在实验室中，尤其是分子生物类的实验室中不可避免的会遇到细胞总RNA提取实验，所提RNA样品的质量和纯度直接影响下一步的实验，如逆转录，RT-PCR, microarray 等。下面我们来介绍如何提取细胞中的总RNA 。首先，我们要知道什么是总RNA。总RNA包括mRNA和miRNA等，其中mRNA也就是信使RNA，是具有编码蛋白质的功能的长RNA，传递遗传信息。miRNA是小型非编码RNA，长度约22个碱基，可以调控或沉默基因表达。我们的目的是得到质量好，纯度高，完整的RNA样品。操作如下：细胞裂解 细胞的获取方式不同，采用的裂解方法也不尽相同。 1）若是组织中提取，按照每50-100mg样品加入1mlTrizol的比例加入Trizol，而后匀浆破碎样品。细胞破碎后在室温下静置5分钟，这样可以分离出核蛋白复合物（nucleoprotein complexes），然后离心去除细胞碎片。 2）若是培养瓶中贴壁细胞，则先用冰PBS洗2次，而后按每10平方厘米区域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混匀处理。 3）若是悬浮细胞，离心收集细胞，去除培养基，然后加入适量Trizol吹打混匀处理。可以发现这步操作主要用到了Trizol这个试剂。那么Trizol的作用是什么呢？Trizol的主要成分是苯酚，是有效的蛋白变性剂。它能够抑制酶活性包括RNAaes，这样可以保证RNA不会被降解掉，同时Trizol能够使细胞裂解。抽提RNA 向EP管中的细胞液加入200ul氯仿，涡旋15秒后，室温静置3分钟，然后4℃，12000rpm,15min条件下离心。离心后分3层，上层为无色或淡粉色含有RNA，中层为白色蛋白质层，下层为红色含有脂质和培养基。我们所需的RNA就在氯仿的作用在分在上层的水相中。氯仿是有机溶剂，添加氯仿会使细胞内的蛋白变性沉淀，可以通过离心进行去除。同时加入氯仿后，水相和有机相会分层，将水相中的酚抽提以免损伤核酸，另外还能溶解一些脂溶性杂质纯化RNA。沉淀RNA 吸取上层水相于新的EP管中，不要吸取中间蛋白质层，加入等体积的异丙醇，一般是500ul上清和500ul异丙醇，少的时候可以取200ul的上清。两者充分混匀，室温放置10分钟,然后4℃，12000rpm离心10分钟。离心结束后，弃去上清，管底可见白色胶状沉淀，这就是我们的RNA了。好奇心强的朋友一定会问了，加入异丙醇的作用是什么呢？异丙醇的作用就是沉淀水相中的RNA并抑制RNA酶活性，其羟基的疏水作用能保护RNA中的亲水基团。洗涤RNA 为了进行RNA的洗涤，我们需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液，现配现用。哪尼？你不知道什么是DEPC水。DEPC水呢，就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，里面不含杂质RNA，DNA和蛋白质。按照添加的Trizon的量1:1体积配乙醇溶液，一般是750ul分析纯乙醇加上250ul DEPC水，在涡旋仪上使乙醇溶液与RNA充分混匀，4℃，9000rpm,5min离心。然后小心弃去上清，不要吸走管底的RNA哦。再次洗涤RNA 重复第四步骤，再次洗涤RNA，弃去上清后，控干EP管。，室温下将EP管倒置在吸水纸上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA，这就是我们最终提取到的RNA了。测定RNA纯度和浓度 用微量紫外分光光度计取1-2ul RNA检测即可。A260/A280值在1.8-2.0间符合纯度。RNA在260nm处有最大吸收，A260=1.0代表RNA的浓度为40ug/ml。A280用于检测蛋白污染，纯RNA样品的A260/A280=2.1，一般所得比值在1.8-2.0间也是普遍认可的。另外，我们也可以测定A230。A230用于检测其他污染，主要来自RNA提取试剂，理想的A230值要大于1.5。另外RNA的完整性可以用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。操作注意事项： 1. 在收集细胞时，离心操作过程中离心管中看不见明显的细胞沉淀时，可以在倒置显微镜下观察培养瓶细胞残留，判断细胞是否都消化下来。另外，可以适当延长离心时间。2.加入氯仿时，要剧烈混匀使两相彻底混匀 。DNA在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。吸取上清液时尽量不要分到不同的新的EP管中，本身量不多时，尽量集中到一个管中，同时也避免吸到中间蛋白降低纯度。3.加入异丙醇后没有看到明显的乳白色沉淀时，可以在-20℃过夜再离心，也可以继续按照实验操作往下做。每个实验室的提取方法可能不尽相同，此处的方法仅供参考交流。在实验过程中遵守操作规范，严谨实验，这样便能大大提高实验结果的准确性和可靠性。

一、荧光素酶报告基因的检测原理荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。二、荧光素酶报告基因的检测流程1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。三、荧光素酶报告基因的优点1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；4、发光检测，检测方便；5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；6、检测范围广，大于7个数量级。四、主要应用领域1、潜在启动子/启动子核心区域检测；2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测；3、启动子区可能的转录因子结合位点检测；4、启动子/增强子与转录因子的相互作用；5、病毒/细胞相互作用；6、药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）；7、射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）。五、荧光素酶报告基因检测方法与Western-Blot检测方法在细胞信号转导通路调控机制研究中的区别1、荧光素酶报告基因检测是测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响，即对靶基因mRNA表达水平的影响，可以通过实时荧光定量PCR来验证；Western blot是测定上游刺激对下游靶基因对应的蛋白表达水平的影响，特别是磷酸化程度的改变。因此，两方面的实验结果可以结合起来更细致、更全面地揭示细胞信号转导调控的分子机制。2、荧光素酶报告基因检测方法操作过程相对简单，检测灵敏度较高；Western blotting操作过程繁琐，检测灵敏度较低。3、荧光素酶报告基因检测只需要成功将含有目标DNA序列插入到报告载体中，即可进行后续实验，Western blotting则需要购买商品化的一抗，一般价高量少，且抗体的杂交条件需要摸索；若自制的一抗，抗体效价需要验证，实验周期较长。

　　新生牛血清质量好坏对细胞形态及生长情况的影响很大，尤其是要保证其无微生物的污染，因为微生物对细胞的污染会造成实验结果的偏差，对生物制品的安全性也构成威胁。　　国内外的相关部门都提出了一系列的质量检测指标。但也有人指出其不足，如对外源微生物的检测项目较少、不能涵盖所有微生物的检测；检测精确度也受到方法本身的限制而不能达到很高的水平。为此, 建立快速、高效、广谱的新生牛血清外源因子检测方法是非常必要的。　　有生物制品机构开发出电镜监测微生物的方法。其主要采取的是膜表面富积法来制备电镜样品。将有膜电镜载网放入装有新生牛血清的离心管中, 5000 rPmin 离心, 然后取出载网负染。同时设立实验组和对照组。对于细菌，设置电镜放大1万倍，观察时间为 30分钟, 当5 分钟内检出细菌记为/ + + + , 10分钟检出细菌记为/ + + , 30 分钟内检出记为/ +。对于病毒，设置电镜放大3万倍，借助目镜观测, 5分钟内检出 n种记为/ n+ + +，10分钟内检出记为/ n+ +，30分钟内检出记为/ n+。研究人员选择了三种国内外不同新生牛血清的牌子，每个牌子的血清又选择了3-10个批次。结果显示，用培养基进行无菌检测时，大部分做的比较好，只有一个牌子的一个批次出现细菌检测阳性，其余皆阴性。但用电镜检查时，对照组皆为阴性，但实验组的大部分都是阳性（阳性率高达95.6%）。病毒的阳性率为34.8%。　　在方法上，作者认为，与膜表面富积法制备的新生牛血清电镜样品相比, 常规负染法只能获得极少的观测视野, 且附着粒子极少。而膜表面富积法所制样品可以在每个网孔取得观测视野，粒子附着率应提高104~105倍。该方法只要求血清中的微生物绝对数量, 不要求微生物的颗粒密度，这样即使在微生物密度极低的情况下, 也能有效利用电镜进行有效检测。　　作者认为，对于污染程度极低的血清, 要经过多个数量级的放大后才能在细胞　　培养中体现出来。而采用针对性强的病毒检测方法不能保证血清完全避免病毒污染。因此，新生牛血清生产企业应不断改进生产和检测工艺, 提高产品的质量, 满足使用单位不断提高的质量要求。　　Ausbian精制新生牛血清系新西兰血源，澳洲生产，出厂前经严格质控，符合国际各项标准。血清经过0.22微米过滤和15kGy的gamma射线照射灭能，可杀灭细菌、支原体，无微生物风险，可满足广大用户对新生牛血清的品质需求。

　　有关抗菌的历史，可以追溯到5200年前的古埃及时期。公元前3400年，古埃及人开始制作木乃伊，为了防止尸体腐败，他们会利用草药植物提取物处理裹尸布，这也是有关抗菌应用最早的记录。　　第二次世界大战时期，德军军服开始采用季铵盐抗菌剂做处理，从而明显降低了受伤士兵的二次感染问题，这也是抗菌材料的第一次大规模集中使用。　　上世纪60年代初，抗菌剂大量涌现并渗透进入各个领域，如农业、工业、纺织行业等，渐渐进入到人们的日常生活。　　新冠病毒疫情期间，消毒产品需求大增，而市面上，尤其是电商平台上很多产品，为了强调杀灭微生物的功效，常常声称达到“抗菌”、“抑菌”、“消毒”甚至“灭菌”的标准，让消费者选择上犯难。　　实际上，这些词在消毒专业上存在根本的区别，具备功能性的消毒产品究竟让人放心，还是反而不放心？我们来一起了解常见的消毒学概念，学会自行甄别。　　针对这4个概念，《国家技术规范》给出了明确的定义：　　抗菌 Antibacterial　　采用化学或物理方法杀灭或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。　　能达到抗菌效果的叫抗菌剂，对细菌的杀灭能力用杀菌率来衡量，对细菌的杀灭能力≥90%。　　添加抗菌剂制成的抗菌产品只有在病毒与其接触时才会发生作用，使病毒不能在其表面定植并滋生繁殖，具有“守株待兔”的特点。　　一般来说，抗菌产品一般通过添加稳定性良好的抗菌剂制得，因此制成的抗菌产品性能稳定，具有长效抗菌效果。　　抑菌Bacteriostasis　　采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。　　能达到抑菌效果的叫抑菌剂，对细菌的抑制能力用抑菌率来衡量，需≥50%，具有一定抑制细菌的作用。　　消毒Disinfection　　杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。　　能达到消毒效果的叫消毒剂，对病原微生物的杀灭能力用杀菌率来衡量，至少应≥99.9%。　　消毒以防止或减少病菌的传播为目的，消毒产品大多是比较活泼的物质，相当一部分（如含氧化合物、过氧化合物等）还属于强氧化剂。因此迅速杀灭微生物特性的同时，又很不稳定，使用后快速分解残效期很短，要控制二次污染，只能再次使用。因此，消毒又具有局部性和短暂性的特点。　　常用的消毒方法有高温消毒、液体化学消毒（如酒精、含氯/溴消毒剂、双氧水、碘伏等等）、气体化学消毒（如臭氧）。医生在打针之前，会在病患皮肤上涂抹碘伏和酒精就是最常见的消毒场景了。　　灭菌Sterilization　　杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。　　灭菌形式上有“主动出击”的特点，杀菌率≥99.9999%，专业的灭菌可以杀灭物品上一切微生物。灭菌是“干净”的最高级了，严格来说，专业的灭菌可以杀灭物品上一切微生物，所有的细菌、脏东西都会“消失”。　　常用的灭菌方法有：高温灭菌（如压力蒸汽灭菌）、化学灭菌（如环氧乙烷气体、低温甲醛蒸汽、过氧乙酸等）。灭菌对于日常来讲，不用苦苦追求。　　无菌时代TIPS　　新冠疫情爆发后，消毒等产品供不应求，但有必要提到的一点是：消毒产品虽然可以做到最大程度上处理掉我们身边的细菌，但即使是无害化处理，也依然不适合我们24小时接触和使用。　　因此，什么时间选择什么样的产品来保护我们的健康尤为重要。　　抗菌产品是将稳定的有机或无机的抗菌成分添加至产品中，以实现产品的抗菌功效，并带来长效持久安全的抗菌体验。　　抑菌产品能够抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性。　　消毒产品适用特殊时期使用，且局部作用、效用短暂。　　灭菌多用于医疗和特殊场景，拥有极高的杀菌率但却不适合日常使用。　　总结下来，最适合日常并贴近人体使用的为——抑菌类和抗菌类产品。

化妆品为什么会出现微生物超标现象？ 如果是一个正规的生产流程，不应该出现微生物超标现象。因为在我们的生产流程中，每一项都有严格的检测及控制，在生产过程中，我们都会遵循GMP((Good Manufacture Practice良好生产规范)的国-际标准。在中国，正规上市的产品都必须具备卫生许可证，这个卫生许可证也对产品的生产过程做了详细和严格的规定。其中很多关键环节都是在密封或是严格控制的卫生环境中进行。这一系列规定的目的就是要将微生物量减至最低，其他的污染物不可能流入进去。如果出现微生物超标现象，就有可能是某些环节出了问题。 化妆品生产过程中使用的原料、容器和制作过程中均可受微生物污染，尤其在灌装过程更易受污染。化妆品各种原料都有被微生物污染的可能，其中尤以天然动植物成分、矿产粉剂、色素、离子交换水等原料易受微生物污染。某些剂型化妆品富含水分和营养成分，如膏霜类化妆品多属“营养型”，其中因加入各种氨基酸，蛋白质或滋补品（胎盘提取液、人参、甘草提取液等）成分而有利于微生物生长繁殖。 化妆品含有适合微生物生长的成分，而且受安全性的考虑防腐剂的使用受到许多限制。因此它在控制微生物污染这个问题上与医药品、食品有不同的要求。 微生物污染关键点控制： 1、生产设备的消毒 2、生产环境的消毒 3、包装材料的消毒 4、人员卫生管理 为什么很多化妆品企业在生产过程中，各个环节也做了消毒，却还是时不时的出现微生物超标的问题，究其原因还是消毒产品和消毒方案不正确的所致，就如同感冒了，去买感冒药，有的药用着就有效果，有的药用着就没有效果。而有的人第1次用这种药有效果，下一次就没有效果了，这就存在一个对症下药和抗药性的问题。

每个介质的存储时间不同。以下编辑者将从实际情况入手，并讨论不同类型介质的保质期。  干粉介质的保质期粉末微生物培养基制成的成品包装在铝箔袋中，具有良好的热封性能和柔韧性，无毒无味，符合药品包装卫生标准，阻隔性，耐光，耐高温，耐湿性和耐油性。轻巧，标准包装盒的保质期为3年。当然，如果在阳光直射潮湿的地方，并且温差大，则保质期当然会缩短；如果存在凝块颜色，超过标签的保存期限和其他条件将无法使用，则需要按照标准进行销毁。液体介质的保质期液体瓶装的终微生物培养基在经过标准的高温灭菌和全自动包装过程后，存储在药品级玻璃瓶中。生产标准还基于国家标准，例如USP和欧洲药典。储存条件为根据产品特性在2至8°C下冷藏储存，有效期为90天至180天等。  预填充接触板的保质期生产标准基于欧洲药典，美国药典，中国药典，55 / 90mm×10片/包，三层无菌真空包装，高压灭菌，无菌灌装和辐照灭菌，无须预先培养，请勿使用 使用前，请检查片剂是否破裂，污染或包装不完整。储存温度为2-25℃，合适的储存温度为2-8℃。存放或使用时，请直立放置，以免温差大（超过10℃）。温差大会产生冷凝水。使用本产品时，应提前4至6个小时将其垂直放置在工作环境中，这样可以减少一些水分。如果产品在有效期内的介质或包装袋中的水滴或水蒸气较少，则不会影响其正常使用。介质上的水分也表明介质的新鲜度。 如果在采样前还有更多的水，则可以去除培养基中多余的水。使用后，应高压灭菌并丢弃； 有效期为6个月。收集在无菌容器中并取出。固体微生物培养基的储存时间6个月的保质期；一般不推荐。  生化识别管的存放时间通常，摄氏2-25度有效期为2年。

来自威尔康桑格研究所和牛津大学大数据研究所的基因组病原体监测中心的研究人员，一起使用基因组测序技术分析质粒和从欧洲医院病人身上采集的肺炎克雷伯菌样本中的细菌染色体。9月24日发表在《PNAS》上的这项发现揭示了抗生素耐药基因通过质粒在细菌群体中传播的三种不同途径。研究人员说，在追踪抗生素耐药性时，将质粒包括在内是至关重要的，这样才能最大限度地阻止超级细菌。肠杆菌科细菌家族的成员可以对碳青霉烯类抗生素一线抗生素产生耐药性，并被收入世界卫生组织优先病原体严重疾病名单。在这个家族中，肺炎克雷伯菌是一种机会性病原体，可引起严重疾病，包括肺炎和脑膜炎。肺炎克雷伯菌通过获得抗生素耐药基因（碳青霉烯酶基因）对碳青霉烯类抗生素产生耐药性，该基因编码一种“吞噬”抗生素的酶。在肺炎克雷伯菌中，这些碳青霉烯酶基因通常存在于质粒上，质粒可以在不同菌株和不同种类的细菌之间“跳跃”，这意味着抗生素耐药基因可以迅速传播，并推动全世界耐药细菌感染的迅速上升。因此，研究人员在追踪细菌的进化和传播时，必须包括质粒，才能真正了解抗生素耐药基因是如何传播的。然而，由于基因序列的大小和变异性，以前很难对其进行可靠的测序。现在有了长读测序技术研究人员能够读取并重建质粒的完整序列。在一项新研究中，基因组病原体监测中心的研究人员和他们的合作者对来自欧洲范围内的79份肺炎克雷伯菌样本进行了长时间的基因组测序。研究小组从这些样本中产生了完整的质粒序列，并与来自同一调查的1700多份先前的短读测序肺炎克雷伯菌样本一起进行了研究，以了解抗生素耐药基因是如何在欧洲医院的细菌群中传播的。来自基因组病原体监测中心的第一作者Sophia David博士说：“为了全面了解抗生素耐药性是如何传播的，我们需要考虑质粒的作用。在这项首次在大陆范围内分析质粒遗传序列的研究中，我们发现了抗生素耐药基因通过质粒在肺炎克雷伯菌群中传播的三条主要途径。”包括一个质粒在多个菌株之间跳跃，多个质粒在多个菌株之间传播，以及多个质粒在一个菌株内传播。来自德国弗赖堡大学的Hajo Grundmann教授说：“这些关于肺炎克雷伯菌抗生素耐药基因传播途径的新见解对于控制抗生素耐药感染的爆发至关重要。了解了这些传播策略，就可以定制干预措施，要么控制显性质粒，控制优势菌株，要么在复杂的情况下，同时控制两者。例如，如果医院爆发疫情，而该菌株携带了一个高风险的质粒，那么该质粒就有可能跳入其他细菌菌株或物种中，那么必须对该菌株或物种进行更多监测。”研究小组还发现，当碳青霉烯酶基因被高风险菌株获得时，此时，编码碳青霉烯酶基因的质粒最容易传播。这加强了在医疗环境中通过早期检测和严格的感染控制来防止高风险菌株传播的重要性。基因组病原体监测中心主任、联合首-席作者davidaanensen教授说：“在追踪某些抗生素耐药细菌时，质粒是一个缺失的部分。分析细菌染色体和质粒的遗传序列可以让我们更详细地了解抗生素抗性基因和机制在人群中的传播。细菌的基因组监测应包括质粒和其他移动元件

外周神经组织可以将生物电信号从大脑传递到身体其他部位。而外周神经的损伤通常会导致慢性疼痛、神经紊乱、瘫痪或残疾。现在，研究人员已经开发出一种可拉伸的导电水凝胶，或许未来可以用于修复这些类型神经的损伤。近日，南京大学教授沈群东及其合作者在《美国化学会·纳米》杂志（ACS Nano）发表了这项研究结果。外周神经被完全切断的损伤，例如事故造成的深切口，是很难治疗的。一种常见的治疗策略被称为自体神经移植。它是从身体其他部位移走一段外周神经，然后缝在被切断神经的两端。然而，该手术并不一定能恢复神经功能，有时还需要多次后续手术。人工神经移植物与支持细胞相结合的治疗策略也被使用，但通常需要很长的时间神经才能完全恢复。对此，南京大学教授沈群东、南京工程学院副教授王倡春、南京鼓楼医院主任医师朱泽章等学者试图开发一种有效、迅速起作用的治疗方法来替代自体神经移植。他们决定探索导电水凝胶——一种可以传输生物电信号的遇水膨胀的生物相容性高分子。外周神经组织可以将生物电信号从大脑传递到身体其他部位。而外周神经的损伤通常会导致慢性疼痛、神经紊乱、瘫痪或残疾。现在，研究人员已经开发出一种可拉伸的导电水凝胶，或许未来可以用于修复这些类型神经的损伤。近日，南京大学教授沈群东及其合作者在《美国化学会·纳米》杂志（ACS Nano）发表了这项研究结果。外周神经被完全切断的损伤，例如事故造成的深切口，是很难治疗的。一种常见的治疗策略被称为自体神经移植。它是从身体其他部位移走一段外周神经，然后缝在被切断神经的两端。然而，该手术并不一定能恢复神经功能，有时还需要多次后续手术。人工神经移植物与支持细胞相结合的治疗策略也被使用，但通常需要很长的时间神经才能完全恢复。对此，南京大学教授沈群东、南京工程学院副教授王倡春、南京鼓楼医院主任医师朱泽章等学者试图开发一种有效、迅速起作用的治疗方法来替代自体神经移植。他们决定探索导电水凝胶——一种可以传输生物电信号的遇水膨胀的生物相容性高分子。

慢病毒包装：慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。慢病毒包装的优点：1、能将外源基因有效整合入宿主染色体，外源基因表达水平较高、表达稳定；2、广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞；3、适用范围广，可用于体外细胞系和活体动物模型，研究基因和RNAi等；4、转导效率高，不需要转染试剂，目的基因整合到宿主细胞基因组的概率大大增加。

也许你很难想象一片叶子、一块肌肉、一管血液都经历了什么，最后以核酸的形式呈现。核酸的提取是所有分子生物学研究的基础，核酸提取的质量、浓度的多少对于下游分子生物学实验的成败起着关键的作用，今天我们就说一说关于DNA提取的那些事儿。一. DNA提取原则1、保证DNA分子的完整性2、排除有机溶剂与金属离子的干扰3、排除蛋白质、多糖、多酚、脂类的污染4、获得高纯度的核酸5、方法操作简便，稳定性强二. DNA有哪些染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA、病毒/噬菌体DNA等。三. 样本的收集保存注：详细操作可参见《派森诺样品制备及质量要求》文件，可向当地销售或技术-支持索取。四. DNA提取原理及方法目前提取DNA的方法繁多，如CTAB法、SDS法、各种试剂盒等，但原理大致相同，主要是裂解和纯化两大步骤。首先对样品破壁裂解，采用机械力、化学试剂、酶等方法将DNA释放出来，随后去除蛋白质、糖、酚、金属离子等杂质，再用无水乙醇、异丙醇沉淀或载体吸附DNA，之后洗涤溶解即可得到核酸。虽然原理相似，但不同提取方法使用的试剂有很大差别，下面列举出在提取过程中，常用试剂的作用及原理：1、裂解相关试剂 （1）CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）:一种阳离子表面活性剂，在高盐溶液中，CTAB可与蛋白质和中性多糖形成复合物而沉淀，但不能沉淀核酸和酸性多糖，另外它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。（2）SDS（十二烷基硫酸钠）:一种阴离子去污剂，可使细胞膜崩解，与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离，使蛋白变性。（3）PVP(聚乙烯吡咯烷酮):是酚类化合物的螯合剂，可与多酚化合物形成复合体，使其不被氧化成醌类。（4）β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。（5）蛋白酶K：用于生物样品中蛋白质的一般降解，将蛋白质降解成小分子肽或氨基酸，使DNA分子分离出来。2.纯化相关试剂耗材（1）苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。（2）氯-仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯-仿中）。（3）异戊醇：少许异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，有助于分相，保持体系的稳定。（4）无水乙醇：沉淀DNA，不易沉淀盐类等物质；异丙醇也可沉淀DNA，体积小时间短，但易沉淀盐类物质。（5）核酸纯化柱：采用硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料（高盐低pH值结合核酸），同时去除其他杂质，可以最-大程度地回收样品中的DNA（低盐高pH值洗脱），可以用于各物种的DNA提取。操作简单、用时短、纯度高。（6）DNA提取磁珠：是一种核心为四氧化三铁、表面修饰大量硅羟基的磁性微球，能在高盐、低pH条件下和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合，而不与其它杂质（如蛋白）结合，可迅速从生物样品中分离核酸，操作安全简单，非常有利于核酸的自动化和高通量提取。五. 核酸的保存短时间（24h内）可放置4℃保存，长期（24h以上）放置于-20℃进行保存，期间避免反复冻融。对于纯度不高、总量较少、完整度不好的非高质量核酸，还需尽早进行后续实验，以防保存时间过长，DNA质量更受影响，进而影响建库和测序质量。以上为大家列举了在提取过程中经常用到的试剂及原理，给出了核酸保存的建议。要强调的是相同的原理下，不是试剂的去污、裂解效果越好就用的越多，还是要在实际提取过程中，根据提取材料的不同、提取结果的差异，灵活调整实验方案。

重组蛋白表达在现代生物学技术发展中起着重要的推动作用。通过利用宿主实现外源性蛋白表达,为一些重要蛋白尤其是人源蛋白的结构和功能研究的提供了强有力的工具。为了能够进行后续的结构功能研究，所获得的重组蛋白必须可溶，稳定，正确折叠以及具有生物活性。然而，实际研究中，这些往往成为获得一个理想重组蛋白的障碍。重组蛋白表达的可溶性成为首要解决的问题。因此，许多融合标签被引入。本文介绍下常用的促溶标签特点以及选择，希望对大家实验中遇到的重组蛋白溶解性问题有所帮助。常用促溶标签特点01 麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白（Maltose binding protein，MBP）是大肠杆菌K12品系中的一个自由蛋白，由malE基因编码，分子量为42kDa，属于大肠杆菌吸收和分解麦芽糖通路的一员。MBP标签最-出色的特点是它强大的促溶能力。主要表现在两方面：促溶范围广，促溶效率高。MBP标签得到广泛应用的另一个重要原因是它能够通过标签和直链淀粉特异结合并在10mmol/L麦芽糖非变性条件下洗脱，从而实现单极纯化。另外，将MBP融合在N端或C端都具有促溶作用。目前已经有商业化的MBP融合标签载体来适应研究需要。02 谷胱甘肽巯基转移酶谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S- transferase， GST）, 最初被发现于日本血吸虫，蛋白大小26kDa，是一个常用的可溶性亲和纯化标签。GST最-突出的优点是它能够与固定的谷胱甘肽产生亲和力，在10mmol/L还原型谷胱甘肽的非变性条件下洗脱，最终达到亲和纯化目的。GST对重组蛋白还有另一个有利作用，就是减少宿主内到那边的降解，增加蛋白稳定性。但是有报道指出GST的促溶效果并不十分明显。03 硫氧还蛋白硫氧还蛋白（Thioredoxins）是一系列广泛存在于生物体内的氧化还原酶，它能通过置换硫代二硫化物来减少二硫键的结合。常用作融合表达标签的硫氧还蛋白A(TrxA), 分量为11.6kDa，来源于大肠杆菌。TrxA标签最独特的优点是它的热稳定性。TrxA本身不作为亲和标签来进行重组蛋白优化，而是通过在高温条件下将杂蛋白变性去除而重组蛋白得以保存。TrxA也具有极好的促溶效率，用作促溶标签时可将重组蛋白的可溶性表达从12%提高至95%。04 小泛素样修饰蛋白小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-related modifier，SUMO）在真核生物中极为普遍存在，而原核生物中未曾发现。常用作融合标签的SUMO来源于啤酒酵母，分子量11.5kDa。SUMO标签最大的特点是能够被SUMO蛋白酶特异识别并高效降解，使得后续标签移除过程准确高效。SUMO标签不仅能够加强重组蛋白的可溶性，也能提高其表达量。由于真核细胞内存在内源性SUMO蛋白酶，所以野生型SUMO标签不能在真核表达体系中应用。LifeSensors公司已经开发出工程改造的SUMO标签及配套的特异性蛋白酶，使得SUMO标签可以适用于酵母，昆虫细胞和哺乳动物细胞等真核表达体系。05 NusA标签NusA蛋白（N-utilization substance A）是大肠杆菌中一类转录延长的抗终止因子，分子量约55kDa。由于NusA有着促进DNA转录和减缓翻译的生物活性，使得表达出来的蛋白有更多时间进行折叠，能让重组蛋白得到稳定和有活性的表达，即使不移除NusA标签，融合蛋白依旧能存在活性。06 其他促溶标签有很多促溶标签因其自身特有的性质，常用作有某种特定性质的目的蛋白融合表达。例如，来源于大肠杆菌的I型蛋白质二硫键异构酶DsbA具有高度亲水性，能够促进蛋白的可溶性表达。而且由于DsbA可以利用它具有的信号肽从细胞质向细胞周质间隙运输，可以利用这个标签进行蛋白分泌表达。砷酸盐氧化还原酶（ArsC）可以促进有聚集倾向的外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。促溶标签新的研究进展串联标签的使用膜蛋白的可溶性表达常用促溶标签的新衍生物新促溶标签的发现1.串联标签的使用TrxA, SUMO, NusA等这些促溶标签本身不能用于亲和纯化，所以需要和其他的亲和标签串联使用来对融合蛋白进行纯化，最-常见的亲和标签为多聚组氨酸标签（his-tag）。有些重组蛋白纯化后，需要将标签蛋白去除，最终获得目的蛋白进行后续结果和功能研究。常见做法是在标签蛋白和目的蛋白之前加入特定序列的多肽作为标签移除蛋白酶的识别位点，如肠激酶，Xa因子，TEV以及凝血酶（thrombin）等。这些蛋白酶将标签蛋白切除后，会在目的蛋白N端留下氨基酸残基，而SUMO标签的蛋白酶能够特异识别SUMO的三级结构并在其C端Gly-Gly序列后进行切除，通过这个方法能获得具有天然N段的目的蛋白。不同标签联合使用能产生不同的效果，这需要根据研究需求和目的蛋白特性来进行灵活组合，有研究者利用GFP绿色荧光蛋白的荧光特性，将GFP标签和MBP标签以及亲和纯化标签HIS 三级串联，用古语表达肝素酶I(HepA), 该方法不仅获得了高纯度可溶HepA, 还可以对目的蛋白生产过程中的生物活性实时监控。2.膜蛋白的可溶性表膜蛋白存在于脂质的生物膜上，具有疏水性，而且重组表达时容易出现表达和错误折叠等情况，所以膜蛋白的重组表达有很多困难。我们可以在需要表达的膜蛋白上融合促溶标签得到可溶重组蛋白。有研究表明，MBP, Trx和SUMO等标签，可以增加膜蛋白的溶解性和表达量，尤其是小分子量的膜蛋白（10-20kDa）。3.常用促溶标签的新衍生物为了使常用促溶标签能满足更多的应用需求，可以对现有标签进行改造或者寻找标签蛋白的其他物质表达形式。比如为了解决GST融合蛋白寡聚后导致的纯化洗脱困难，可以用硫-甲基化谷胱甘肽替代谷胱甘肽提高洗脱效果。来源于热球菌属的MBP可以作为耐热标签来表达热稳定的重组蛋白。4.新促溶标签的发现一些新兴的促溶标签正在不断被发现和应用。比如某些在噬盐细菌中应用的促溶蛋白正在被研究，并有希望成为独特的新型促溶标签。通过人工改造合成的多肽片段也可以作为促溶标签使用。标签选择在选择促溶标签的时候，应该充分考虑各种因素，如该标签是否可以用来亲和纯化，是否对目的蛋白空间结构和生物活性有影响，以及成本和技术路线简单快捷。在充分了解各标签的特点和自身需要的基础上做出合适选择。为了快速选择合适目的蛋白的促溶标签，目前比较可行的一个办法是在构建融合表达时，平行构建多个不同标签的促溶表达载体，根据表达纯化结果，进行重组蛋白的生产。

今天咱们来聊聊五种类型的生化试剂盒：多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒（比色法），血钾（K?）、甘油三酯（TG）、游离胆固醇（FC）、总胆固醇（TC）检测试剂盒（比色法）。五种生化试剂盒的研究意义多酚氧化酶（PPO）（EC1.10.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，属于一种氧化酶，通常在铜离子存在下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。钾离子对于维持机体的正常渗透压及酸碱平衡有非常重要的作用，参与糖及蛋白代谢，保证神经肌肉的正常功能。血清钾高于5.5 mmol/L时称高血钾，高血钾可使神经、肌肉应激性增高，使心肌应激性降低，导致心动过缓，血清钾超过10 mmol/L时，可发生心室纤颤，甚至心脏在舒张期停跳。血清钾低于3.5 mmol/L时称低血钾，低血钾可引起肌无力甚至肌肉弛缓性麻痹，引起心肌应激性增高，出现心动过速、心律紊乱甚至在收缩期停跳。因此，血清钾是常用生化测定指标。脂肪代谢是机体内非常重要的代谢途径之一，其在细胞内的存储和利用对于维持细胞正常的能量代谢非常关键，且在细胞内环境稳态的维持上发挥着不可忽视的作用。越来越多的研究显示脂肪代谢与肿瘤的发生发展有着一定的关系；细胞异常增殖是所有恶性肿瘤细胞的一个常见特性，在细胞异常增殖的过程中细胞膜和信号分子的形成需要更多的脂肪代谢中脂肪酸代谢和脂滴代谢的参与。一句话解读：1.多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒（比色法），多酚氧化酶（PPO）能够催化Catechol产生醌，后者在525 nm有特征光吸收，测定525 nm光吸收增加的速率进而计算多酚氧化酶（PPO）活性。该试剂盒适用的样本范围广泛包括血清、血浆、组织、细胞、细菌；而且细致优化了样本处理方法、实验操作流程以及结果计算过程。2.血钾（K?）检测试剂盒（比色法），血清中钾离子（K+）与四苯硼钠作用，形成不溶于水的四苯硼钾，产生的浊度在一定范围内与钾离子浓度成正比；通过测定其浊度来测定血清钾含量。该试剂盒提供了一种简单的检测方法检测血清样本中钾离子（K+）的含量水平；而且细致优化了样本处理方法、实验操作流程以及结果计算过程。3.甘油三酯（TG）检测试剂盒（比色法），用异丙醇抽提取TG，KOH皂化TG后水解生成甘油及脂肪酸，Periodic acid氧化甘油生成甲醛，在氯离子存在下甲醛与Acetylacetone缩合生成黄色物质，在420 nm有特征吸收峰，其颜色的深浅与TG含量成正比。该试剂盒提供了一种简单的检测方法检测动物组织、细胞、血清（浆）以及植物样本中甘油三酯（TG）的含量水平；而且细致优化了样本处理方法、实验操作流程以及结果计算过程。4.游离胆固醇（FC）检测试剂盒（比色法），胆固醇氧化酶催化游离胆固醇（FC）生成△4-胆甾烯酮和H2O2，过氧化物酶催化H2O2、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，在500 nm有吸收峰，其颜色深浅与FC含量成正比。该试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本如动物组织、细胞（细菌）、血清（浆）中游离胆固醇（FC）的含量水平；而且细致优化了样本处理方法、实验操作流程以及结果计算过程。5.总胆固醇（TC）检测试剂盒（比色法），利用酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆固醇酯转化为FC；进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化，生成△4-胆甾烯酮和H2O2；最后利用过氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林和酚，生成红色醌类化合物；在500 nm有特征吸收峰，其颜色深浅与TC含量成正比。该试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本如动物组织、细胞（细菌）、血清（浆）中总胆固醇（TC）的含量水平；而且细致优化了样本处理方法、实验操作流程以及结果计算过程。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。那么免疫共沉淀实验的注意事项有哪些呢？远慕生物为您介绍一下：1、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或 Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％ SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。2、使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。3、使用对照抗体：① 单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗② 兔多克隆抗体：正常兔 IgG4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：① 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。② 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。③ 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

质粒小量提取试剂盒常见从1～4mL菌液可以抽提到5～30?g的质粒，纯度高，OD260/OD280比值一般为1.8-2.0之间，质粒可直接用于PCR、酶切、转化测序和体外转录等后续实验。那么在实验过程中常见问题有哪些，下面跟小编一起来看一下。质粒得率低可能原因及解决办法：1、菌体未活化，生长效率低，菌量少。需要活化菌种。2、属于低拷贝质粒，增加菌液的量。3、SolutionB裂解不充分，室温静置5min。4、最后洗脱体积不够，洗脱液不少于50?L。质粒纯度差可能原因：1、SolutionA未加入RNaseA或加入RNaseA的SolutionA 未4℃保存。2、加入SolutionB剧烈震荡，使得基因组断裂。3、加入BufferN操作慢，形成微小沉淀，蛋白质无法被充分漂洗干净。4、BufferW2未加入无水乙醇。5、OD260/OD280比值一般在1.8-2.0之间，小于1.8可能有蛋白污染，大于2.0有部分降解或RNA污染。

生物试剂的运输一直是被忽略的一个问题，由于生物制品由蛋白质、脂肪、糖和核酸组成，在运输和保存过程中必须防止失活。存储运输可用干冰或者固体二氧化碳、温度为-78℃，一般为冷冻条件的温度。生物试剂其保存条件也是很严格的，否则容易失去活性。下面介绍几种常用科研试剂的储存方法。ELISA试剂盒的储存方法1、 未开封的试剂盒：所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将标准品、检测溶 液 A、检测溶液 B 以及 96 孔板保存于-20℃，其余试剂请置于 4℃ 保存备用。2、 使用后的试剂盒：剩余试剂仍需按照试剂瓶标签所示的温度保存，此外，请将未使用酶标条用包含干燥剂的铝箔袋装好，并拉紧密封铝箔袋，置于-20℃保存。蛋白的储存方法避免反复冻融。2-8°C不超过一个月，-80°C不超过12个月。抗体的储存方法经常使用则4°C保存。-20°C保存不超过两年。避免反复冻融。注意事项：检测/鉴别精确，稳定性强，为了防止产品含量降低，不宜暴露在空气中，应防潮、避光和抗氧化包装，保存应以提高物质稳定性为原则，尽可能在干燥、低温条件下储藏。该产品实验时必须在专业人士的指导监督下进行操作，严格按照相关法律法规正当处理使用后的废弃物，不要或旧的试剂。使用时要一次性用完，若不足或剩余要更加注意其保管和管理。操作前请参照相关法规、文献、MSDS等信息理解并掌握好试剂的特性，戴好防护用具再进行安全操作;该产品主要用于教学、科学研究、分析测试中。我们提供的试剂产品品质优良，都是通过严格的检测体系认证。

ELISA 实验中，实验者经常会遇到样本测值低的问题，样本类型包括血清、 血浆、组织匀浆、细胞裂解液等。假设客户的操作完全正确，标准曲线良好， 这种情况样本测值低可从两方面进行分析：一是样本本身含量可被检测，但由 于实验操作等原因导致样本测值不在试剂盒检测范围内；二是分析物在样品中 本身浓度偏低。下面将从这两个方面来进行分析导致样本测值低的因素以及对 应的解决方案。1.样本本身含量可以被检测，有哪些原因导致测值低呢？1）试剂盒的保存试剂盒要按照规定的方法保存，实验者在购买试剂盒时请务必留心试剂盒 不同组分的保存方法。如优尔生的试剂盒建议检测液 A、检测液 B、标准品以及 酶标条等储存在-20 度，而其它标准品稀释液等储存在 4 度。2）样本上样前的准备这个过程包括样本的制备、保存以及是否有经历过反复冻融。样本的制备 要根据样本类型采用不同的方法，血清、血浆与细胞裂解液的制备方法均不同。 保存，包括保存温度以及保存时间。一般推荐样本制备后进行分装后储存在-20 度或-80 度，储存时间不宜过久，因为长时间的储存有可能导致目标蛋白的降解， 致使检测结果不理想。最后注意不要反复冻融，蛋白样本反复冻融会导致降解发生。3）稀释方案样本的稀释对于实验的成功至关重要，稀释过度以及稀释不足均有可能导 致样本的测值低。稀释过度：一般情况下客户都会根据文献测值，以及检测范围估计一个稀 释倍数，优尔生的试剂盒在出厂之前也会做大量检测，对于常规样本如血清血 浆，我们也会根据实验室样本测值情况推荐一个稀释倍数。但实验者如果直接 按照估计或推测的稀释倍数进行稀释检测后，发现样本 OD 非常低。这是由于文 献作者用的样本，优尔生实验用的样本与实验者的样本会存在一定的差异，这 些测值有一定的参考意义，但如果照搬，可能会导致实验失败。所以建议实验 者在正式试验前是先做预实验确定样本的有效性以及最-佳稀释倍数。预实验， 可参考文献，将样本进行梯度稀释，最后选取样本 OD 落在标准曲线中间位置的 点的稀释倍数。稀释倍数不够：钩状效应，Elisa 实验中发生钩状效应主要是当抗原与抗体 比例不合适而导致假阴性的现象，抗原过量称为后带效应。当样本中目标物含 量很高，而没有进行正确的稀释，就有可能会导致假阴性反应。解决方案依旧 同稀释过度的解决方案一样，在正式实验之前做预实验。2.分析物在样品中本身浓度偏低很多时候，客户操作没有问题，标准曲线良好，但检测多次样本依然不在 检测范围。像细胞因子，如 IL-6 需在炎症刺激情况才会大量产生，一般非炎症 样本测值会非常低。针对这种测值比较低的情况，一般建议根据文献选取适合 的样本类型，同时可以选用高灵敏度的试剂盒，优尔生针对某些容易出现测值 低的指标都有研发出高灵敏度的试剂盒，如 IL-6 等。以上就是实验者在实验过程会遇到的样本测值低的部分原因，以及一些分 析以及解决方法。当然，具体问题还需具体分析。成功的 Elisa 实验依赖于质 量过硬的试剂盒，恰当处理的样本以及良好的操作技能。

干细胞顾名思义——干什么都行的细胞，在医学界，干细胞又被称为全能干细胞或者万用细胞，是一类具有自我更新能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。人类很多疾病诸如心肌梗塞、糖尿病、帕金森病等，均涉及细胞(如脑细胞、心肌细胞、胰岛细胞)的死亡。现代医学研究表明，成人身体器官内藏着极为稀少的干细胞，当身体组织受到破坏或细胞功能衰退时，这些隐伏的干细胞便会活跃起来，替代和修复死亡、受损及衰老的人体组织和细胞，恢复正常功能。干细胞技术最显着的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，用以治疗诸多用传统方法难以治愈的疾病，具有不可估量的医学价值，给人们带来了希望。干细胞是生命起源和进化的种子细胞，是新生命个体产生、组织器官发生和发育的源泉细胞。干细胞能修复组织、器官创伤和病损，是机体组织和器官的再生细胞；干细胞能自我复制，整体寿命比任何功能性体细胞都长几十倍，是长寿细胞；干细胞能合成分泌多种因子、多肽和蛋白，例干细胞因子、生长因子等，具有促进生长、再生和修复作用，是生物活性细胞、衰老的调控细胞。具有分化和增值活性的干细胞，进入机体后，可替代和修复机体衰老、病变及受损的组织细胞，恢复组织器官的正常功能，并有效调节人体各系统功能，促进新陈代谢，最大程度的恢复机体年轻态，提高生命质量。干细胞之所以能治愈白血病，亦是因为造血干细胞好比人体造血器官的种子，我们的红细胞、白细胞、血小板等都是由它分化成熟而来的。造血干细胞移植能重建、恢复造血系统，是目前治疗白血病最为有效的方法。

ELISA是蛋白定量的金标准，也是免疫学研究中最-常用的实验方法之一。很多人觉得ELISA很简单，其实不然。远慕生物带你绕开ELISA实验中出现的各种问题，轻松搞定ELISA实验~酶联免疫吸附实验1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。酶联免疫吸附（ELISA）用于：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位；（2）研究抗酶抗体的合成；（3）显现微量的免疫沉淀反应；（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。优点：快速、灵敏、定性、定量、定位实验原理1.包被：抗原/抗体，固相化2.反应： 1)待测抗体/抗原； 2)酶标抗原/抗体3.洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离4.底物显色：定性/定量分析常用的酶与底物：酶底物显色测定波长辣根过氧化物酶horseradish peroxidase,HRP邻苯二胺（OPD）橘红色492nm四甲基联苯胺（TMB）黄色450nm碱性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸盐(p-NPP)黄色405nm终止液：2mol/L  H2SO4 常用方法1.间接法检测抗体最-常用的方法, 主要用于对病原体抗体的检测。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：交互反应发生的机率较高2.双抗体夹心法检测大分子抗原最-常用的方法。优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。3.竞争法检测小分子半抗原（药物、激素等）。优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。缺点：整体的敏感性和专一性都较差。常见问题分析Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最-佳。 Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。 推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。 Q3.标曲显色，样本不显色当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最-高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。 Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。Q5.本底偏高，样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。 在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色-情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。 Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢？ 这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。 Q7.不同试剂盒中的组分能否通用除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液，其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的组分，有可能对结果产生影响 

ELISA 即酶联免疫吸附测定，是一类常用的免疫酶技术。主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后利用酶标记（偶联）的抗体或抗原与之孵育，加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，绘制出酶活曲线得出待测物浓度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。ELISA实验中有三种必要的试剂：① 固相的抗原或抗体（用于结合到固相载体上）② 标记的抗原或抗体（标记物）③ 作用的底物（显色剂，用于显色）四种常见ELISA方法1.直接ELISA将抗原固定于ELISA板上，然后用酶标抗体直检测抗原。相较于其它类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA板结合，实验背景会比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。2.间接ELISA先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。与直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济。间接ELISA还提供了更大的灵活性，因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。3.夹心ELISA先将捕获抗体固定于ELISA板孔中，然后加入样品，接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；如果检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。夹心ELISA的灵敏度高，它比直接或间接ELISA敏感2-5倍；同时夹心ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性。另外夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测，灵活性较高。夹心ELISA的缺点是对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。4.竞争ELISA法预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体；如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最-后加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。竞争ELISA相对以上介绍的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式。其主要优点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。ELISA常见问题与解决方法1. 阴性对照出现阳性结果① 样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂，小心操作。② 酶标板洗涤不彻底——洗板前先将抗体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充分洗涤。③ 抗体量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体，稀释抗体到适当浓度。2．酶标板整体背景高① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合。② 底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间。④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的，若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶液。⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。3. 复孔之间重复性差① 样品数量不整齐，加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与第1次接近。② 加样量不一致——样品稀释前应充分混匀，并且使用同一移液枪。③ 洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时，操作条件、人员应尽可能与上次保持一致。4. 吸光值偏高或偏低① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量。② 加入抗体量不合适会造成结果偏低或偏高——使用建议抗体量或为了使结果更好尽可能调整抗体的最-适用量。③ 孵育时间太短导致检测结果偏低——适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合。④ 孵育温度不适合——应保证抗体在最适宜条件下进行孵育（一般37℃孵育1h）。

上海远慕生物科技有限公司在广大科研用户的帮助和支持下，经过多年不懈的努力，已成为国内生命科学试剂（Elisa试剂盒）的国-际运营商之一。上海远慕生物Elisa试剂盒“双十一”热销，所有Elisa试剂盒均提供免费代测服务，全程提供实验技术指导。“双十一” 期间,我司所有Elisa试剂盒全部五折起,优惠多多快快抢购吧!活动时间:即日起至11月15日24时结束活动产品:全场Elisa试剂盒活动力度:全场七五折起本活动最-终解释权由远慕生物决定!公司所售elisa试剂盒总体优势：快速简便——说明书详细，试剂完整，操作方便；精-确度高——板间（inter）及板内（intra）差异性（cv）小；重复性好——批次间的一致性高；批内精-密度（测定法精-密内）：cv％间精-密度（精-密检测间）：cv％特异性强——我们选择zui佳抗体-抗原配对；结果可靠——每个产品都经过仔细筛选、严格检验、质量高、实验结果可信；优质口碑——产品引用文献居行业第1位；技shu支持——专业而强大的技shu支持团队，解决客户后顾之忧。远慕生物Elisa试剂盒订购说明：1、绝大部分产品备有现货，一般情况下都能订货当日发货。2、每日订单截止时间为16点整，部分城市可到17点整，因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。3、部分非常用产品，需提前1－2日预订，海外期货则需要提前3-6周预订。4、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化，若有变动以订货当日价格为准。5、请办理完货款后，将shou据、底单等连同收货人的地址、姓名、等以chuan真、、短信、等形式通知我们。

近年来，活细胞成像活跃于生物学的各个领域。在它的加持下，研究者们可以实时或者在一段时间内观察细胞内部结构和细胞生理过程，从而加深对细胞运作过程的认识。但在各种实验操作和成像条件下，想要成功做好活细胞成像实验并不容易。1、实验前我们先了解一下，什么是活细胞成像，它有哪些作用？通常，我们把使用延时成像技术开展活细胞研究简称为「活细胞成像」。通过活细胞成像技术，可以研究靶标参与的动态生命过程，酶活性、信号转导、蛋白与受体转运以及膜的再循环过程（内吞与胞吐）等动态进程都可实现检测。2、我们在实验中又应该注意些什么？众所周知，活细胞需保持在天然的生理条件范围内，包括 pH、温度、O 2 水平和渗透压等等，维持细胞的健康和功能活性十分重要。所以，实验设计和操作过程中需特别注意：须通过特定方法实现以最小毒性标记靶标——无论是靶分子、细胞功能还是细胞状态；活细胞通常很难允许某些大的检测分子通过；移动的观察目标更难保持聚焦；使用的检测技术是否对活细胞有损伤。当然，随着实验需求不断变化，需要注意的点也会有所不同。举例来说，研究细胞生长与细胞分裂的实验可能与研究受体激活等实验就具有明显不同的需求。一些强健的永生化细胞系能在无专门环境控制的条件下忍受短时成像；在某些短时成像实验中，使用较大的培养基体积可避免由于挥发所导致的渗透压和含氧量变化问题；而对于长时成像研究，除了在培养基中添加碳酸氢盐缓冲系统外，使用带有加热模块可控制温度、湿度与 CO 2 的小培养室或大温控箱来精-确控制环境也十分重要。随着活细胞成像的普及，对实验中荧光基团标记的要求也越来越高，活细胞成像实验如何实现更好的荧光标记？ 一起奉上如下注意事项：如需长时间曝光，请尽量选择用更长波长的荧光试剂，长波长试剂只需较低的激发功率，具有更低的光毒性，可以提供更健康的细胞状态；推荐针对特定的检测读值、光谱兼容性和信噪比对染色进行优化；去除标记溶液，并使用新鲜配制的培养基冲洗，可减少背景荧光；搭配多种荧光基团实现多重标记，推荐使用荧光光谱查看器，以确保荧光染料间光谱重叠最小。 

实验原理细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体 依赖性和 增殖能力两个重要性状。克隆形成的目的1）通过对细胞处理后在细胞培养板上的克隆形成能力来提示处理后细胞的增殖能力。2）评价不同杀伤因素(药物、基因等)对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性;3）评价细胞在体内成瘤性，癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是一种模拟体内成瘤的体外实验。克隆形成的分类克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。1. 平板克隆形成（Colony formation）：细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞。2. 软琼脂克隆形成（soft agar colony formation）：细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。下面我们就具体看一下这2种实验技术的具体操作。01平板克隆实验过程所需材料· 基础培养基（根据细胞选择适用种类）· 胎牛血清· 胰蛋白酶· PBS· 青霉素-链霉素溶液（100X）· 多聚甲醛固定· 结晶紫染液· Giemsa染液实验步骤一、6孔板1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔）;3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次；5.每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min；6.PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。注意事项1.每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。2.染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。二、平皿1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）中备用。2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。3.置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。6.去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟7.用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于 10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%注意事项平板克隆形成实验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。数据分析显微镜下观察阳性克隆，即每个克隆>50个细胞，相机拍照，数克隆数（大小约在0.3-1.0 mm）计算克隆形成率，并统计克隆大小。例：如研究某个基因对细胞增殖的影响，敲低前列腺癌细胞株PC3的TCTN1基因，显微镜下拍照（Scale bar=250 μm）和相机拍照，克隆的大小和数量均受到抑制。02软琼脂克隆形成软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验Anchorage-independent assay，利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，进而通过软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。1. 具体过程：如下图所示 1.配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固；2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，37°C过夜，拍照。2. 数据分析：显微镜或相机拍照，计算克隆形成率例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少。注意事项1.上层软琼脂使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑防止细胞贴附生长。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物。2.上层胶细胞数目根据不同的细胞类型而定。一般以5000个细胞/孔作为起始浓度，根据需要调整。3.琼脂放入水浴锅中维持在42℃左右。温度过低琼脂凝固，在做基底时琼脂凝固过快会导致不均一，温度过高则会将细胞烫死。此外，实验过程中速度要快，防止局部结块。2种细胞克隆方式，如何选择那？根据实验对象和目的选择，平板克隆检测贴壁肿瘤细胞的增殖能力和致瘤性，软琼脂克隆形成实验除了检测贴壁细胞，还能检测悬浮肿瘤细胞和转化细胞系，具有平板克隆不可取代的优势。若只是简单评价贴壁细胞的增殖能力和群体依赖性，则选择平板克隆即可。

01、流式的染色条件？一般推荐室温避光染色20分钟，或4℃染色30分钟。具体请参照抗体说明书。02、流式抗体偶联荧光素的方式？包括直接标记和间接标记两种。在条件允许的范围内，尽量用直接标记的抗体。如果选择了间接标记的抗体，一抗是纯化的抗人的一抗，那么用纯化的一抗和荧光标记的二抗。如：一抗是小鼠源的抗人的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）。胞内因子染色，用直接标记荧光染料的抗体。03、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，可以将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3/CD4/CD8/IL-4/IFN-γ，那么将样本分成两份，第1份加CD3/CD4/CD8/IL-4，而第2份加CD3/CD4/CD8/IFN-γ。04、什么是同型对照？和FMO区别是什么？同型对照：用于确定抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，主要是考虑了细胞的自发荧光、Fc受体介导的非特异性结合等因素。对流式不是非常熟悉，做流式胞内实验，检测指标的特异性不高等几种情况下，必须搭配同型对照。荧光扣除对照(Fluorescence Minus One, FMO):又称染色缺一对照，在抗原表达弱或者多色实验时（＞4色）使用，可以反映抗体组合中其他通道荧光的渗漏，确定阳性细胞的阈值，可作为设门的依据。05、如何选择同型对照？与染色的单克隆抗体：1）相同种属来源2）相同免疫球蛋白及亚型3）相同荧光素标记4）相同剂量和浓度5）最-好来自于同一家公司06、流式设门要考虑哪些因素？排除细胞碎片；进行死活鉴定；应用合适的阴性对照；分群不明显的，根据同型对照和FMO圈出阳性比例；查阅文献了解阳性比例。07、Fc受体封闭单核细胞、B细胞、DC细胞、NK、巨噬细胞、粒细胞、肿瘤细胞等高表达 FcR，在检测这些细胞时，会与抗体的Fc段非特异性结合，产生假阳性信号。因此，流式检测这些细胞时，推荐使用相应物种的血清或者商品化的Fc受体封闭剂。08、7AAD单染管调节补偿，如何猝死细胞？一般是加热65℃处理一分钟。09、流式抗体可以做免疫荧光吗？理论上是可以的。抗体的浓度需要自己去摸索，以流式抗体的用量为参考。对于表达弱的抗原，抗体标记的荧光强度不够，需要选择荧光强度高的染料。直接标记的流式抗体容易淬灭，建议染色后马上在荧光显微镜下观察结果。10、什么是补偿微球？由于荧光光谱的重叠现象，在进行流式多色分析时，必须设置单染管进行荧光补偿调节。对于初学者来说，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作，尤其是遇到一些不太常见的指标，需要经验丰富的流式操作者根据多年的经验判断来调节补偿，才可以得到比较好的数据。补偿微球大小和淋巴细胞相当，可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。可以像待测的样本细胞一样在相同的实验条件下固定，破膜等，操作起来简单方便，结果准确。克服了以往做三色以上的流式分析时补偿难调，耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节），专业要求高等缺点。11、染色指数是什么？染色指数（SI）可用于比较不同荧光染料在流式细胞术应用中荧光亮度的差异。该值通过使用阳性区域的平均荧光强度（MFI）减去阴性区域的平均荧光强度得到的差值，再除以两倍的阴性区域标准差获得。染色指数越大，荧光强度越高。进行抗体滴度的时候，根据染色指数来选择最-佳的抗体用量。12、除PI之外，还有哪些常见的核酸染料？1）7AAD，488nm激光器激发，用PerCP通道；2）DAPI，蓝色荧光染料，355和405nm激光器激发；3）Hochest33342, 蓝色荧光染料，355nm激光器激发。13、胞内细胞因子检测，如何处理细胞？细胞因子必须被诱导分泌才可以用流式细胞术检测到。常用的刺激剂包括PMA、ionomycin、LPS、CD3/CD28，同时加入莫能菌素和BFA阻断剂，防止细胞因子分泌到胞外。刺激剂的种类，浓度和刺激时间都可以影响细胞因子分泌的水平。14、为什么会产生高背景和噪音？实验中有噪音和高背景可能有以下几个原因，如PMT电压设置不当、死细胞和碎片干扰、荧光信号的溢漏，细胞具有较强的自发荧光等。15、在单染管调节补偿时候，为什么串联染料不可以用相同荧光素不同标记来替代调补偿？串联染料的抗体光谱不完全相同，会导致错误的补偿。

　　牛血清是一种浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。内含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性起到生理平衡作用。　　牛血清根据对不同年龄的牛采血得到的血清也不相同，大体分为4类：　　1、胎牛血清（Foetal Bovine Serum，简称FBS）：采自5-8个月胎龄牛胚胎中的胎血；　　2、新生牛血清（Newborn Calf Serum，简称NBCS）：采自出生一天~一周内的新生牛；　　3、小牛血清（Calf Serum）：采自出生10－30天的小牛；　　4、成年牛血清（Adult Bovine Serum，简称ABS）：采自成年牛收全血后分离得到血清。　　我国本土国产血清也因地域环境原因不能规模量产和技术差异等问题，目前在细胞培养领域胎牛血清我国以进口血清为主。　　因携带疯牛病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、狂犬病毒等传染性风险，在北美血清禁运后，目前国内市场上进口的血清主要来自于南美和澳洲。　　特别是澳洲，因从来没有发生过疯牛病和口蹄疫，在畜牧业被认为是全球纯净的大陆，成为了优质牛血清的血源首选。　　养细胞不易，选对好血清，更是养好细胞的头等大事，希望以上信息对你有所帮助。

　　试剂空白是指由于测试试剂本身而带来的测试结果的微小的正误差。远慕努力使其生产的测试试剂的空白值为负，特别指出的是由于这个负的空白值非常小，从而不会影响测定的准确度。　　测试试剂的空白值对于一项测试尤为重要，当进行低浓度测定时应该从测试结果中扣除测试试剂的空白值。例如，如果从0.06mg/L的低浓度测试结果中减掉0.02mg/L的试剂空白值，就会使zui终测定结果改变至少30%。而从1.23mg/L的高浓度测试结果中减掉0.02mg/L的试剂空白值，zui终测定 结果只发生了2%的变化。　　测定试剂的空白值时，需要使用高质量的去离子水代替待测样品，加入测试试剂，按照操作步骤，进行常规测试。然后，从样品的测定结果中减去测试试剂的空白值。不同批次的测试试剂其空白值会有所变化，所以，当使用不同批次的测试试剂时，需要重新对它的空白值进行测定。　　样品空白是指在某项测试程序中，使用某个样品的浓度作为仪器的零基准。样品空白可以抵消加入测试试剂前由于样品自身存在的色度或浊度而引起的正误差。　　在使用样品空白对测试仪器进行调零后，只有样品与测试试剂发生反应而产生的色度被测定了。由于样品的背景色度和浊度往往各不相同，样品空白经常用来对仪器进行调零。　　生物试剂的使用常识：　　（1）试剂切忌与手接触（有些试剂有强腐蚀性、等特性）。　　（2）要用洁净的药勺，量筒或滴管取用试剂，绝-对不允许用同一种工具同时连续取用多种试剂。取完一种试剂后，应将工具洗净（药勺要擦干）后，才可取用另一种试剂。　　（3）试剂取用后一定要将瓶塞盖紧，不可放错瓶盖和滴管，绝不允许张冠李戴，用完后请及时将瓶放回原处，以免遗忘，带来不便。　　（4）已取出的试剂不能再放回原试剂瓶内（怕产生原试剂的再次污染）。

　　大家都知道，微生物具有分布广泛、生长繁殖能力强、种类繁多、易培养、易变异及代谢能力、适应能力强等特点，目前存在于各类型餐饮业、食品加工行业等各个环节，其指标若是不能够达到规定的相关标准，便会危害到人类的健康，因此，微生物检测服务是非常重要的项目之一。　　微生物检测方式目前都是以直接检测和间接检测为根据，从其重量、体积、密度、浓度、做指标来进行衡量的。那比较常见的微生物检测方法有哪些呢？接下来就跟随小编的步伐，一起去了解一下吧：　　微生物检测之重量检测法　　重量检测法也就是通过称重的方式来进行，利用离心或过滤法测定。一般情况下，干重是湿重的百分之十五左右，这种方式比较繁琐。若是微生物为菌体，大部分都会采取这种方式，如活性干酵母这种，以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。　　微生物检测之体积测量法　　体积测量法也就是平时所说的测菌丝浓度法，这种检测方法是通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况，这种类型的检测方式比较简单、快捷、粗放，由于离心沉淀物中会夹杂各种固体营养物，在检测之前需要设定一致的处理条件，不然会导致结果有很大的偏差，该检测方式目前已成为大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。　　在进行微生物检测服务的实验开始之前，一定要制定好实验计划和操作程序，将有关数据的计算提前做好，并准备好所需器材和物品，清点无误后将其放置操作场所内，如培养室、超净台等，然后开始消毒，切记要避免开始实验后，由于所需物品准备不全而往返拿取，进一步增加污染机会。　　微生物检测过程中，原则上是和进行外科手术的要求一致，由于平时只需要做观察，不必进行复杂的培养操作，因此，可以穿细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服来进行，除此之外，在利用超净台进行操作时，需要整只手臂深入箱内，因此，必须穿着长袖的清洁工作服，并且在开始操作之前，必须要用含量为75%的酒精对手进行一定的消毒。　　若是在微生物检测的时候将手不小心触及或者是可能沾染到一定量的污染品，一定要用消毒酒精或者消毒液进行洗手，再进行微生物检测的时候，需要多次出入培养室，这种情况也是需要使用消毒酒精或者消毒液洗手的，出入过程中，除了洗手消毒以外，还要戴好口罩，穿戴好消毒衣帽。

一、无菌操作要求1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。3、无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，也可以用雾化过氧化氢设备，法国欧菲姆设备实用，便捷。4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法1、灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。2、装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3、设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）。②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。4、灭菌温度与时间（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。（2）压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间（二）间歇灭菌方法1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性。4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。四、有毒有菌污物处理要求微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30min高压灭菌。4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。五、培养基制备要求培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。2、PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。7、目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。六、样品采集及处理要求1、所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。（3）按规定采样数量不足者。对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。七、记录和报告的要求1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

一、埃利希(Ehrlich)氏苏木精染液先将苏木精2g溶于100mL乙醇中，再加冰醋酸10mL，混合后加蒸馏水100mL和100mL甘油，然后加硫酸铝钾(约10g)至饱和，搅拌均匀，倒入瓶中。将瓶口用1层纱布包着小块棉花塞上，放在暗处通风的地方，并经常摇动促进“成熟”，直到液体颜色变为深红色为止。成熟时间约2-4周。若加0.4g碘酸钠可加快成熟。二、吉姆萨(Giemsa)氏母液将吉姆萨粉末1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66mL)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。然后再加入甲醇(66mL)，搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。临用时用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。  三、瑞(Wright)氏染液   称取瑞氏染料粉末0.1g于研钵内研细后，加入少量甲醇再反复研磨，最后将全部甲醇(总共60mL)加入研匀，染料全部溶解后，将染液保存于棕色瓶内备用。四、醋酸洋红染液   将洋红粉末1g倒入100mL45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸(沸腾时间不超过30s)，冷却后过滤，即可使用。也可再加入1%～2%铁明矾水溶液5-10滴，至此液变为暗红色而不发生沉淀为止。如制作永久标本染色时，可加入饱和氢氧化铁或醋酸铁(媒染剂)溶液数滴，至染色液呈浅蓝色为止。  五、硫堇染液(工作液)①干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后过滤备用；②醋酸钠缓冲液：醋酸钠·3H2O 9.7g，巴比妥钠14.7g，溶于500mL蒸馏水中；③0.1 mol／L盐酸；按①：②：③=40：28：32比例配成混合液，调pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。   六、0.02%盾纳斯绿B(Janus Green B)用0.9%生理盐水溶液配制。   七、甲基绿—派洛宁染液(Unna试剂)派洛宁0.25 g，甲基绿0.15g，95%乙醇20mL，甘油20mL。将以上试剂混合溶解后用0.5%苯酚水溶液稀释至100 mL。八、卡诺(Carnoy)氏液配方1：无水乙醇3份，冰醋酸1份，混匀即可。配方2：无水乙醇6份，冰醋酸1份，氯仿3份，混匀即可。九、酸性生理盐水的配制  将10mL 0.1 mol/L盐酸加入300mL生理盐水中，调整其pH值至2.5～3.5。十、迈耶(Mayer)氏蛋白甘油粘贴剂取一个鸡蛋的蛋清，充分搅拌成泡沫状，然后用粗滤纸或双层纱布过滤，经过数小时即可滤出透明蛋白液。再加入等量的甘油并轻轻摇动，使两者混合。最后加入少许麝香草酚防腐。可保存几个月，半年以后不宜使用。   十一、血管注射标本色剂   红色色剂：银珠3g，明胶15g，蒸馏水100mL；蓝色色剂：普鲁士蓝1 g，明胶15g，蒸馏水100mL。将银珠和普鲁士蓝分别在研钵内研细，加入温水少许搅和，将明胶和蒸馏水倒入250mL烧杯内，置水浴锅中隔水加热沸腾使明胶完全熔化，过滤后分别倒入盛有银珠和普鲁士蓝的研钵内搅拌均匀。最后分别倒回烧杯中，并置入水浴锅内保温。水温视明胶浓度而定。亦可用代用品淀粉(2份)、甲醛(1份)、甘油(1份)、水(6-8份)和其他红、蓝色染料进行配制。先将淀粉、甲醛和甘油混匀，再加入染料进行搅拌，逐渐加入水调匀。十二、红细胞稀释液   称取氯化钠0.5g, 硫酸钠2.5 g, 氯化高汞0.25 g，用蒸馏水溶解至100mL.  十三、白细胞稀释液       取冰醋酸1.5mL和1%龙胆紫1 mL，混匀，加蒸馏水至100mL。十四、碘酒称取碘2 8和碘化钾1.5g，先加入少量的75%乙醇搅拌，待溶解后再用75%乙醇稀释至100mL。十五、碘液   碘l g、碘化钾2g,蒸馏水300mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，最后用水稀释至1000mL。十六、肝素溶液   纯的肝素10mg能抗凝100mL血液。如果肝素的纯度不高或已过期，所用的剂量应增大2-3倍。一般可配1%肝素于0.9%生理盐水中使用。   十七、草酸盐抗凝剂称取草酸铵1.2s、草酸钾0.8 g，加蒸馏水至100mL。为防止霉菌生长，可加40%甲醛溶液1 mL。十八、柠檬钠抗凝剂常配成3%-5%蒸馏水溶液。每毫升血加3-5mg即可达到抗凝目的十九、D—76显影液称取米吐尔28g，无水亚硫酸钠100g，几奴尼5g，硼砂2g，依次逐个溶解于750mL(50 ℃)的水中，最后加水至1 000 mL。二十、D—72显影液称取来吐尔3.1g、无水亚硫酸钠45 g,几奴尼12g,无水碳酸钠67.5g,溴化钾1.9g，依次逐个溶解于 750mL(50℃)的水中，最后加水至1000mL。   二十一、SB—1停显液  取28%醋酸48mL稀释至1 000mL。(28%醋酸用98%浓度的冰醋酸3份，加水8份混合而成。二十二、F—5酸性定影液  称取硫代硫酸钠240g，无水亚硫酸钠15g，醋酸(28%)45 mL、硼酸7.5g，硫酸铝钾15g，依次逐个溶解于 700mL(50℃)的水中，最后加水至1000mL。

原代细胞培养的应用1、为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段；2、为传代培养创造条件；3、服务于临床实践，用于药物筛选等。原代细胞培养之分离注意事项1、组织块培养法1）组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。2）加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。3）当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。4）为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。2、贴壁型原代细胞1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。2）适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。3）尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。3、悬浮型原代细胞1）必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。2）能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。原代细胞培养问题解答1、原代细胞与细胞系有什么区别？根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。但实际上，经过长时间、连续的传代培养后，细胞系随着代数的增加，细胞的基因型和表型都有可能发生改变。需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群，除非细胞经过了遗传改造。2、倍增和代数有什么区别？倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。3、接收到的冻存细胞该如何处理？收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快，以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。4、冻存的细胞该如何开始培养？(1) 将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。(2) 将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。(3) 将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。(4) 用70％的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。(5) 打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹（注意，由于冻存管有负压，开盖时可能会有少量溢出，这是正常现象）。(6) 用多聚赖氨酸（或参照说明书）包被培养瓶。多数细胞推荐的接种密度为每平方厘米5000个细胞。(7) 盖好培养瓶的盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。(8) 将培养瓶放入培养箱中（37℃，5%CO2，95%空气）(9) 放入培养箱后第6-16小时更换一次培养基，以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。5、细胞培养过程中，多久更换一次培养基？这取决于细胞生长的速度。一般而言2-3天更换一次培养基，许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。注意：冻存细胞复苏后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚枫和死亡的细胞。6、我能扩增培养和再次冻存原代正常人类细胞吗？这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。7、培养瓶中应该加入多少体积的培养基？我们推荐的用量为：T-25培养瓶5ml，T-75培养瓶15ml，T-150培养瓶30ml。

细胞培养基是动物细胞培养中不可缺少的部分，但是培养基的种类很多，对于不同的细胞类型及其研究目的，采用合适的培养基进行细胞培养才能起到很好的效果。关于胎牛血清的主要技术指标，小编总结了以下两点：1、内毒素内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有成分。当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。国际上规定，胎牛血清的级别，应以内毒素水平的高低来确定，其中，特级胎牛血清的内毒素应2、微生物包括细菌、霉菌、支原体、噬菌体、各类病原性病毒等，严格的生产工艺可以对细菌、霉菌等“大型”微生物几乎能100%控制，同时最后3次0.1μm过滤，可以完全祛除支原体（支原体直径0.2-0.3μm）。通过病毒的检测，可以严格控制牛腹泻、牛细小、蓝舌病等病毒。但牛体内病毒并不是每一种都会检测，如果用于工业特别是临床相关项目，往往会采用γ照射的胎牛血清。（如Ausbian?细胞治疗专用血清）即使如此，疯牛病（朊病毒）也无法祛除和检测。只能通过非疯牛病疫区采血生产来避免。