氯青霉素：对产酸耐青霉素 G 的金黄色葡萄球菌抗菌活性最-强，对其它 G+ 球菌较青霉素 G 差，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）无效。阿莫西林：抗菌谱与氨苄青霉素相似，肺炎球菌、溶血性链球菌、肠球菌和流感杆菌对本药敏感，抗菌作用优于氨苄青霉素，但对假单胞菌无效。广谱抗假单胞菌类：对 G+ 球菌的抗菌作用与青霉素 G 相似，对 G- 杆菌（如大肠杆菌、变形杆菌、流感杆菌等）及假单胞菌有很强的抗菌作用，尤其哌拉西林、阿洛西林、美洛西林抗菌活性geng强。抗 G- 杆菌类：只用于抗 G- 杆菌，对 G+ 球菌及假单胞菌无效。头孢菌素类此类属广谱抗菌药物，分四代。第1、二代对绿脓杆菌无效，第三代中部分品种及第四代对绿脓杆菌有效，该类药物对支原体和军团菌无效。第1代头孢菌素：包括头孢噻吩 \ 氨苄 \ 唑林 \ 拉定。对产酸金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、溶血性链球菌等 G+ 球菌抗菌活性较第二、三代为强，对 G- 杆菌的作用远不如第二、三代，仅对少数肠道杆菌有作用。对β- 内酰胺酶稳定性差，对肾有一定毒性。对绿脓杆菌、变形杆菌、不动杆菌等无效。其中头孢唑林 \ 拉定较常用。第二代头孢菌素：包括头孢呋辛 \ 克罗 \ 孟多 \ 替安 \ 美唑 \ 西丁等。对 G+ 球菌包括产酸金黄色葡萄球菌抗菌活性与第1代相似或略弱，对 G- 杆菌较第1代强，但不如第三代。对流感杆菌有很强的抗菌活性，尤其是头孢呋辛 \ 孟多，对绿 脓杆菌、沙雷菌、阴沟杆菌、不动杆菌无效。除头孢孟多外，对 β- 内酰胺酶稳定。第三代头孢菌素：包括头孢他定 \ 三嗪 \ 噻肟 \ 哌酮 \ 地嗪 \ 甲肟 \ 克肟等。对产酸金黄色葡萄球菌有一定活性，但较第1、二代为弱，对 G- 杆菌包括沙雷菌、绿脓杆菌有强大的抗菌活性，其中头孢他定抗菌谱geng广，抗绿脓杆菌作用最-强，其次为头孢哌酮。头孢地嗪对绿脓杆菌、不动杆菌、类肠球菌无效。除头孢哌酮外，对 β- 内酰胺酶稳定，肾毒性少见。第四代头孢菌素：包括头孢匹罗 \ 吡肟 \ 唑喃等。抗菌作用快，抗菌活力较第三代强，对 G+ 球菌包括产酸金黄色葡萄球菌有相当活性。对 G- 杆菌包括绿脓杆菌与第三代相似。对耐药菌株的活性超过第三代。头孢匹罗对包括绿脓杆菌、沙雷菌、阴沟杆菌在内的 Gˉ 杆菌的作用优于头孢他定。头孢吡肟对 G+ 球菌的作用明显增强，除黄杆菌及厌 氧菌外，对本品均敏感。对β- 内酰胺酶geng稳定。新型 β- 内酰胺类包括碳青霉烯类（亚胺培南、帕尼培南、美洛培南）和单环 β- 内酰胺类（氨曲南、卡芦莫南）。泰能（亚胺培南 / 西司他定）：抗菌谱极广，对 G- 杆菌、G+ 球菌及厌氧菌，包括对其他抗生素耐药的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、脆弱拟杆菌均有极强的抗菌活力，对多数耐药菌的活性超过第三代头孢菌素。对各种β- 内酰胺酶高度稳定。氨曲南：对多数 G- 杆菌包括肠杆菌科和绿脓杆菌均有良好的抗菌作用，但对 G+ 球菌及厌氧菌无效，对 β- 内酰胺酶稳定。β- 内酰胺酶抑制剂β- 内酰胺酶抑制剂能够与细菌产生的 β- 内酰胺酶行自-杀性结合，从而保护 β- 内酰胺不被 β- 内酰胺酶所水解，继续发挥抗菌作用。临床上常用的β- 内酰胺酶 抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦，它们与 β- 内酰胺类组成复合制剂，对耐药菌株可增强杀菌效果，并可使抗菌谱扩大。常用的品种有安灭菌（阿莫西林加克 拉维酸）、特美汀（替卡西林加克拉维酸）、优立新（氨苄青霉素加舒巴坦）、舒普深（头孢哌酮加舒巴坦）和他唑西林（哌拉西林加他唑巴坦）。氨基糖苷类此类属静止期杀菌剂。常用的有阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星、西索米星及链霉素。主要抗 G- 杆菌，包括绿脓杆菌、肠杆菌科细菌、沙雷菌、不动杆 菌等。阿米卡星作用最-强。抗 G+ 球菌也有一定活性，但不如第1、二代头孢菌素。对葡萄球菌的抗菌活性以奈替米星作用最-强，对结核杆菌以链霉素最-好。对厌氧菌无效。此类药物对听神经和肾有毒性作用，使用受到一定的限制。大环内酯类属窄谱速效抑菌剂，抗菌谱与青霉素 G 相似，主要为需氧的 G+ 球菌、G- 杆菌及厌氧球菌。军团菌、支原体、衣原体及部分流感杆菌对此类药物敏感。对绿脓杆菌、大多数肠杆菌科细菌无效。新大环内酯类包括罗红霉素、克 拉霉素和阿奇霉素，与红霉素相比，抗菌谱没有明显扩大，但药物代谢动力学改善和副作用减少是其明显进步。阿奇霉素对 G+ 球菌作用比红霉素差，对 G- 杆菌比 红霉素强，尤其对社会获得性肺炎（CAP）的常见致病菌、流感杆菌、支原体、衣原体和军团菌均有很好的抗菌活性，可作为 CAP 治疗的第1选择。四环素类属广谱抗生素。因常见致病菌多已耐药，现在仅用于支原体、衣原体、立克次体及军团菌感染，多西环素和米诺环素抗菌谱同四环素，但抗菌作用比四环素强 5 倍，米诺环素作用geng强，对多数 MRSA 有效。林可霉素类包括林可霉素、氯林可霉素，抗菌谱较窄，抗菌作用与红霉素相似，氯林可霉素抗菌活性较林可霉素强 4-8 倍，主要用于金黄色葡萄球菌和厌氧菌感染。多肽类包括多粘菌素 B 、多粘菌素 E 、万古霉素、去甲万古霉素及壁霉素。多粘菌素 B 和 E ，肾毒性大，疗效差，只用于严重耐药的 G- 杆菌感染。万古霉素和去甲万古霉素属于繁殖期杀菌剂，对包括多重耐药的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、粪链球菌等 G+ 球菌有高度抗菌活性，对 G- 杆菌多数耐药。壁霉素抗菌谱与抗菌作用与万古霉素相似，但对表皮葡萄球菌稍差，对肠球菌和难辩梭菌强于万古霉素。喹诺酮类包括诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、氟罗沙星、依洛沙星、洛美沙星、司帕沙星、格雷沙星、芦氟沙星、克林沙星、巴罗沙星、曲伐沙星等。抗菌谱与第三代头孢菌素相似而较广，对 G- 杆菌抗菌活性较 G+ 球菌强，与环丙沙星、氧氟沙星相比，新喹诺酮类在保持原有对 G- 杆菌良好抗菌活性的同时，对 G+ 球菌抗菌活性增强，以克林沙星、曲伐沙星最-强。对 G+ 厌氧菌抗菌活性也有所增强，其中曲伐沙星较甲硝唑高 10 倍以上，被认为是目前喹诺酮类对 G+ 厌氧菌抗菌活性最-强者。对其他呼吸科常见病原体的抗菌活性也有不同程度的提高，如司帕沙星对结核杆菌抗菌活性较环丙沙星强 4-8 倍，对其他分支杆菌、 军团菌、支原体、衣原体及 MRSA 均具有相当活性。临床上多用于院内感染，尤其对其他抗生素耐药的 G- 杆菌及 MRSA 感染等。近年来，细菌耐药率日益增加，尤其以肠杆菌、MRSA 和绿脓杆菌最-为显著。本类药物可使细菌在各品种间产生交叉耐药，并对其它抗生素，如β- 内酰胺类药物产生耐药。故选用时应注意选择适应证。喹诺酮类药物新的分类法是将原来的第1、二代合称第1代，代表药物有萘啶酸、吡哌酸，抗菌谱为 G- 杆菌，用于尿路和肠道感染；将比较早期开发的氟喹诺酮类药物总称为第二代，代表药物有氧氟沙星、环丙沙星，抗菌谱为 G- 杆菌为主，用于各系统感染。第三代是在第二代的基础上增加了抗 G+ 球菌的活性，代表药物有司帕沙星、帕苏沙星，抗菌谱包括 Gˉ 杆菌和 G+ 球菌，用于各系统感染；第四代是在第三代的基础上增加了抗厌氧菌的活性，代表药物有曲伐沙星、莫西沙星，抗菌谱包括 G- 杆菌、G+ 球菌和厌氧菌，用于各系统感染。第三、四代与第二代相比，主要是增加了对 G+ 球菌、厌氧菌、支原体、结核杆菌、军 团菌的抗菌活性，可作为 CAP 的第1线治疗用药。磺胺类常用的有复方新诺明，多用于轻、中度细菌感染和衣原体感染，是卡氏肺孢子虫病的首-选药物。抗结核药常用的有异烟-肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素等。异烟-肼是抗结核首-选药物，是一个细胞内外结核菌的全效杀菌剂，对繁殖期细菌效果较好，对静止期细菌效果差。利福平对结核菌有很强的抗菌活性，作用在繁殖期和静止期细胞内和细胞外，为全效杀菌剂。吡嗪酰胺为细胞内及酸性环境中的强效杀菌剂，乙 胺丁醇对繁殖期细菌有抑菌作用。异烟-肼、利福平和吡嗪酰胺是组成初始短程化疗方案的最主要药物，乙胺丁醇（或链霉素）可参与短程化疗方案的组成。以上药物 联合应用，可增加疗效，延缓耐药性产生。抗真菌药包括两性霉素 B 、氟康唑、伊曲康唑及 5- 氟胞嘧啶等。两性霉素 B 是最-强的广谱抗真菌药，尽管其毒副作用大，但仍是深部真菌感染的首-选药物之一，对新型隐球菌、组织胞浆菌、球孢子菌、念珠菌及曲霉菌等有较强的抗菌活性。氟康唑是广谱抗真菌药，对大部分念珠菌属、隐球菌屈和孢子菌属等有高效，但对曲霉 菌无效。伊曲康唑口服吸收好，抗菌谱广，对曲霉菌也有明显活性，毒副作用小。5- 氟胞嘧啶抗菌谱窄，对新型隐球菌、白色念珠菌有较强抗菌活性，对某些曲霉菌也有一定作用，与两性霉素 B 或氟康唑合用，可以提高疗效，防止耐药性产生。其他抗菌药物如磷霉素，抗菌谱广，但抗菌作用不强，毒性低。甲硝唑、替硝唑，对各种专性厌氧菌有强大的杀菌作用，疗效明显优于林可霉素，对需氧菌或兼性厌氧菌无效，可与其它抗生素联合应用治疗混合感染。 

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。1. PC12细胞有两种：未分化型和分化型。其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强，传代时需要胰酶消化，形状不规则。分化型PC12细胞传代时不需要胰酶，直接可以吹下来，形状规则。这两种细胞没有很大的区别，但我在实验中发现，未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。2. 由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，在传代次数较多后，它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。主要是细胞形状变得更加不规则，对药物的敏感性愈加下降。因此，建议长期用PC12细胞作实验的战友zui好严格控制细胞的传代次数。3.在复苏细胞时动作一定要迅速，放入温水中1～2min后要马上加入培养液中，培养12～24小时后更换一次培养液，这样不仅可以把DMSO吸掉，而且可以将死亡的细胞也吸掉。细胞一天一看即可，经常动会有影响。注意过滤后血清的PH值，因为培养液过滤后PH值会有所改变。复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些）4. 状态良好的细胞复苏后 4 h即可贴壁，开始增殖，大约2 d即可传代，接种48h应该到了对数增长期。5. 每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。6. 传代时我认为zui好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS）7. 传代的时机zui好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时zui好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，zui后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。8. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。9. 就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。

姐妹染色单体区分染色法 (Sister chromatid differentiation ， SCD ）是 70 年代中期发展起来的染色体处理技术。 Latt （ 1973 ）在培养的细胞中加入 5- 溴脱氧尿嘧啶核苷（ BrdU ），当用 Hoechst33258 荧光染料染色时，发现了姊妹染色单体的色差反映和它们之间互换的现象。1974 年 KO Renberg 和 Froeed-Lender 改进了这一技术，建立了较简易的 BrdU-Giemsa 技术。这种技术用于研究细胞周期、染色体半保留复制、染色体的分子结构和畸变，以及 DNA 的复制、损伤与修复等一系列重要理论问题，还可以用于分析姊妹染色单体互换（ Sister chromatid exchange, SCE ）频率。由于 SCE 能灵敏地检测染色体的变化，表现出剂量 - 效应关系。因此，目前已把 SCE 列为检测致突变物、致癌物地常规指标之一。一、原理5- 溴脱氧尿嘧啶核苷（ 5-Bromodeoxy-urdine, BrdU ）在 DNA 的复制过程中，掺入新合成的链并占有胸腺嘧啶（ thymidine, T ）的位置。根据 DNA 的半保留复制规律，哺乳动物或人的细胞在 BrdU 的培养液中经历了两个周期后，它的两条姊妹染色单体的 DNA 双链在化学组成上有了差别。当染色体的 DNA 链的两条多核苷酸链都被 BrdU 所替换， Giemsa 染色显示浅色，如果染色体的 DNA 链中仅有一条多核苷酸链被 BrdU 所替换， Giemsa 染色显示深色。应用姊妹染色单体区分染色法（ SCD ）研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换，称为姊妹染色单体互换。二、用品和试剂45 ℃水浴，紫外线灯（ 20W ）。余同外周血染色体制备。试剂： BrdU 溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下称取 BrdU 2mg ，然后在无菌室内加入无菌生理盐水 4ml ，用黑纸避光， 4 ℃冰箱保存，新鲜配置。 1 × SSC 溶液： 0.15mol/L NaCl ， 0.015mol/L 柠檬酸钠。三、操作步骤l ．细胞培养：常规培养人外周血淋巴细胞， 24h 后，加入 BrdU 使其终浓度为 20 μ g/ml 。2 ．继续避光培养 48 小时，终止培养前 2 — 3 小时加秋水仙碱。3 ．培养结束收获细胞，常规制备染色体，操作同实验一。4 ．染色体制片在 37 ℃恒温箱内老化 24 小时或室温放置 1 — 2 天。5 ．将染色体制片的玻片正面向上平铺在恒温（ 45 ℃）水浴锅上，在玻片上滴加已预热至 45 ℃的 1 × SSC 溶液。6 ．将紫外灯放在恒温水浴上，灯与标本垂直，其外加盖报纸数张以阻挡紫外线。照射距离为 6cm ，时间 15min 。7 ．照射完毕后以蒸馏水洗去 1 × SSC 。8 ． 1 ∶ 10 Giemsa 染色 5 分钟。9 ．自来水细流冲洗去多余染料，干燥，镜检。10 ．计数 SCE 。选择染色体分散较好，数目为 46 的中期分裂相 20 个进行观察计数，凡在染色单体端部出现的互换计为一次 SCE ，在染色单体中间出现的互换计为两次 SCE 。凡在着丝粒部位发生一次互换，判断不是两条染色单体在着丝粒部发生的扭转，计为一次 SCE ，但另列入“着丝粒区互换（ CME ）”一项。

衰老是一个永恒的话题，也是科研热点。运动锻炼能延缓衰老，但老年群体由于身体虚弱或健康状态不佳，会降低锻炼的能力或意愿。如通过合适的干预延缓大脑的衰老，可有助于降低年龄相关神经退行性疾病的发生率。因此，找出运动缓解衰老的分子机制，开发防治年龄相关神经退行性疾病的药物，对改善老年群体的健康状况具有重要的意义。2020年7月，加州大学旧金山分校Saul A. Villeda等研究团队在《Science》（IF=41.8）上发表了题为“Blood factors transfer beneficial effects of exercise on neurogenesis and cognition to the aged brain”的研究文章，首先利用蛋白组学和过表达动物模型发现和明确了蛋白酶Gpld1是运动改善老年小鼠神经元功能的关键因子，然后利用蛋白组学和酶活突变体探究和验证了Gpld1的调控机制，阐明了Gpld1在运动缓解神经元衰老中的作用与机理，为防治年龄相关的神经退行性疾病提供了新的方向和理论依据。研究材料1、老年运动小鼠（18月龄，连续跑步6周）和老年静坐小鼠（18月龄）血浆；2、老年运动小鼠，老年静坐小鼠，成年运动小鼠（7月龄）和成年静坐小鼠（7月龄）血清和各器官组织；3、老年运动人群和老年静坐人群血清；4、Gpld1过表达小鼠（Gpld1）和对照组小鼠（Ctrl）血清及海马组织；5、Gpld1酶活突变体小鼠（H133N），Gpld1过表达小鼠（Gpld1）和对照组小鼠（Ctrl）血清及海马组织。技术方法iTRAQ 、Label-free蛋白组学、免疫组化、qPCR、Western Blot等研究结果老年运动组血浆可改善小鼠海马区受损的神经元和认知能力分别取老年运动组及老年静坐组小鼠血浆注射到另一组老年静坐小鼠，检测发现：注射运动组血浆可同时增加老年小鼠海马新生神经元和成熟神经元的数量，并增高海马区神经营养因子BDNF的表达，以及改善老年小鼠海马依赖性学习记忆障碍。说明运动改善神经元功能的因子。运动组血浆对小鼠海马区神经元和认知影响蛋白组学筛选功能蛋白通过蛋白组和WB验证发现运动组（老年/成年）对比静坐组（老年/成年）血清中Gpld1的表达水平显著增加，并且在老年人群（运动组VS静坐组）血清样本中得到了验证。说明Gpld1很有可能参与了运动改善神经元功能的作用。运动组和静坐组血清中蛋白表达差异Gpld1功能验证作者先是在各器官组织中检测发现Gpld1在肝脏中高表达，并且运动组肝脏中的表达比静坐组更高。通过高压尾静脉注射Gpld1-GFP质粒构建肝脏Gpld1过表达模型，发现肝脏中过表达Gpld1也可以改善神经元功能。Gpld1对神经元功能的改善作用Gpld1作用机制探究为探究Gpld1的作用机理，作者通过蛋白组学分析发现：过表达Gpld1组血清中表达差异最大的40个蛋白在uPAR信号通路有富集，而uPAR是GPI的锚定底物。提示Gpld1可能通过水解GPI-锚定底物发挥运动改善神经元功能的作用。Gpld1过表达后血清中差异蛋白表达分析Gpld1酶活突变体功能验证为验证Gpld1通过酶解作用改善神经元功能，作者通过构建突变体Gpld1过表达模型发现：Gpld1-H133N过表达不能改善神经元功能，而野生型Gpld1过表达可以改善神经元功能。说明Gpld1是通过酶活发挥改善神经元功能的作用。Gpld1-H133N过表达对神经元功能的影响小结本研究从运动引起的差异表达蛋白入手，通过构建关键蛋白的过表达模型验证了Gpld1改善神经元功能的作用，再通过蛋白组检测Gpld1过表达引起的蛋白表达谱改变探究其作用机理，最后通过酶活突变体验证Gpld1通过酶活发挥对神经元功能的改善作用。该篇文章展示了非常经典的研究模式：蛋白组学筛选-功能验证-组学机制探究-机制验证，发现并验证了Gpld1在运动改善神经元功能中的作用和机制，为开发老年人群抗神经衰老药物提供了非常有价值的研究基础和理论依据。

大多数神经元是在胚胎发育过程中产生的，出生后并没有“备份”。研究人员普遍认为，它们的存活几乎是由外在因素决定的，或者是由外界的力量决定的，比如神经元向神经细胞供应的组织和细胞。加州大学河滨分校的生物医学科学家Sika Zheng领导的一个研究小组对这一概念提出了挑战，并报告称神经元的持续生存在发育过程中也具有内在的程序性。这项发表在《Neuron》杂志上的研究指出了一种机制，研究人员说，这种机制在神经元出生时就被触发，从而内在地减少一种普遍形式的细胞死亡（凋亡）。当这种基因调控停止时，持续的神经元存活被破坏，就会导致动物死亡。一个有机体的生存、大脑功能和健康都依赖于它的神经元的存活。在高等生物中，神经元控制呼吸、进食、感觉、运动、记忆、情绪和认知。它们可能死于许多非自然原因，如神经退行性疾病、损伤、感染和创伤。神经元是长寿的细胞，但使其长寿的基因控制机制尚不清楚。Zheng的研究小组现在报告说，这一机制的核心部分是Bak1基因序列的一小部分，Bak1是一种促凋亡基因，其激活可导致细胞凋亡。当一个被称为微外显子（microxon）的基因序列片段被拼接到最终的Bak1基因产物中时，Bak1的表达被关闭。外显子是组成信使RNA的序列。“在所有后生动物中，细胞凋亡是一种控制细胞更新和组织内稳态的途径，”生物医学Zheng副教授解释说。“大多数非神经细胞容易参与凋亡，以响应内在和外在的压力。但这种细胞自杀计划需要控制神经元，使它们能活很多年。我们现在展示了神经细胞凋亡的遗传衰减是如何发生的。”Zheng教授的研究小组通过对人类组织、小鼠组织、人类发育中的大脑、小鼠发育中的前脑和发育中的小鼠中脑的表达数据进行大规模分析，确定了Bak1的微外显子。研究小组首先比较了人类和小鼠的神经组织和非神经组织，以确定神经特异性外显子。然后，他们发现大脑皮层神经元在神经元诞生之初就降低了对凋亡的敏感性。他们还发现，在神经元发育过程中，在神经元建立连接或激活其他细胞之前，细胞凋亡逐渐减少，这表明除了外部信号以外的因素也可能起作用。“我们展示了神经元在发育过程中如何调节细胞死亡，”Zheng说。“这是为了确保神经元的寿命，这是维持大脑功能神经回路完整性所必需的。”下一步，他的团队将研究在导致神经元细胞死亡的神经退行性疾病和损伤中这种机制是否被激活。

一、酶免疫组化的关键环节1、标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。5、细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最-佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。9、抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮-化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在geng换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）11、DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最-好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。12、复染：目的是形成细胞轮廓，从而geng好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。二、免疫荧光方法中的重要环节1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最-佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而geng好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9、拍照：有条件的话最-好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最-好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性 小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平（3H-TdR掺入率）的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性 小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体，在IL-1诱导下产生高水平的IL-2，通过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性，从而反映检测样品中IL-1的水平。实验材料：ConA EL4细胞 CTLL-2细胞试剂、试剂盒     FCS RPMI1640 3H-TdR PPO POPOP 二甲苯仪器、耗材     滤纸 收集仪 计数仪 96孔板 吸管 滴管 试管 加样器 CO2培养箱实验步骤：一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性1.  取6～8 周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为1.5×107 /ml　　　　　　　　　　　　　　　　2.  细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3 μg/ml，在96孔培养板中加100 μl（1.5×106细胞）　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.  加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品100 μl/孔（ConA终浓度为1.5 μg/ml），37 ℃  CO2孵箱 66 h　　　　　　　　　　　　4.  每孔加3H-TdR 0.5 μci，37 ℃ CO2孵箱 6 h　　　　　　　　5.  多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上　　　　　　　　　　　　　　　　　　6.  烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数　7.  计算（1）从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位　　（2）也可用刺激指数（SI）表示 　　实验组cpmSI＝──────　×100％　    对照组cpm二、应用 EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性 1.  用EL4细胞两步法检测IL-1活性　　　　　　　　（1）收集处于对数生长期的EL4细胞　　　　　　　　　　　　　　　（2）洗涤后，用1 ％FCS RPMI1640重悬细胞，并调整细胞浓度2×106 /ml　　　　　　　　　　　　　　　　（3）加处96孔板中，100 μl/孔　　　　　　　　　　　　　　　（4）加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β，100 μl/孔，同时设1 ％FCS RPMI 1640对照　　　　　　　　　　　　　　　　（5）5 ％CO2 37 ℃培养18～24 小时　　　　　　　　　　　　　　　（6）按终稀释度为1∶10～20转入另一块96孔板中　　　　　　　　　　　　　　　　（7）用CTLL-2 检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测"2.  用EL4细胞一步法检测IL-1活性　　　　　　　　（1）用5 ％FCS RPMI 1640调整EL4细胞浓度至2×105 /ml，CTTL-2浓度至4×105 /ml　（2）加入96孔板中，两种细胞各加50 μl/孔　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（3）加入不同稀释度的IL-1或待测样品，同时设EL4和CTLL-2细胞对照    　　　　　　　　　　　　　　（4）置5 ％CO2，37 ℃培养24～28 小时后加入3H-TdR，0.5 μci/50 μl/孔，继续培养6～8 小时　　　　　　　　　　　　　　　　　 （5）收集样品，β计数注意事项 ：一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性1.  不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。 2.  不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一，一般选用6～8 周龄，小于5 周或大于10 周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。　　3.  ConA促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性　1.  在一步法检测IL-1时，其EL4细胞浓度不宜超过1×104 /孔，血清终浓度应＜5％。　　2.  在二步法检测IL-1时，其EL4细胞浓度在2×105 /孔时，转移上清稀释度不宜低于1∶8，其诱导时间应12～24 小时间为佳。诱导血清浓度应≤1％。　　3.  在检测经诱导的上清中IL-1时，应避免使用A23187，TPA和ConA等较强的能诱导EL4细胞产生IL-2的诱导剂来刺激IL-1的产生。

由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子（cytokine，CK）是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。重组细胞因子要求：1. 真实性：重组蛋白产品一致经过N末端氨基酸序列分析；必要时应用SDS-PAGE, RP-HPLC和质谱(MS)检测其真实性。2. 纯度：应用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析产品纯度。3. 生物活性：进行相应的体外(in vitro)或体内(in vivo)活性检测。4. 蛋白含量：通过紫外光谱分析，SDS-PAGE电泳检测；必要时应用HPLC定量标准蛋白溶液。5. 内毒素：kinetic LAL法检测内毒素。6. 微生物：重组蛋白在装瓶之前都经过滤除菌处理。重组细胞因子的状态：市场上主流的重组蛋白产品，多在不含载体蛋白或其他添加物(如BSA、HAS、蔗糖等)的条件下，以低盐的形式做冻干处理，因此微量(多以微克计量)的细胞因子在冻干过程中会沉积于管内，形成很薄或不可见的蛋白层，所以建议在收到试剂后，务必于开盖前先离心20-30秒，使可能附于管盖或管壁的蛋白成分聚集于冻干馆的底部(此时能否见到白色沉淀均属正常现象)。现我司促销产品：甲基丙烯酸异癸酯/甲基丙烯酸异癸酯吴茱萸次碱84-26-4标准胎牛血清（碳吸附过滤）酵母粉琼脂大鼠血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)ELISA试剂盒醛品红染色液辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG小鼠细胞膜表面免疫球蛋白(SmIg)ELISA试剂盒蛋白胨琼脂培养基CAS:65039-10-3,氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑CAS:920-66-1,六氟异丙醇价格CAS:63700-19-6,尿苷二磷酸葡糖醛酸现货供应大鼠5羟色胺(5-HT)ELISA检测试剂盒人5羟色胺(5-HT)ELISA检测试剂盒说明书人转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA检测试剂盒说明书小鼠转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA检测试剂盒,进口elisa试剂盒大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA检测试剂盒,进口elisa试剂盒价格小鼠白介素6(IL-6)ELISA试剂盒说明书小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒说明书小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒说明书pUC18gelgreen核酸染料抗A抗B血型定型试剂（单克隆抗体）乙肝表面抗原/HBSAg活动时间：即日起至2020年8月15日结束除以上产品外更有生化试剂、elisa试剂盒、标准品/对照品、质粒相关产品的钜惠活动！！！具体折扣详情,请咨询我司销售人员!活动规则:1、本次活动不限用户种类，所有人都可参与参与；2、数量有限，先到先得。3、所赠产品与购买产品享受相同的技术支持服务.4、活动最终解释权归我司所有。

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。具体方法：1、PCR混合物的制备Taq buffer（10×） 20 uldNTP（2.5 mM） 5 ulPrimer Forward（50 mM） 10 ulPrimer Reverse（50 mM） 10 ulddH 2O 147 ulTaq（2U/ul） 8 ultotal 200 ul将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。3、将混有菌体的PCR混合物置于 PCR仪 中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

实验方法原理 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实验材料细胞样品试剂、试剂盒RNA提取试剂盒 荧光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯-仿 逆转录酶MMLV 异-丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 琼脂糖 溴化乙锭 MOPS 甲醛 乙酸钠 EDTA EB 溴酚兰仪器、耗材离心管 离心机 风光光度计 电泳槽 凝胶板 Realtime PCR仪实验步骤一、 样品RNA的抽提1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯-仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯-仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异-丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。二、 RNA质量检测1.  紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 （1）浓度测定A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定（1）制胶1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲-醛溶液(12.3 M)。10x MOPS电泳缓冲液浓度  成分0.4 M  MOPS，pH 7.00.1 M  乙酸钠0.01 M  EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。（2）准备RNA样品取3 ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个geng小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即geng高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。三、样品cDNA合成1.  反应体系序号          反应物           剂量1          逆转录buffer       2 ul2         上游引物              0.2 ul3         下游引物              0.2 ul4          dNTP                   0.1 ul5       逆转录酶MMLV     0.5 ul6         DEPC水              5 ul7          RNA模版            2 ul8           总体积               10 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。2.  混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 ul，37℃水浴60分钟。3.  取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR1.  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 ul并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。2.  反应体系如下：标准品反应体系序号           反应物                           剂量1       SYBR Green 1 染料             10 ul2       阳性模板上游引物F              0.5 ul3      阳性模板下游引物R              0.5 ul4                 dNTP                            0.5 ul5                 Taq酶                           1 ul6           阳性模板DNA                    5 ul7              ddH2O                            32.5 ul8               总体积                            50 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。3.  管家基因反应体系：序号            反应物                                剂量1      SYBR Green 1 染料                   10 ul2      内参照上游引物F                         0.5 ul3     内参照下游引物R                         0.5 ul4               dNTP                                    0.5 ul5               Taq酶                                   1 ul6      待测样品cDNA                             5 ul7              ddH2O                                  32.5 ul8             总体积                                    50 ul轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃?2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1.  针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。2.  反应体系序号                     反应物                        剂量1                     10× PCR缓冲液            2.5 ul2                           MgCl2 溶液              1.5 ul3                           上游引物F                 0.5 ul4                           下游引物R                0.5 ul5                            dNTP混合液            3 ul6                            Taq聚合酶               1 ul7                             cDNA                       1 ul8                    加水至总体积为               25 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。六、 待测样品的待测基因实时定量PCR1.  所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。2.  体系配置如下：序号             反应物                                剂量1            SYBR Green 1 染料               10 ul2                上游引物                               1 ul3                下游引物                               1 ul4                  dNTP                                   1 ul5              Taq聚合酶                               2 ul6             待测样品cDNA                        5 ul7                   ddH2O                              30 ul8                   总体积                               50 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，zui后72℃7分钟延伸。七、 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。八、电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。注意事项1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。2.Ct值：在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极-好的重复性。其他实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极-好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量zui准确，重现性zui好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

做蛋白研究的小伙伴都知道，一个完整的Western Blot包括了很多个步骤，从蛋白提取到配胶、上样电泳，再到转膜、封闭，最后孵育一抗二抗后才能去进行检测。时间跨度非常长，而且这中间的每一步都包含了很多的小细节，稍有不慎就会导致结果出错，然后又得从头来过。所以，关于WB，几乎每一位经验丰富的实验老手都有着一本厚厚的血泪史。今天，小编就带领大家简要梳理一遍WB流程中的一些细节，避免因某一环节出现差错而导致实验重做。Western Blot概述Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体发生免疫反应，一抗再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。由于Western blot技术服务具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。一：样品的获取与制备一般来说我们检测的样品主要为细胞或者是组织，制备过程中尽量保持低温。其次在制备时一定要根据目的蛋白的特性选择合适的裂解液，比如对膜蛋白的提取、胞浆蛋白的提取和组织蛋白的提取等。二：配胶、上样及蛋白电泳配置凝胶时一定要将胶板清洗干净，用ddH2O或者无水乙醇润洗。晾干后根据蛋白分子量进行不同浓度凝胶配制。上样时需对蛋白进行煮沸变性，如果进行定量分析一定要将所有蛋白上样量调至相同。电泳时低压（80V）跑浓缩胶，高压（120v）跑分离胶，至溴酚蓝即将跑出胶面时终止电泳。三：转膜及封闭转膜时需提前配置好转膜液并低温放置。关于印迹膜来说，目前大多实验室用的是PVDF膜，根据目的蛋白大小选择合适的孔径，大于20KDa的蛋白选用0.45μm的膜，小于20KDa的蛋白选用0.2μm的膜。PVDF膜在使用时需用甲醇处理活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。转膜时一定要注意膜和凝胶的正反问题，除此之外一定要注意凝胶和转印膜间不要留有气泡。封闭液可选择5%的BSA或5%的脱脂奶粉，可以室温封闭1-2h或者4℃过夜封闭。封闭时一定要注意对磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉封闭膜，只能用5% BSA。四：抗体的孵育和检测一抗二抗的选择一定要注意种属来源问题，如果这一步出错那前面的努力就相当于白费了。检测方法可以选择灵敏度超高的化学发光方法或者现在比较流行的荧光WB法。相较于传统的化学发光方法，荧光WB能够实现更精准的定量，还可以进行多重检测，只需要将不同的目的蛋白标记上不同的荧光就可以了。基于目前各大期刊杂志对WB发表的要求，全蛋白定量是一种新的趋势，荧光WB同样可以实现全蛋白归一化。

转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA （质粒和线性双链DNA ），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。转化特指将质粒DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。由外来DNA 引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA 注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。载体:能在连接酶的作用下和外源DNA 片段连接并运送DNA 分子进入受体细胞的DNA 分子。转化:指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA 分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA 的过程。转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。

冰冻切片技术1.从锋利的刀片开始我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片，当片子的质量开始下降时，我会立刻更换刀片。某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝，因此，经常更换刀片显得很有必要，有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。2.坐着还是站着我切片时总是坐在一张凳子上。要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作，从而精细地控制显微厚薄程度的片子。切片时俯身弯腰，颈部过伸的姿势有些不妥，要尽量处于放松和舒适的姿势以便能zui大程度控制你的左手。3.刷子我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先学会使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到台子上。冷冻的片子会自发的卷缩并从刷子上脱离下来，因此，我使用一把有硬毛、夹取面宽的刷子。我发现来自中国的野猪毛十分坚硬，非常管用。你可以花3美元从工艺店买一把1/4英寸长的#2号扁平无色的刷子，把毛削成一个角度。由于是个有角的头端，加上握持刷子成一定的角度，这样刷子与组织接触时就会象扫帚一样的平。我不能理解为什么有人使用脆弱的骆驼毛刷子，组织片很容易从这些柔软的毛上掉下来。4.握持刷子左手象拿笔一样握持刷子，将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方)，这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。我把刷子削成一个角度，大致与左手握持刷子的角度相同，这样使刷子平着接触组织的1/4。5.摇柄的旋转以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，且要毫不犹豫。我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动摇柄。依我的经验看来，这种动作增加了起始切片假象的可能，会使片子的厚度不均匀，也增加了处理脂肪类组织的难度。我切片时，象前面所说的那样手握刷子，以一种连续的动作抓取组织，这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。6.刷子的移动组织块移向刀片时刷子也要同步地向下移动，当组织块刚好接触刀片时刷子轻轻停在其底部2mm处并迅速抽离。正是刷子的向下移动使你能连续地抓取组织，当开始的几毫米组织穿过刀片时便有自发卷曲的现象，这时，运动中的刷子立刻粘住其游离的边缘部分并水平地拖向切片者。刷子的运动路径是一个朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，连续不断。但要注意有时候把组织压向台面时会使组织粘在台面上，可能会导致碎片，应尽量避免。当然预先将组织包埋起来可以使刷子不用接触到组织，切片也容易多了。7.贴片可以从切片机的台面上也可直接从组织块面粘贴组织片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一个角度粘住片子的一角，在静电作用下片子会吸附在玻片上并迅速融化。当然在周围涂一些包埋物对贴片有利，这种多余的包埋物可以保护片子的边缘免受皱缩的损坏。有时候碰到贴片困难，我会在切到zui后2mm包埋物的时候停下来，让片子留在组织块上，然后倒转摇柄，使组织块退离刀片，再用刷子从边缘把组织片摊平，这样就可以从组织块面贴片了，这对卷曲的片子或者脂肪组织非常管用。8.快速固定我右手转动摇柄也同时拿着玻片，片子一切好，立刻粘起片子并将它浸没于固定液中。固定液需置于方便够到的地方，我一般将染色架放在染色缸的旁边，先将片子置于95%的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上。如果组织固定延迟会出现风干的假象，我的经验是组织片还在切片机的台面时，风干效应很小，当组织片粘在有温度的玻片上时就会出现明显的风干假象，表现为核的细节丢失及胞浆液的溢出。下面几张图片是延迟15秒固定和立刻固定的相同组织的比较，差异非常明显。9.切片的厚度对于一般的手术病理我推荐切6um厚，这种厚度使染色更加饱满，层次清晰，病理学家通常在2x 和 4x的放大倍数下可以获得更多的信息。太薄的片子在这种放大倍数下显得苍白，容易忽略一些细节。6um的片子可以有更多的时间去避免风干假象，也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。当然特殊情况下可能需要更厚或更薄的片子。10.为什么会掉片我不能确定组织片粘附到玻片的具体机制，但我相信可能与组织内的液体与玻片发生分子交联有关。下面我例出几种染色过程中组织片脱落的情况：1）本身非常干燥或过度脱水的组织；2）组织片的周长与面积比过大，象细条形的组织容易受染色缸内液体涡旋应力的影响而脱落，同样包括薄的纤维囊肿及不规则的坏死组织，太厚的组织也不例外；3）反蓝用的氨-水浓度太高；4）少数情况需要使用100%的乙醇固定；5）一张玻片贴多个片子时，片子周围的包埋物相互重叠。

实验方法原理：碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性pH环境，DNA变性，当恢复中性并在高盐离子浓度时，绝大多数质粒DNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色体DNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发生沉淀。离心后获得大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂（乙醇、异丙-醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心后收集。实验材料 ：含质粒的大肠杆菌试剂、试剂盒：葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 异戊-醇仪器、耗材：台式高速离心机 恒温振荡摇床 高压灭菌锅 振荡器 微量移液器 1.5ml离心管 一、试剂配制1. LB液体培养基。2. 100 mg/ml氨苄西林储存液：称取25g的氨苄西林粉末，加去离子水至250ml，完全溶解后过滤、分装，20℃保存。3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-盐酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-盐酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去离子水至500ml，高压灭菌，贮存于4℃。4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氢氧-化钠溶液，1％ SDS（10 N 氢氧-化钠20 μl，10％SDS 100μl，加去离子水至1ml），使用前临时配制。5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸钾300ml，冰醋-酸57.5ml，加去离子水至500ml，4℃保存。6. 苯-酚：氯-仿（1：1，V／V）（酚和氯-仿均有很强的腐蚀性操作时应戴手套！）。7. 无水乙醇。8. 70％乙醇。9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超纯水溶解，然后在沸水煮15min，分装，20℃保存。10. TE缓冲液：10 mmol/L Tris-盐酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。二、实验方法1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液体培养基中。37℃、250 r/min振荡培养过夜（约12——14h）。2. 取1.5ml细菌培养液倒入离心管中，4℃、6000转离心30s，弃上清，将离心管倒置于纸巾上，去除残留液体。3. 菌体沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，室温下放置5 min。4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5——10次，以混匀内容物，冰浴5min。5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒5——10次混匀，冰浴3——5min，4℃、6000转离心5min。转移上清到一个新的1.5ml Ep管中。6. 加入等体积的酚一氯-仿抽提剂，振荡混匀，4℃、6000转，离心2 rain。7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍体积用冰预冷的无水乙醇于室温沉淀双链DNA，混匀，室温放置2--5rain，4℃、6000转离心5min。8. 弃上清，将离心管倒置于纸巾上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇，盖紧离心管颠倒数次，4℃、6000转，离心2min。9. 去除所有的乙醇溶液，将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥5——10min，直到乙醇都挥发干净。10.将质粒DNA沉淀溶于50 μl TE缓冲液（含20 μg/ml RNaseA）中，温和振荡数秒，-20℃储存备用。注意事项：1. 溶液Ⅰ与溶菌液充分摇匀，用力适当。因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，一般可用力振荡几次。2. 加入SDS后则要注意不能过分用力振荡，温和混匀，但又必须让它反应充分。3. 加入溶液Ⅱ混匀之后，一定要在冰上放置，不要摇动，对于溶液Ⅲ同样处理。

影响电泳分离的主要因素：待分离生物大分子的性质：待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。2. 缓冲液的性质：缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。3. 电场强度：电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：W=I2.R.t式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：1、 样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；2、 产生对流，引起待分离物的混合；3、 如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；4、 引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。4. 电渗：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。5. 支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。关于胶回收切胶的一点注意事项：电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片zui好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。影响电泳实验结果的其它一些因素：琼脂糖：不同厂家，不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块.倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明。DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。

在研究植物生命活动过程中，常常需要准确了解某一激素的含量以及各激素间的比例。因此，植物内源激素的提取分离和测定是植物生理学实验技术中极其重要的内容。本实验以ABA和GA为例，介绍激素的提取、分离及测定的基本原理和方法。一、原理利用脱落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有机溶剂（如丙酮、甲醇）的特性进行提取，将粗提物经过一系列的分离技术（如萃取、薄层层析或纸层析等），使ABA、GA与其它成分分离。再对纯化的ABA和GA进行生物学鉴定或物理化学鉴定。（一）生物鉴定1.ABA能抑制植物器官的生长，在一定的浓度条件下，其抑制程度与浓度呈线性关系。利用这一线性关系就可确定组织中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的节间伸长，特别是矮生植物的茎。在一定浓度范围内，茎的伸长度与GA浓度呈线性关系。因此，根据茎的伸长度就可确定GA的含量。（二）物理化学鉴定：可采用气相色谱法。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片、水稻种子及幼苗等；（二）仪器设备：1.气相色谱仪；2.分液漏斗；3.组织匀浆器；4.旋转蒸发干燥器；5.层析缸；6.华特曼-3号层析纸；7.微量注射器。（三）试剂：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油醚；4. 乙酸乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯-仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁醇；12. 异丙醇；13. 3mol/L氨水。三、实验步骤与结果计算（一）脱落酸和赤霉素的提取和分离1.样品提取（1）取新鲜材料或贮存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待测时）10g，剪碎，加入60ml预冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，匀浆5min，匀浆液在4℃下振荡（或搅拌）24h，过滤。残渣再用20ml甲醇液振荡1h。反复二次，滤液混合。（2）将滤液在旋转蒸发器上干燥减压蒸发（36～38℃）至原体积一半，再加入10ml石油醚提取部分色素，将下层甲醇液取出，弃掉石油醚层，继续减质浓缩至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。2.样品萃取将水溶液用1mol/LHCl调pH至2.8～2.5左右。并以与水溶液等体积的乙酸乙酯萃取。将混合溶液装入分液漏斗，分离水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙酯溶液。此时，CTK（细胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸乙酯中。3.样品的纯化（1）将乙酸乙酯溶液用旋转蒸发器浓缩至干。用2ml100％甲醇溶解残留物。（2）点样：取100μl甲醇溶液点在涂有硅胶GF254玻板下端1cm处（或点在华特曼3号层析纸上），并在同一水平上分别点上标准GA和ABA溶液100μl。（3）展层：用异丙醇-28％氨水-水（10∶1∶1，V／V／V）作为展层剂展层。前沿至玻板顶端0.5cm处即停止展层。（4）定位：层析完毕后，吹干玻板并在紫外灯下观察色带，与标准ABA和GARf值相同或相近的色带，就作为纯化后的ABA和GA。（5）洗脱：将ABA和GA带分别括下（或剪下），用95％乙醇浸提3次。溶液经减压蒸干后，即可进一步作生物学测定或气相色谱测定之用。（二）ABA和GA的测定1.ABA的生物学鉴定（1）材料培养：精选小麦种子，25℃黑暗下浸种2h，排于培养皿湿滤纸上，在25℃下发芽。待胚根出现后，移入培养缸中的塑料网上，继续在25℃暗中培养。约72h后，选取胚芽鞘2.8～3.0cm的幼苗，用刀片自顶端分别切成3mm，5mm，5mm三小段，取中间5mm切段置蒸馏水中2～3h，备用。（2）ABA母液（200μg/ml）的配制：称取20mgABA，溶于少量酒精，以无离子水定容至100ml。（3）标准溶液的配制：吸取5ml母液，加无离子水定容至100ml，即为10μg/ml。吸取5ml10μg/mlABA溶液，用2％蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液（pH5.0）定容至50ml，即为1μg/mlABA标准液。余此类推，分别配成0、0.001、0.01、0.1、1μg/ml标准液。（4）标准曲线的绘制：取2ml各种浓度的ABA标准液分别置入10ml具塞试管，每管加入小麦芽鞘切段10根。各浓度均需3～4个重复。加塞后，置暗处25℃摇床上振荡20h。将10个切段取出测定其总长度（cm），然后按下列公式计算处理后减少的百分数（R）：R（％）＝(D空-D处理)/D原×100。式中：D空：空白总长度；D处理：处理总长度；D原：原始总长度（5.0cm）。用R与ABA浓度的相关性，绘制标准曲线。（5）将待测样品溶于2ml2％蔗糖-0.01mol/L磷酸缓冲液（pH5.0），置具塞试中，按上述步骤操作，算出R值，再查标准曲线，就得到ABA浓度C，依下式计算出样品中ABA含量：ABA含量（μg/g鲜重）＝C（μg/ml×2×10-1/W（g）2.ABA的气相色谱测定将洗脱的ABA加入0.1mlBSA（N.O-二-三甲基硅烷基乙酰胺）使脱落酸硅烷化。0.5h后，吸取5μl作气相层析，层析条件：柱长2m，φ5mm（不锈钢柱）、固定相为10％SE-30，DMCS、A、W为担体，进样口温度250℃，柱温200℃，FID检测。载气流速为30μl/min，采用内标法定性，外标法定量。计算：ABA含量（μg/g鲜重）＝A1×Ws×100×1/(As×5×W)

 人工金属酶作为一种潜在的分子药物，有望在人体内靶向治疗癌细胞，减少癌症治疗副作用。但未搞清内部催化机制时，其应用就显得有些束手束脚。本月，北京工业大学和中科院高能物理所联合的研究团队在《科学进展》上报告了一项研究，他们阐明了一种人工金属酶的精细分子结构和能级分布特征，并揭示了这种仿生酶的催化活性机制。天然酶有高效的催化性能，但生物医学中的应用对酶的稳定性和免疫原性有更高要求。为此，研究者对酶进行了一系列改造，使其得以在更多生物反应中施展拳脚。在新发表的研究中，科学家设计出活性中心为铜团簇的人工金属酶，辅以肿瘤靶向肽和血清白蛋白——前者帮助酶与肿瘤细胞定向结合，后者让酶更稳定、活性更高。为血清白蛋白换上金属团簇内核后，其生物兼容性和金属催化能力都有所改良。经过一系列计算和实验，科学家发现，这种人工金属酶与底物匹配度良好。而且，由于自身独特的几何形状，人工金属酶在肿瘤微环境中可长期、稳定、选择性地让过表达的过氧化氢转化，使其变为羟基自由基和氧气。羟基自由基既能持续切割肿瘤细胞的DNA，让治疗更高效，还能产生灵敏的化学发光，便于人们动态追踪疗效。研究团队还发现，随着催化反应的进行，人工金属酶的活性中心并不会损耗，因为团簇的金属价态实现了封闭式周期性循环，确保反应更稳定、持续。这项研究意味着人工金属酶的合成向精准按需又迈进一步。此外，金属团簇独特的催化动力学和稳定性构造出新的反应路径，帮助人们建立可视化检测、高效治疗特定肿瘤的新方法。

 大脑中错放的RNA，会破坏神经元，让人们无法控制行动，甚至出现亨廷顿舞蹈病。美国麻省理工学院的神经科学家发现，亨廷顿舞蹈病患者神经元死亡的重要原因，可能是对线粒体非正常释放的遗传物质的免疫反应。线粒体是提供能量的细胞成分。这项研究全面跟踪了不同类型的脑细胞，如何应对导致亨廷顿舞蹈病的突变。研究人员测量了在疾病发展不同阶段的不同细胞类型中，亨廷顿舞蹈病死亡患者的大脑样本与正常人的RNA差异，以及经过不同程度基因突变改造的小鼠的RNA水平。“线粒体释放的这些RNA看上去就像病毒RNA，这引发了先天免疫，并可能导致细胞死亡。”该研究通讯作者、美国麻省理工学院大脑与认知科学系副教授Myriam Heiman说，“我们相信这是触发炎症信号通路的一部分。”危害从发育开始亨廷顿舞蹈病是一种染色体显性遗传所导致的脑部退化疾病，能无情地夺走受害者对运动和思想的控制能力。患者会出现颤搐等舞蹈症状，最终可能过早死亡。在全球范围内，每10万人中有3到10人受该疾病影响，目前没有治疗方法。该疾病是以美国内科医生乔治·亨廷顿的名字命名的，他在1872年描述了这种疾病。100多年来，科学家一直在探索这种疾病。1993年，科学家发现引起亨廷顿舞蹈病的基因突变位于4号染色体短臂的顶端附近。但没有人知道突变亨廷顿蛋白（mHTT）是如何破坏神经元的。甚至亨廷顿舞蹈病是一种晚期表现的神经退行性疾病，但小鼠研究和症状前突变携带者的神经影像学研究均表明，亨廷顿舞蹈病可能会影响神经发育。7月16日刊登于《科学》的这项研究指出，人类胎儿（妊娠13周）携带亨廷顿舞蹈病突变的组织，在发育皮质中显示出明显的异常，包括突变的亨廷顿蛋白和连接复合蛋白的定位错误、神经祖细胞极性和分化的缺陷、异常的纤毛发生以及有丝分裂和细胞周期进程的改变。因此研究人员表示，亨廷顿舞蹈病对神经发育有影响，而不仅仅是一种退行性疾病。但是，“由于突变蛋白的功能和引起疾病的相关机制仍然未知，因此无法利用传统方法针对其病理功能筛选阻断剂。”复旦大学医学神经生物学国家重点实验室研究员鲁伯埙表示。 线粒体“事故”为了geng好地探究亨廷顿舞蹈病的秘密，Heiman研究组采用了两种不同的筛选技术，TRAP能用于小鼠模型，而单核RNA测序可用于小鼠和人。结果令人惊讶的发现是，线粒体中的RNA被错放在了被称为刺突投射神经元（SPN）的脑细胞中，从而破坏了这些神经元，导致了致命的神经症状。研究人员观察到，这些游离的RNA在细胞中看起来与从细胞核中提取的RNA不同，引发了有问题的免疫反应。而且，他们不仅发现了线粒体RNA 的存在，而且还显示了氧化磷酸化过程的基因表达缺失，氧化磷酸化过程是需要燃料的神经元产生能量的过程。之前，小鼠实验表明，这种氧化磷酸化的下调和线粒体RNA释放的增加，都发生在亨廷顿舞蹈病的早期，在大多数其他基因表达差异显现之前。此外，研究人员还发现一种被称为PKR的免疫系统蛋白表达增加，该蛋白被证明是释放线粒体RNA的传感器。事实上，研究小组发现，PKR不仅在神经元中升高，而且被激活并与线粒体RNA结合。Heiman说，新发现似乎与一些临床症状相一致。例如，亨廷顿舞蹈病会导致大脑纹状体区域的损伤；在Aicardi-Goutières 综合征中，由于先天免疫反应失调，同样的大脑区域可能会受损；患有硫胺素缺乏症的儿童会出现线粒体功能障碍，研究表明其小鼠模型也表现出PKR激活。“该论文最大的亮点是组学部分，应该是第-一篇用单细胞（单核）测序以及TRAP（测量正在被翻译的mRNA）的组学研究。”对临床可能有借鉴Heiman表示，他们还发现了基因表达上的重大差异，包括与重要神经功能有关的差异，如突触回路连接和生物钟功能。此外，该团队发现神经元中这些基因转录改变的主要调节因子可能是视黄酸受体b转录因子。“这可能是一个对临床有用的发现，因为有药物可以激活Rarb。”Heiman告诉《中国科学报》，“如果能够抑制转录失调，我们就能够改变疾病的结果。但这是一个需要验证的重要假设。”另一方面，研究人员在人脑样本神经元中看到的许多基因表达差异，与他们在小鼠神经元中看到的变化非常吻合，这进一步保证了小鼠模型对研究这种疾病有用。这个问题一直困扰着这个领域，因为小鼠通常不会像人那样出现那么多的神经元死亡。“我们看到的是，实际上小鼠模型很好地再现了发生在人类亨廷顿舞蹈病期神经元的基因表达变化。但其他一些非神经元的细胞类型在人类疾病和小鼠模型之间并没有表现出那么多的保守性，我们相信这些信息将有助于其他研究者开展未来研究。”Heiman说。实际上，除了小鼠模型，猪也在为该领域研究“出力”。2018年，研究人员首次利用基因编辑技术CRISPR-Cas9和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪，能精-准地模拟出人类神经退行性疾病。此外，2019年鲁伯埙团队开创性地提出基于自噬小体绑定化合物的药物研发原创概念，并巧妙地通过基于化合物芯片和前沿光学方法的筛选，发现了特异性降低亨廷顿舞蹈病致病蛋白的小分子化合物，有望为临床治疗带来新曙光。

T 细胞可以保护人体免受病原体侵害，但一项在小鼠身上进行的研究表明，T 细胞也可能是加速衰老的元凶。而通过阻断细胞引起的炎症或增加关键代谢分子的供应，可以减轻小鼠体内一些与衰老相关的症状，该研究思路可能使老年人受益。该研究是 “把代谢、炎症和衰老直接联系在一起的绝佳结果”。澳大利亚墨尔本皇家理工大学免疫学家凯丽 · 奎恩表示 “他们做的工作非常彻底”，足以证明小鼠迅速老化是 T 细胞导致的。T 细胞会随年龄增长而表现不佳，人的抵抗力也会因此变得越来越弱，这是老年人更易受感染、对疫苗反应更差的原因。T 细胞表现不佳的原因之一是其内部 “发电厂”——线粒体因年龄渐长而出现故障。但 T 细胞不只是反映衰老，还可能正是衰老的成因。老年人出现的全身慢性炎症就是例子。研究人员指出，炎症会刺激衰老，而 T 细胞会释放炎症因子，触发炎症。为了验证这一假设，西班牙马德里自治大学分子生物学中心的玛利亚 · 米特尔布伦和同事通过基因编辑方法对小鼠进行处理，使其 T 细胞线粒体中的蛋白质缺失。这一改变会迫使 T 细胞采用效率较低的代谢机制。研究小组发现，出生后 7 个月本应是小鼠的壮年期，但基因编辑小鼠已经比普通小鼠显得更老。它们迟缓、笨拙、肌肉萎缩、虚弱，对感染的抵抗力也更弱。正如许多老年人一般，这些小鼠的心脏都很虚弱，且体内脂肪大量减少。此外，经编辑的小鼠 T 细胞释放出大量炎症因子，这可能是造成动物身体退化的部分原因。其结果表明，免疫系统的确在加快衰老进程中发挥了作用。那么，衰老的时钟有可能往回拨吗？研究者给小鼠服用了一种阻断肿瘤坏死因子 TNF-α（该因子可诱导炎症出现，且由 T 细胞释放）的药物，结果发现小鼠的抓地力有好转，且在迷宫中表现得更敏捷，心脏也更有活力。米特尔布伦等人还提供了另一种化合物，可提升高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平，NAD + 对代谢反应至关重要。通过这一分子，代谢系统可利用细胞从食物中获得能量。通常，随着年龄增长，NAD + 细胞浓度会下降。研究人员发现，采用新方法后，老鼠体内的 NAD + 浓度有所增加，且心脏功能更活跃。面对类风湿关节炎和克罗恩病等，抑制 TNF-α的药物是标准治疗手段。目前，市面上有一些公司出售能提高 NAD + 水平的药物。研究者表示，对这一新方法进行临床试验，可确定靶向 TNF-α或 NAD + 是否能减少衰老带来的负面影响。也有人质疑该研究与正常衰老的相关性。美国西北大学芬伯格医学院生物学家纳夫迪普 · 钱德尔指出，转基因鼠的线粒体受损程度比老年人更严重，“对大多数人而言，我敢打赌 T 细胞的负面作用没那么大”。但钱德尔也指出，线粒体功能异常的 T 细胞会导致某些人早衰，其在相对年轻时就出现老龄化疾病。巴克老龄化研究所分子细胞生物学家朱迪斯 · 坎皮西对此表示同意。她说，这项新研究可以帮助人们更好理解免疫系统如何随年龄变化而变化，但 “不知道它在多大程度上模仿了自然衰老”。

利用紫外线消毒杀菌是一种古老而又行之有效的方法。早在 1877 年就有对太阳光辐射可以杀灭培养基中细菌特性的报道，日常生活中，在太阳下晒被子就是利用紫外线除螨杀菌的典型应用。作为一种广谱类杀菌消毒方式，紫外线在血液制品消毒过程中也扮演着重要角色。近期，美国科罗拉多州立大学生物医学科学系研究人员等利用紫外线与核黄素，对 9 种血浆和 3 种全血制品进行处理，结果表明处理后的血液样本中检测不到原有病毒，紫外线对血液制品的消毒效果值得肯定。短波紫外线，无包膜病毒消杀利器记者查阅相关文献了解到，献血人的全血中可以分离出红细胞、血小板和血浆等成分。其中，红细胞可以用于大量失血的患者，危急时刻挽救生命；血小板可用于血小板减少症患者；血浆里提取的免疫球蛋白能用于免疫缺陷综合征患者、免疫相关血液疾病，还可提供被动免疫及有效调节免疫缺陷患者的免疫应答，是现在广泛使用的生物制剂。由此可见，血液制剂的输注与患者生命安全和生活质量息息相关。目前已知很多病原体都可通过血液传播，如艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等。如果血液中存有病原体，对受血者来说将后患无穷，甚至威胁生命。现阶段，减少经输血感染的方法主要包括精密筛选献血者、血液中病毒标志物检测及采用安全可靠的技术对血液成分进行病原体灭活等。紫外线就是在输血安全链条的病原体灭活一环中 “发光发热”。“光化学法灭活血液制品是近年来的研究热点。紫外线可使核酸突变，阻碍其复制、转录及蛋白质的合成，同时产生的自由基可引起氨基酸光电离，导致细菌和病毒的死亡。” 中国生化与分子生物学会工业生物化学与分子生物学分会副秘书长、山东大学药学院研究员臧恒昌在接受记者采访时表示。紫外线可根据波长分为长波紫外线（UVA）、中波紫外线（UVB）、短波紫外线（UVC）三类。其中，UVC 吸引了很多学者的目光，其用于血液制品灭活的相关研究频见报道。“总体来说，UVC 对绝大部分病毒，尤其是无包膜病毒具有较好的灭活效果，填补了血液制品病毒灭活工艺的空白，具有良好的发展前景。” 臧恒昌说。他举例，当 UVC 照射剂量达到一定数值时，能有效降低无包膜病毒脊髓灰质炎病毒的数量和毒力，而要想 UVB 达到相同的效果，则需要将照射剂量提高 4 倍。“但是，验证最终灭活效果要看制品是否传播病毒，需进行临床流行病学的长期观察。” 臧恒昌表示，对灭活效果的考察还应包括灭活工艺的可靠性、稳定性、易放大性及经济性等，这些尚有待进一步研究。蛋白质保护剂，与紫外线结伴 “杀敌”虽然早在 20 世纪 40 年代，紫外线就曾用于血液制品净化，但其灭活血液制品病原体之路并非一帆风顺。研究发现，紫外线照射会使血液中的蛋白质形成聚合体或裂解成小的蛋白碎片，进而引起其活性和功能的改变。因此，紫外线灭活相关研究曾一度停滞。后来，研究人员尝试在试验前加入蛋白质保护剂，使血液中的有用蛋白质免受紫外照射，以保证血液制品品质。目前这种联合方法的研究进行得如火如荼。前文提及的最新科学研究就是使用了核黄素联合紫外线的灭活方法。核黄素还有一个为人熟知的名字——维生素 B2。以往研究数据显示，二者联合可以通过不可逆地改变核酸来灭活大部分的病原体，包括有包膜和无包膜病毒，以及与临床相关的污染菌。重要的是，这种方法处理血液制品后对蛋白质、凝血因子等物质的活性影响很小。臧恒昌补充道，也有研究发现，在充分优化辐射剂量和暴露时间的基础上，即使在不加光保护剂的情况下，利用 UVC 灭活病毒，对血浆蛋白损伤也不大。例如，将紫外线灯设计成螺旋形，再令血浆从紫外线灯外流过。这种特殊的形状设计能够使血浆样本在压力泵的推动下形成涡流，所受紫外线辐射均匀，堪称 “360 度无死角”，暴露时间也短，无需添加蛋白质保护剂，既能较好地灭活指定病毒，对血液成分中的生物活性物质破坏也较小，且消除了添加剂导致的产品输注后副反应的发生风险。除了紫外线，血液制品的病毒灭活方法还有很多，主要有物理法和化学法。臧恒昌告诉记者，物理法中常用的热处理法有湿热法、干热法、蒸汽加热法、纳米膜过滤等；化学法中较常用的有低 pH 孵育法、有机溶剂 / 表面活性剂法（S/D 法）等。这些方法各有优劣，需要根据不同的血液制品和临床需求进行选择。直接照射人体消毒？不可行除了血液制品灭活外，紫外线还广泛用于日常室内空气、物体表面、水等液体的消毒，就连新冠病毒也无法逃脱紫外线的 “制裁”。《诊疗方案》显示，新冠病毒对紫外线敏感。那么，紫外线能够通过直接照射皮肤的方式进行消毒吗？“由于紫外线能够穿透细胞使其死亡，因此用紫外线消毒时要注意不能直接照射到人的皮肤，尤其是人的眼睛，紫外线杀菌灯点亮时切不可直视灯管。” 臧恒昌表示。武汉市第四医院眼科医生杨蕾蕾也提示，紫外线消毒易造成眼角膜上皮坏死脱落。人们即便不直视紫外线灯源，在开着紫外线灯的房间待久了，同样有可能 “中招”。因此，在使用紫外线灯对物体进行消毒时，人应当离开现场，使用结束后，先通风一段时间，再进入房间。皮肤科医师一直强调防晒的重要性，主要就是防止阳光中紫外线对皮肤的伤害。多位皮肤科医师在接受记者采访时强调，皮肤长久暴露在阳光下，易起皱、老化、红肿、掉皮，甚至会引发皮肤癌。由此可知，以消毒为目的，使用强度更高的人工紫外线产品直接照射身体，将会带来更大危害。当然，如果科学掌控紫外线的波段和剂量，使用专门设备，也可让紫外线 “摇身一变”，成为治疗皮肤病的帮手。专家表示，经过多年研究发展，现今紫外线已逐渐应用于银屑病、白癜风、特应性皮炎、多形性日光疹等皮肤病的治疗中。未来在科研人员的探索下，相信紫外线还能进一步扬长避短，在消毒杀菌、治病救人等领域发挥更大的作用。

1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯-仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯-仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异-丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3?gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用照相机拍下电泳结果。3 样品cDNA合成①反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录buffer 2μl2 上游引物 0.2μl3 下游引物 0.2μl4 dNTP 0.1μl5 逆转录酶MMLV 0.5μl6 DEPC水 5μl7 RNA模版 2μl8 总体积 10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待

植物，面对在几个小时到几个月的时间尺度上波动的温度，需不断加以解释以使它们的生长发育与季节相适应。人们对植物如何对温度做出反应有很多了解，但是让植物测量温度信号的机制还不太清楚。在这项发表在《Nature》杂志上的研究中，分别来自约翰因斯中心Dame Caroline Dean教授和Martin Howard教授小组的研究人员Yusheng Zhao和Rea Antoniou Kouronioti解释了缓慢生长被用作感知温度长期变化的信号。“我们发现了一种新的温度传感机制，它能长期记忆寒冷，整合过多波动的温度来测量寒冷的持续时间。这是一种新型的温度传感物理机制，可以指导该领域的进一步研究。”通过一个前瞻性的基因筛查，他们发现了一种功能失调的反应：在温暖的温度下表达很高水平的VIN3蛋白质。之前大家了解到，这种蛋白质在寒冷时期被上调，并与允许植物记忆寒冷的表观遗传分子记忆系统相互作用。赵博士发现，这些植物中有两种突变的NTL8转录因子，即使没有寒冷也能激活VIN3。为了了解NTL8的作用，他们用荧光蛋白（GFP）标记了NTL8，并在生物成像平台的帮助下，研究了这种蛋白与VIN3相比的存在位置。结果表明，突变蛋白在植物体内随处可见，野生型蛋白主要分布于根尖。它还表明，在寒冷的环境中，它会随着时间的推移而慢慢积累。利用理论方法进一步探索这个问题，研究小组推断，了解NTL8蛋白质降解的速度可以帮助我们深入了解NTL8和VIN3的慢动力学是如何运作的。结果发现NTL8蛋白是持久的，正如理论预测的那样。数学模型表明，影响NTL8蛋白含量的主要因素是生长依赖性稀释。如果天气变暖和，植物生长得更快，并且随着细胞的繁殖，NTL8的数量也会稀释。相比之下，在较低的温度下，植物生长较慢，NTL8浓度更高，能够随着时间积累。这个数学模型可以重现在冷暖条件下观察到的NTL8蛋白水平。为了进一步测试这个模型，他们添加了化学物质和激素来改变植物的生长，看看这是否改变了模型预测的NTL8的水平。他们在根部添加了植物生长激素赤霉素（Gibberellin），这能使植物生长更快，而NTL8的含量也比预期的低。当他们添加生长抑制剂时，整个植株的NTL8蛋白水平更高。研究小组在树根上做了类似的实验，这些预测也得到了证实。联合第1作者Rea Antoniou-Kourounioti补充道：“我们对我们发现的新温度机制的简单到惊讶，它从一个过程（生长）中回收温度信息，为另一个过程（春化——寒冷加速开花）创造一个全新的温度传感机制。我们只需改变暖态和冷态的生长速率，就可以用我们的模型重现实验观测中的大部分与温度有关的变化。”Martin Howard教授说：“这项研究彻底改变了我们对植物如何感知温度的理解，尤其是如何整合长期环境波动的情况。”。“这项研究表明，当实验方法与计算模型相结合时，会产生奇妙的协同效应，”Caroline Dean说。“我们不可能通过单独做这两件事来搞清楚这一机制。这项发现将有助于了解植物和其他生物如何感知长期波动的环境信号，并可应用于作物。

美国Stowers医学研究所的研究人员发现，微生物组的构成，与宿主的免疫反应、机体的自愈能力之间，有一种明确的联系。他们发现，涡虫微生物群落的一个急剧变化，可使得这种淡水扁虫失去它的再生能力。这种相同的变化在人类炎症性疾病中也曾被观察到，但是，之前科学家曾经尝试在较低等生物（如果蝇和斑马鱼）中模仿它，却被证明是失败的。该研究结果发表在《eLife》杂志上，提供了一个有价值的模型，用于揭示控制免疫力和再生之间相互作用的基本分子机制，并可能指出新的治疗方法，来对抗严重的人类疾病，如慢性不愈合的伤口。本研究资深作者、Stowers医学研究所和霍华德休斯医学研究所的Alejandro Sánchez Alvarado博士说：“这是第一个动物模型，将内生细菌的病理变化与再生抑制联系起来。我们知道，一些种类的细菌对我们的健康是至关重要的，其他种类的细菌则可能使我们很难从疾病中恢复过来。现在，我们可以研究微生物组不断变化的性质——和免疫系统响应这些变化的方式，是如何影响再生过程的自然执行的。”长期以来，研究人员认为，免疫反应主要构成了有效组织再生和修复的一道屏障。然而，最近在各种不同生物中的研究表明，它可能对于促进这一过程也发挥着核心的作用。不过，是什么分子机制驱动了这些截然相反的结局，仍不清楚。Sánchez Alvarado实验室一次突如其来的困境，提供了一个机会来剖析免疫系统的复杂双重性。实验室涡虫种群的一部分遭受了一次感染。受感染的动物在眼睛周围出现病变，这些病变越来越大，直到它们的整个头部退化。通常情况下，涡虫仅仅可以再生出一个新的头，但是感染却以某种方式挫败了它们的再生能力。Sánchez Alvarado的研究团队和Stowers研究所开发了一种改进的水槽系统，能够循环和消毒培养基，从而使他们能够培养健康的涡虫，但是他们发现，当他们把蠕虫从该系统中取出来时，它们很快就又生病了。虽然大多数的实验室成员对这一发展感到挫折，这时，新的博士后研究助理Chris Arnold博士，采取了不同的角度。Arnold说：“我认为这是个完美的诱导模型系统。我们可以选取健康的涡虫，当需要的时候从该系统中去除它们，并将它们放置在使其生病的其他条件下。令人惊讶的是，我们发现，当我们从该系统中取出涡虫时，它们出现了问题，我们可以成功地用抗生素治疗它们的组织退化。这表明，可能有细菌参与进来。”Arnold想要确定有什么样的细菌生活在涡虫体内。他进行了一次细菌普查，发现涡虫的微生物组与人类有着惊人的相似性。当涡虫都是健康的时候，它们体内有大量的拟杆菌——一组有益的、支持性共生菌，和少量的变形菌——一组细菌包含一些危险的人类病原体。但是，当涡虫发展出病变时，他们经历了变形菌的大幅飙升，一些成员已被证明可引起人类消化性溃疡和胃癌。研究人员怀疑这并不是细菌本身，而是免疫系统对“影响涡虫再生能力的细菌”所产生的反应。为了验证这一假设，Arnold使用了一种叫做RNA干扰的先进分子技术，来沉默免疫系统的核心部件。然后，他想探究每一个组件对“涡虫在感染过程中修复病变并再生头部的能力”有何影响。研究人员发现，当他们阻断一个被称为TAK1激酶的基因时，涡虫能够从感染所致的损伤中得以恢复。他们着眼于与TAK1激酶相互作用的其他基因，包括TAK1通路的激活剂和抑制剂，并发现它们中的大多数也影响再生，但是只有在涡虫被感染的时候。Sánchez Alvarado说：“我们的研究结果表明，在感染过程中有一些关于再生的特殊情况，不同于正常的再生。有一些基因在一种情况下可促进退化，而在另一种情况下，却促进再生。这是颠倒的，完全不同于我们所期望的。我们认为这一途径可能会采取行动清除感染的细胞，所以感染不能扩散到健康的组织。只有当我们阻断该通路时，我们才能即使在感染的情况下也能允许再生发生。”Sánchez Alvarado说，在未来，我们有可能会开发出小分子，抑制这一免疫途径，以提高组织的修复和再生，不只是在一个像涡虫这样简单的生物体中，而且在更高等的生物（如人类）中也一样。然而，我们首先需要对这一途径中的激活剂和抑制剂，以及它们如何相互作用，了解更多。Arnold说：“我们的医疗体系正在努力解决受损伤口愈合的情况。我们知道，细菌是治愈患者的障碍，而抗生素并不总是有效的，尤其是抗生素耐药性细菌的兴起。通过了解参与免疫应答的基因和途径，我们或许能够阐明决定一个生物体是否修复或试图再生的信号。也许，我们可以开发更有效的治疗方法。”

红细胞的作用不仅仅是将氧气从肺部输送到我们的器官：它们还通过捕捉表面的病原体，中和它们，并将它们呈递给脾脏和肝脏的免疫细胞，从而帮助身体抵御感染。现在，来自哈佛大学Wyss生物启发工程研究所和John A. Paulson工程与应用科学学院（简称SEAS）的一组研究人员利用这一先天能力，构建了一种平台技术，利用红细胞，产生免疫反应。这种方法成功地减缓了小鼠肿瘤的生长，并可作为多种疫苗的生物相容性佐剂。这项技术被称为红细胞驱动免疫靶向（EDIT），文章发表在本周的PNAS。“脾脏是人体产生免疫反应的zui佳器官之一，因为它是少数红细胞和白血球自然相互作用的器官之一，”通讯作者Samir Mitragotri博士说。“红细胞将附着的病原体转移到免疫细胞的先天能力是zui近才被发现的，这项研究开启了人类细胞用于疾病治疗和预防领域一系列令人兴奋的未来发展的大门。”别吃我，看看我使用红细胞作为药物的运载工具并不是一个新想法，但是现有的绝大多数技术都是针对肺部的，因为它们密集的毛细血管网络会导致货物在红细胞挤压微小血管时被切断。Mitragotri的研究小组首先需要弄清楚如何让抗原强烈地粘附在红细胞上，以抵抗剪切并到达脾脏。他们用卵清蛋白（一种已知能引起轻微免疫反应的抗原蛋白）包裹聚苯乙烯纳米颗粒，然后与小鼠红细胞孵育。每个血细胞配300个纳米颗粒比例能够产生与细胞结合的zui大数量的纳米颗粒。当细胞暴露于肺毛细血管中的剪切应力时，大约80%的纳米颗粒保留下来，随后细胞膜上适度表达一种名为磷脂酰丝氨酸（PS）的脂质分子。“红细胞上高水平的PS本质上是一种‘吃我’的信号，当红细胞受到压力或受损时，它会使它们被脾脏消化，这是我们想要避免的。我们希望少量的PS会暂时向脾脏的APCs发出‘检查我’的信号，这样一来，红细胞的抗原涂层纳米颗粒就会被吸收，而细胞本身不会被破坏，”论文的第1作者之一Anvay Ukidve说。为了验证这一假设，研究小组将涂有纳米颗粒的红细胞注射到小鼠体内，然后追踪它们在体内的聚集位置。注射20分钟后，99%以上的纳米粒从动物血液中被清除，脾脏中的纳米粒多于肺部。较高的纳米颗粒在脾脏中的积聚持续了24小时，循环中编辑的红细胞数量保持不变，这表明红细胞已经成功地将其货物运送到脾脏而没有被破坏。有效的无佐剂疫苗在证实了他们的纳米颗粒在体内被成功地输送到脾脏后，研究人员接下来评估了纳米粒子表面的抗原是否诱导了免疫反应。小鼠每周注射一次EDIT，连续3周，然后对其脾细胞进行分析。与给予“游离”纳米颗粒或未经治疗的小鼠相比，经处理的小鼠显示出显示已传递卵清蛋白抗原的T细胞分别高出8倍和2.2倍。接受EDIT治疗的小鼠在血液中产生的抗卵清蛋白抗体也比其他任何一组小鼠都多。为了观察这些EDIT诱导的免疫反应是否可能预防或治疗疾病，研究小组重复了他们3周的预防性注射EDIT给小鼠，然后给它们接种表面表达卵清蛋白的淋巴瘤细胞。与对照组和接受游离纳米颗粒组相比，接受EDIT的小鼠肿瘤生长速度慢了大约3倍，并且存活的癌细胞数量geng少。这一结果显著增加了小鼠在病死前可以治疗肿瘤的时间窗口。EDIT本质上是一个无佐剂疫苗平台。Mitragotri实验室的博士后研究员、论文的第1作者之一Zongmin Zhao博士说：“今天疫苗研发耗时如此之长的部分原因是，与抗原一起交付的外源佐剂必须对每一种新疫苗进行全面的临床安全性试验。几个世纪以来，红细胞已经被安全地输入病人体内，红血球增强免疫反应的能力可以使其成为外源佐剂的安全替代品，提高疫苗的功效和疫苗的研制速度。”该研究小组正在继续研究脾脏的APCs是如何产生对EDIT抗原特异的免疫反应的，并计划用卵清蛋白以外的其他抗原来测试以期尽快推动geng好的临床试验。