在生物课上你可能已经做过这个实验了：从池塘里取一些水来，用滴管吸一些，小心地滴一滴到载玻片上，再盖上盖玻片，然后迫不及待地将其放在显微镜下进行观察……你会看到在这一滴池塘水中，有很多奇妙又微小的生物在里面游动。这些只有在显微镜下才能够被我们观察到的生物，就是“微生物”。你一定认识那只长得像草鞋的微生物——大草履虫。在微生物群体中，它可算得上是大块头了，体长300微米左右，是微生物群体中原生动物类的代表。你听说过大肠杆菌吗？作为典型的细菌，一个大肠杆菌从头到尾的长度只有2微米。还有体型更小的类群呢——病毒。一般病毒的直径只有0.3微米左右，用那个刚才你用来看草履虫的光学显微镜想看到病毒是不可能的。要想看清病毒的模样，必须使用放大倍数更高的电子显微镜。将一滴水展平在载玻片上，直径大概是1厘米（相当于10000微米）。如果你想知道一滴水中有多少微生物，那么只需要做几道算术题，就能得到答案了。如果能够将微生物首位相接，一字排开地码放在展平后的水滴直径上，草履虫能放33只，大肠杆菌可以码5000个，病毒的承载量至少是33000个……可是，自然水域中的微生物世界并没有这么有秩序，它们不会一字排开、只待在水滴中央不动，而是根据不同水体中的资源分布情况，趋利而生。所以，要问一滴水中有多少微生物？答案会因为水体的不同、微生物种类不一而出现多种多样的答案。2012年美国加州大学圣巴巴拉分校的海洋微生物学家发现，在百慕大海域，海洋表面的“噬菌体”病毒的数量达100万。而同样是取自海面之下的海水中的一滴水中，“噬菌体”病毒的数量就骤减了。如果从微生物的种类上来考虑，最/丰富的集散地莫过在池塘中了。一滴池塘水中，可能同时发现有：轮虫、绿藻、草履虫、细菌和病毒……平常看起来波澜不惊的池塘里，原来是这么的热闹啊。千万不要小看这些肉眼看不见的小家伙，在我国2006年新制定的《生活饮用水卫生标准》中，新增加了4项与微生物相关的指标。其中包含着对于一种名叫“隐孢子虫”的检查。在这之前的25年中，隐孢子虫一直被认为是威胁人类的重要病原之一。隐孢子虫的虫体随着动物粪便排出体外，通过活卵囊在环境中传播。当卵囊进入水体或动物体内后，就会威胁到人类的健康。1993年美国wisconsin州的密尔沃基（milwaukee）市爆发了由隐孢子虫引发的水传染病，共使40万人致病，50人死亡。记住！在自然界中，并不是肉眼看起来清澈的水就是可以喝的，当心水中那些对你有害的小家伙们。现在在水体检测的过程中，仍然需要使用显微镜对微生物进行检测。那么，你知道谁是第一个用显微镜观察到微生物的人吗？是荷兰的商人兼科学家列文虎克（antonivanleeuwenhoek），他利用自己改造的显微镜首先观察并描述了单细胞生物、肌肉纤维、细菌、精/子以及毛细血管中的血流状态等，人们称他为微生物学之父。列文虎克在一生中磨制了500多个镜片，并制造了400多种放大倍数不同的显微镜，下次进入实验室的时候，好好看一看你手中的显微镜，它们就是从列文虎克时代流传下来不断改造而成的，它们是打开微生物世界大门的金钥匙。

化学试剂在贮存时常因保管不当而变质。有些试剂容易吸湿而潮解或水解；有的容易跟空气里的氧气、二氧-化碳或扩散在其中的其他气体发生反应，还有一些试剂受光照和环境温度的影响会变质。因此，必须根据试剂的不同性质，分别采取相应的措施妥善保存。一、 防挥发：1．油封：氨-水，浓盐酸，浓硝酸等易挥发无机液体，在液面上滴10～20滴矿物油，可以防止挥发（不可用植物油）。2．水封：二硫-化碳中加5mL水，便可长期保存。汞上加水，可防汞蒸气进入空气。汞旁放些硫粉，一但失落，散布硫粉使遗汞消灭于化学反应中。3．腊封：乙-醚、乙醇、甲酸等比水轻的或易溶性挥发液体，以及萘、dian等易挥发固体，紧密瓶塞，瓶口涂腊。溴除进行原瓶腊封外，应将原瓶置于具有活性炭的塑料筒内，筒口进行腊封。二、防潮：1．漂白粉、过氧化钠应该进行腊封，防止吸水分解或吸水爆炸。氢氧化钠易吸水潮解，应该进行腊封；硝酸铵、硫酸钠易吸水结状，倒不出来，以至导致试剂瓶破裂，也应严密腊封。2．碳化钙、无水硫酸铜、五氧化二磷、硅胶极易吸水变质，红-磷易被氧化，然后吸水生成偏磷酸，以上各物均应存放在干燥器中。3．浓硫酸虽应密闭，防止吸水，但因常用，故宜放磨口瓶中，磨口瓶塞应该原配，切勿对调。4．“特殊药品”的地下室，下层布块灰，中层布熟石灰上层布双层柏油纸，方可存放药物。三、防变质：1．防氧化：亚硫酸钠、硫酸亚铁、硫代硫酸钠均易被氧化，瓶口应涂腊。2．防碳酸化：硅酸钠、过氧化钠、苛性碱均易吸收二氧化碳，应该涂腊。3．防风化：晶体碳酸钠、晶体硫酸铜应进行腊封，存放在地下室中。4．防分解：碳酸氢铵、浓硝酸受热易分解，涂腊后，存放在地下室中。5．活性炭能吸附多种气体而变质，（木炭亦同），应放在干燥器中。6．黄磷遇空气易自燃，永远保存水中，每15天查水一次：磷试剂瓶中加水、置于有水水糟中，上加钟罩封闭。7．钾、钠保存在火油中。8．硫酸亚铁溶液中滴几滴稀硫酸，加入过量细铁粉，进行腊封。9．葡萄糖溶液容易霉变，稍加几滴甲醛即可保存。10．甲醛易聚合，应开瓶后立即加少量甲醇；乙醛则加乙醇。四、防光：1．硝酸银，浓硝酸及大部份有机药品应该放在棕色瓶中。2．硝酸盐存放在地下室中既防热，又防光、防火还能防震。3．有机试剂橱窗一律用黑漆涂染。4．实验室用色布窗帘，内红外黑双层。五、防毒害：1．磷、硝酸银、氯酸钾、氯-化汞等剧毒物放地下室内，双人双锁，建立档案，呈批取用，使用记载，定期检查。2．磷化钙、磷化铝吸水后放出剧毒性磷化氢，应放在干燥器中保存，贴上红色标签。3．由于没有通风橱，经常在地面布石灰，吸附某些毒害气相物质。4．浓酸，浓碱、溴、酚等腐蚀的药物，使用红色标签，以示警戒。六、防震：1．硝酸铵震动易爆炸，放地下室中。2．自制的大晶体明矾、大晶体硫酸铜，用软纸垫包放大口试剂瓶中，进行缓冲，并按“四位数字”进行编号入厨。七、防火：1．在仪器室“大门附近”、“显眼”、“顺手”的地方设置水缸、消防桶、砂缸、泡沫灭火器及四氯化碳一瓶。泡沫灭火器药物，每年更新一次。（如有“CCl4”或“1211”灭火器更好）2．室内电线一律换成暗线，以防药物熏蒸，短路走火。八、防鼠：1．浆糊中适当多调一些苯酚。2．对“指示剂”一橱药品，放一些易挥发的药物例如甲醛、煤酚皂等。鼠害严重的橱中，可交替存放浓盐酸和浓氨水。用以保护其他药品。3．用醋酸铅调浆糊涂在鼠洞口四壁，老鼠出入时污染皮肤，舔而毙命（醋酸铅味甜而剧-毒）。1. 中学化学实验室药品保存时注意下列几个方面：（1）瓶的选择：固体——广口瓶，液体——细口瓶。见光易分解的物质——棕色瓶。如：硝酸、硝酸银、氯水等。（2）瓶塞的选择：碱性溶液不能用玻璃塞，应该用橡胶塞。如：NaOH溶液、Na2CO3溶液等强氧化性溶液、有机溶剂不能用橡胶塞，应该用玻璃塞。如：硝酸、高锰酸钾溶液、汽油、苯等。（3）采用液封法保存的物质：钠——煤油；白磷——水；液溴——水；四氯化碳——水等。（4）易与空气中物质反应的物质要密闭保存。如：与水反应（吸水）的物质：CaCl2、碱石灰等与CO2反应的物质：NaOH、Ca（OH）2、Na2O2等与O2反应的物质：FeSO4、Na2SO3、C6H5OH、Na2S等（5）特殊物质的保存：HF——保存在塑料瓶中。

PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最-好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无。原因：1、模板:含有抑制物，含量低。2、Buffer对样品不合适。3、引物设计不当或者发生降解。4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。2、更换Buffer或调整浓度。3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。4、降低退火温度、延长延伸时间。问题二：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带。原因：1、引物特异性差。2、模板或引物浓度过高。3、酶量过多。4、Mg2+浓度偏高。5、退火温度偏低。6、循环次数过多。对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR。2、适当降低模板或引物浓度。3、适当减少酶量。4、降低镁离子浓度。5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。6、减少循环次数。问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因：1、模板不纯。2、Buffer不合适。3、退火温度偏低。4、酶量过多。5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。6、循环次数过多。对策：1、纯化模板。2、更换Buffer。3、适当提高退火温度。4、适量用酶。5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。6、减少循环次数。问题四：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物。原因：靶序列或扩增产物的交叉污染。对策：   1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3、各种试剂最-好先进行分装，然后低温贮存。

一、什么情况下做药敏试验做药敏试验的原则是只对与感染相关致病菌或可能致病菌做药敏试验，否则将导致不必要的治疗。做药敏需考虑的主要因素如下：1、标本来源（1）无菌部位标本分离的细菌最-具临床意义如脑脊液、血液、体液和骨髓等。血、无菌体液标本中分离的任何细菌均需做药敏试验，除外血培养单次分离的芽孢杆菌属、棒状杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌（不包括路登葡萄球菌）；除外无菌体液中分离的芽孢杆菌属。如果多次培养分离出以上所示同一种细菌，仍需做药敏试验）。（2）来自正常菌群或污染部位的标本需做药敏试验的情况如伤口、脓肿和来自其他污染部位标本，培养生长1或2种中量或大量可能病原菌；质量合格痰标本培养生长1或2种中量或大量可能病原菌。对正常菌群或污染菌不做药敏试验。2、不能预测治疗用药的敏感性如伤口分离的化脓链球，因通常对青霉素敏感，不用做药敏试验；如伤口分离的金黄色葡萄球菌，因敏感性不可预测，需做药敏试验。3、定量培养以下情况需做药敏试验：（1）中段尿标本菌落计数>10^5CFU/ml，且分离到1种或2种可能致病菌；女性有临床症状患者分离到1种致病菌，菌落计数≥10,000CFU/ml；从65岁以上患者留置导尿管取尿标本，菌落计数>10,000CFU/ml纯培养；直接导尿或膀胱镜等采集尿标本，纯培养或分离到2种致病菌，每种菌的菌落计数均>1000CFU/ml。（2）静脉插管尖端分离的凝固酶阴性葡萄球菌>15个菌落。4、其他微生物的存在和定量正常菌群的存在和定量是重要的考虑因素。通常对纯培养细菌做药敏试验，混合细菌生长是否做药敏试验不确定。需做药敏试验的定量培养支气管镜采集标本: 保护毛刷标本生长≥10^3CFU/mL、支气管肺泡灌洗液生长≥10^4CFU/mL（或半定量为中量/大量并多于正常菌群）分离培养出的下呼吸道致病菌、厌氧菌（只限保护毛刷标本）、定量计数≥10^3～10^4CFU/mL纯培养物、任何数量的铜绿假单胞菌等。5、患者年龄分离自特定年龄组的一些细菌有必要做药敏试验，如痰培养正常菌群中存在中量流感嗜血杆菌，2岁儿童患者需做药敏试验，而成年患者不做药敏试验。6、独特的宿主因素（1）正常免疫患者遵循一般规则；免疫抑制患者对一些条件致病菌也需做药敏试验；（2）对选用药物过敏，如从青霉素过敏患者分离的化脓链球菌，用红霉素治疗无反应，需做药敏试验。二、哪些情况无需做药敏试验1、对天然耐药的细菌/抗菌药物组合与获得性或突变耐药相反，天然（固有）耐药是几乎所有细菌种的特性。药物的抗菌能力临床表现不足或固有耐药，将导致临床治疗无效。这种情况下无需做药敏试验。肠杆菌科对三代头孢菌素、头孢吡肟、氨曲南、替卡西林/棒酸、哌拉西林/他唑巴坦和卡巴培南类无天然耐药。枸橼酸杆菌属、产气肠杆菌属、变形杆菌属、普罗菲登菌属、粘质沙雷菌对其他β-内酰胺类（青霉素类及酶抑制剂复方药物、一代、二代头孢菌素和头霉素等）有不同程度的天然耐药谱。了解细菌的天然耐药可评价试验方法的准确性；可帮助识别常见表型；可帮助核实累积药敏试验的数据；出现1%～3%的敏感结果可能是方法学差异、突变、或低水平耐药表达造成的。应审核上述报告中“敏感”的结果，并重复试验以确认鉴定和药敏结果是否正确。2、不能常规报告的菌株/抗菌药物对从脑脊液分离的菌株不能常规报告的抗菌药物，除了口服抗菌药物、第1、二代头孢菌素（头孢呋辛注射剂除外）、克林霉素、大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类，还包括头霉素类药物（如头孢西丁、头孢美唑和头孢替坦）。3、腐生葡萄球菌引起尿路感染无需常规做药敏腐生葡萄球菌引起尿路感染无需常规做药敏试验。4、对临床少见菌不必常规做药敏试验对临床少见菌及苛养菌引起的感染无需做药敏试验，临床通常经验性用药，仅当临床需要或重症感染时，或药敏结果对治疗很重要时才做药敏试验。因此，准确鉴定病原菌直接影响到临床选药和治疗。多杀巴斯德菌属及侵蚀艾肯菌（常见于动物咬伤感染）常规用药为阿莫西林/棒酸。棒状杆菌属、JK棒状杆菌、解尿棒状杆菌通常对β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类耐药。红斑丹毒丝菌和多数乳杆菌属对万古霉素天然耐药；产单核李斯特菌对头孢菌素类天然耐药；明串珠菌属、片球菌属对万古霉素天然耐药但对β-内酰胺类、氯霉素和氨基糖苷类敏感。卡他莫拉菌产β-内酰胺酶，对青霉素和氨苄西林耐药，但很少对大环内脂类耐药。在经验性治疗时应避免使用天然耐药的药物。三、依据药敏标准，选择正确的药敏方法1、只用MIC方法检测的情况（1）根据标本来源：CSF标本中分离的肺炎链球菌必须用可靠的MIC法常规检测并报告青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南结果。分离株来自细菌性心内膜炎、脑膜炎、败血症、骨髓炎、免疫抑制患者、人工瓣膜、人工关节感染，当临床治疗无效时，用MIC法检测。分离于正常无菌部位（如脑脊液、血液和骨髓等）的草绿色链球菌对青霉素和氨苄西林，用MIC法检测。（2）根据菌株/抗菌药物：检测肺炎链球菌的头孢吡肟、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、头孢呋辛、厄他培南、亚胺培南需用MIC法；葡萄球菌属和肠球菌属对达托霉素，肠球菌万古霉素中介、洋葱伯克霍德菌对氯霉素、左氧氟沙星和替卡西林/棒酸，嗜麦芽窄食单胞菌对头孢他啶和替卡西林/棒酸，其他非肠杆菌科细菌（包括假单胞菌和其他非苛养的、非发酵葡萄糖的革兰阴性杆菌）药敏试验。2、选择正确的药敏方法金黄色葡萄球菌的头孢西丁纸片法或MIC法可判断mecA 阴性或阳性。用头孢西丁和苯唑西林同时检测金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌，只要其中一个耐药，既报告“苯唑西林耐药”。一些苯唑西林MIC在0.5～2μg/mL的凝固酶阴性非表皮葡萄球菌并不携带mecA基因，苯唑西林折点（≥0.5μg/mL）高估了这类菌的耐药性，因此，由这类菌引起的严重感染，应补充检测mecA或PBP2a，或采用头孢西丁纸片法确认。头孢西丁纸片法是检测mecA介导的苯唑西林耐药表型的凝固酶阴性葡萄球菌的最-好方法。大部分路登葡萄球菌不产mecA基因，75%菌株不产β-内酰胺酶，但采用金黄色葡萄球菌药敏折点。检测葡萄球菌对万古霉素敏感性应采用MIC法，纸片法不能区分金黄色葡萄球菌的敏感与中介（VSSA和VISA）及凝固酶阴性葡萄球菌的敏感性。万古霉素纸片（30μg）可检测含vanA基因的VRSA，纸片周围完全没有抑菌环，需确认菌株鉴定结果。四、对罕见耐药表型复核结果1、罕见的耐药表型是指一些细菌对特殊的抗菌药物尚未报道过耐药，或极少见耐药，如：流感嗜血杆菌对卡巴培南类、第三、四代头孢菌素、氟喹诺酮类不敏感，对氨苄西林耐药但不产β-内酰胺酶；淋病奈瑟菌对第三、四代头孢菌素不敏感；脑膜炎奈瑟菌对第三、四代头孢菌素、对美罗培南、米诺霉素不敏感；肺炎链球菌对利奈唑烷、万古霉素不敏感；β-溶血链球菌对氨苄西林或青霉素、第三、四代头孢菌素不敏感；草绿色链球菌对达托霉素、厄他培南或美罗培南、万古霉素不敏感；金黄色葡萄球菌万古霉素中介度等。2、对罕见耐药表型应采取措施对于只有敏感解释标准，而检测为非敏感的菌株，应采取如下措施：（1）换一种方法复核鉴定和药敏结果或送参考实验室；药敏结果复核应采用CLSI参考方法，如肉汤微量稀释法、琼脂稀释法或纸片扩散法，或一种FDA通过的商品化试验。（2）金黄色葡萄球菌万古霉素MIC≥8μg/mL结果属罕见，对感染控制和公共卫生部门有重要意义；有些凝固酶阴性葡萄球菌万古霉素中介，但万古霉素耐药菌株少见。（3）应对C群和G群β-溶血链球菌确认是大菌落，如果氨苄西林或青霉素不敏感则是罕见耐药表型；而小菌落C群和G群β-溶血链球菌归到草绿色链球菌群，药敏解释标准有所不同。五、连续监测治疗中重复分离株的耐药性发展开始对某种抗菌药物敏感的菌株在治疗后可发展为中介或耐药，故应对再次分离的相同菌株做药敏试验；如治疗后3～4天可出现耐药的情况：1、三代头孢菌素治疗肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属，这类细菌因产生去阻遏AmpC型β-内酰胺酶而发展为耐药；2、所有治疗铜绿假单胞菌的抗菌药物及治疗葡萄球菌的喹诺酮类；3、万古霉素敏感金黄色葡萄球菌（MRSA）在延长疗程期间可发展为中介（VISA），MIC为4～8μg/mL,适合的方法用Etest或含6μg/mL万古霉素脑心浸液平板。实验室应了解患者的特殊情况和病情的严重性（如从早产儿血培养中分离出阴沟肠杆菌），并与临床医师协商后明确对重复分离菌株何时重复检测药敏试验。六、通过检测耐药机制，正确解读药敏结果1、β-内酰胺类药物的耐药机制（1）对葡萄球菌临床分离株检测甲氧西林耐药是强制性的。所有对甲氧西林、苯唑西林和/或头孢西丁耐药或mecA基因、PBP2a试验阳性的葡萄球菌，应认为对现有的β-内酰胺类耐药，包括青霉素类、β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂复合药物，头孢类（除外新的抗苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌活性的头孢菌素，如头孢洛林和头孢吡普）和碳青霉烯类体外可能敏感，但临床无效。（2）肺炎链球菌：对β-内酰胺类耐药较常见，用苯唑西林纸片筛选试验，抑菌圈直径为20mm以上，则报告青霉素敏感；若直径为19mm以下，则需对无菌部位来源的菌株检测青霉素、头孢噻肟/头孢曲松或美罗培南MIC值并报告敏感性。（3）草绿色链球菌：为肺炎链球菌开发的苯唑西林纸片筛选试验用于草绿色链球菌不够敏感，青霉素和氨苄西林必须检测MICs。如果青霉素耐药则需检测氨苄西林（阿莫西林）和头孢噻肟（头孢曲松）的MICs，且不能根据青霉素结果判断头孢菌素和卡巴培南的敏感性。（4）肠球菌属：如果氨苄西林耐药则报告对脲基青霉素类和碳氢霉烯类耐药，肠球菌属因产β-内酰胺酶引起的耐药机制非常罕见，屎肠球菌对氨苄西林耐药是因PBP5导致对β-内酰胺类药物的亲合力降低。（5）肠杆菌科：肠杆菌科细菌的耐药机制复杂，按照检测耐药机制判断头孢菌素和卡巴培南的敏感性报告药敏结果已带来很多问题，2010年后CLSI根据药代动力学/药效学（PK/PD）性能评价和有限的临床资料，修订了部分头孢菌素（头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟和头孢曲松）和氨曲南、碳青霉烯类药敏判断折点，并注释了新折点对应的用药方案。EUCAST标准认为，降低肠杆菌科对头孢菌素、氨曲南和碳青霉烯类的敏感判断折点，既可检测出有“临床意义”的耐药机制，包括ESBL、质粒介导的产AmpC酶菌株；卡巴培南酶（A、B和D类酶）及联合（去阻遏AmpC酶或产ESBL和通透性降低等）耐药机制，而无需做ESBL或改良Hodge（MHT）确认试验，缩短了报告时间；且动物模型、PK/PD分析及蒙特卡罗公式均支持这种修订，临床效果与MIC值的相关性也好于报告产ESBL。采用修订后折点，可减少因报告产ESBL而更多使用卡巴培南类和氟喹诺酮类药物，可减少对产卡巴培南酶等耐药机制菌株的选择性压力[9]。对于常规使用纸片法，以及能升级至2010年后CLSI药敏标准新折点的商品化药敏系统（药敏测试浓度能覆盖新修订折点及软件升级）的实验室，从个体化治疗、医生选药方面来看，特别是各级医院开始执行政府抗菌药物分级管理的背景下，采用修订折点是有积极意义的。CLSI还重新评估了头孢菌素及静脉用头孢呋辛、头孢吡肟、头孢替坦和头孢西丁的折点，头孢西丁现有折点仍符合当前临床试验数据和PK/PD；头孢替坦因无足够数据支持而未改变折点；头孢呋辛和头孢吡肟依据标准推荐的剂量治疗不用更改折点。CLSI未评估拉氧头孢、头孢西尼、头孢孟多和头孢哌酮的折点，如果考虑使用这些药物治疗大肠埃希菌、克雷伯菌或变形杆菌引起的感染，仍需进行ESBL试验。（6）流感嗜血杆菌：产ß-内酰胺酶引起对氨苄西林和阿莫西林耐药（TEM-1型）。而β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药株（BLNAR）的耐药机制是ftsI 基因发生突变，导致PBPs对ß-内酰胺酶的亲和力降低，BLNAR菌株对氨苄西林与ß-内酰胺酶抑制剂的复方药物、一代和二代头孢菌素耐药。（7）淋球菌：产ß-内酰胺酶阳性造成对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药。用ß-内酰胺酶试验可快速、准确检测质粒介导的青霉素耐药。染色体介导的耐药通过纸片法或琼脂稀释MIC法检测。2、大环内脂类药物的耐药机制虽然大环内酯类，林可酰胺类和链阳菌素具有不同的化学结构，但却有类似的作用机制，并可受相同的耐药机制影响。如果检测到所有菌对红霉素敏感，中度敏感或耐药，可根据红霉素结果报告同一类药物的敏感性，如红霉素、克拉霉素。如果葡萄球菌属、来自青霉素严重过敏妊娠妇女的B群链球菌时，红霉素耐药但克林霉素敏感，需做克林霉素诱导试验（D试验）检测MLSb 的耐药情况，若为阴性，则报告克林霉素敏感；若为阳性，由于产生了rib耐药基因使MLSb耐药或产生泵的外排机制，则报告克林霉耐药，并说明“根据诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药。在某些病人克林霉素可能仍有效”。氨基糖苷类高水平耐药试验可检测一个特定氨基糖苷类药物与ß-内酰胺类或糖肽类药物是否存在协同作用。喹诺酮类抗菌药物对革兰阴性菌及革兰阳性菌分别以DNA促旋酶及拓扑异构酶IV作为首要作用靶位，所引起的耐药表型与耐药机制的关系在此不再赘述。综上所述，不论是CLSI药敏标准还是EUCUST药敏标准，由于目前临床折点的含义并不都是最-佳折点，因此，根据微生物、PK/PD和临床效果不断修订后的结果，应能显示出MIC值与临床预期效果更符合，药敏标准的发展方向是预测抗感染治疗的预后，而不是为了能检测细菌中出现的所有耐药机制。

1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。3.4菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。3.5污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管3.6菌种的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。菌种的传代保藏过程 3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。　（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。菌种的使用及销毁每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃ 高压蒸汽灭菌30分钟。并对操作过程进行记录。

1.所用溶剂“水”，系指蒸馏水或去离子水，在未注明有其他要求时，应符合中国药典“纯化水”项下的规定；2.采用间接配制法时，溶质与溶剂的取用量均应根据规定量进行称取或量取，并使制成后滴定液的浓度值应为其名义值的0.95～1.05；3.采用直接配制法时，其溶质应采用“基准试剂”，并按规定条件干燥至恒重后称取，取用量应精-确至4～5位有效数字的精-密称定，并置1000mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；4.配制浓度等于或低于0.02mol/L的滴定液时，除另有规定外，应于临用前精-密量取浓度等于或大于0.1mol/L的滴定液适量，加新沸过的冷水或规定的溶剂定量稀释制成；5.配制成的滴定液必须澄清，必要时可滤过；并按药典中各该滴定液项下的条件贮存，经标定其浓度后方可使用；6、试液配制后,其标签有规定的颜色,如指示剂要用红色,标准液用绿色，普通试液用蓝色等，化学试剂按其纯度分成不同的规格，国内生产的试剂分为四级分别为：一级品：保证试剂“优级纯”标签用绿色，用作基准物质，用于分析鉴定及精-密的科学研究；二级品：分析试剂“分析纯”标签用红色，用于分析鉴定及一般性科学研究；三级品：化学纯粹试剂“化学纯”标签用蓝色，用于要求较低的分析实验和要求较高的合成实验；四级品：实验试剂，棕、黄或其他，用于一般性合成实验和科学研究。

化学试剂是进行化学研究、成分分析的相对标准物质，是化学实验重要的消耗性物资，广泛用于物质的合成、分离、定性和定量分析。试剂的有效日期是影响实验结果准确性的重要因素。在实际使用过程中，人们总是习惯于用生产日期来判断化学试剂的有效性，其实这是不对的。化学试剂不像食品和药品有严格的保质期，化学试剂一般没有保质期的具体要求和界限，这与化学试剂的保质期受多方面因素影响有关，要根据化学性质、保存条件等，再结合工作的实际情况判断试剂是否出现变质、能否继续使用。下面看看各种因素对化学试剂有效期的影响吧！化学试剂的性质对有效期的影响化学试剂一般没有注明保质期，确定试剂是否变质主要是凭经验和做新旧试剂对比试验。化学试剂的有效期随着化学品的化学性质的改变，有着很大的区别。一般情况下，化学性质稳定的物质，保存有效期就越长，保存条件也简单。一般遵循以下几个原则（一般原则，不是绝对原则）：无机化合物，只要妥善保管，包装完好无损，理论上可以长期使用。但是容易氧化（如亚硫酸盐、苯酚、亚铁盐、dian化物、硫化物等应将其固体或晶体密封保存，不宜长期存放；水溶液亚硫酸、氢硫酸溶液要密封存放；钾、钠、白磷更要采用液封形式）、容易潮解的物质，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。有机小分子量化合物，一般挥发性较强，包装的密闭性要好，可以长时间保存（3～5年），但容易氧化、受热分解、容易聚合、光敏性物质等，在避光、阴凉、干燥的条件下，只能短时间（1～5年）内保存，具体要看包装和储存条件是否符合规定。有机高分子，尤其是油脂、多糖、蛋白、酶、多肽等生命材料，极易受到微生物、温度、光照的影响，而失去活性，或变质腐-败，故此，要冷藏（冻）保存，而且时间也较短。基准物质、标准物质和高纯物质，原则上要严格按照保存规定来保存，确保包装完好无损，避免受到化学环境的影响，而且保存时间不宜过长。一般情况下，基准物质必须在有效期内使用。在常温（15?C~25?C）下保存时间一般不超过 2个月，超过两个月要重新标定或检查之后再用。培养基，按规定配制并消毒好培养基，冷至室温，保存在阴暗处（尽可能贮藏在冰箱内），配制好的培养基应在1个月内用完。除另有规定外、试液、缓冲液、指示剂（液）的有效期均为半年。液相用的流动相、纯化水有效期为15天。除另有规定外，液体试剂开启后一年内有效，固体试剂开启后三年内有效。化学试剂保存环境对有效期的影响1.空气的影响：空气中的氧易使还原性试剂氧化而破坏。强碱性试剂易吸收二氧化碳而变成碳酸盐，水分可以使某些试剂潮解、结块；纤维、灰尘能使某些试剂还原、变色等。2.温度的影响：试剂变质的速度与温度有关。夏季高温会加快不稳定试剂的分解；冬季严寒则促使甲醛聚合而沉淀变质。3.光的影响：日光中的紫外线能加速某些试剂的化学反应而使其变质（例如，银盐、汞盐、溴和dian的钾、钠、铵盐和某些酚类试剂）。4.杂质的影响：不稳定试剂的纯净与否、对其变质情况的影响不容忽视。例如纯净的溴-化汞实际上不受光的影响，而含有微量溴化亚汞或有机物杂质的溴-化汞遇光易变黑。5.贮存期的影响：不稳定试剂在长期贮存后可能发生歧化聚合，分解或沉淀等变化。在贮存期和有效期内液体如发现有分层、浑浊、变色、发霉等异常现象，流动相用于样品检测时，样品的保留时间或相对保留时间发生明显变化，固体如发现吸潮、变色等异常现象则应停止使用。化学试剂的使用要求对有效期的影响大多数化学品的稳定性还是比较好的，具体情况要由实际使用要求来判定。如果分析数据作为一般了解，或者分析结果没有特定的准确要求，如一般教学实验，对化学试剂的质量级别就可以做一般要求。但工厂化验数据为指导生产而用，化学试剂的质量指标绝对不能含糊。而用于一般合成制备使用的化学试剂，在大多数情况下，使用工业级别的化学试剂就可以满足。但研究型和某些特种化学品的合成制备，有些情况下，对原料的质量要求非常严格，需要严格把关。对于储存期久的试剂可以用在要求不高的检测任务中，对可能变质的试剂可以与新购的试剂对比使用来判断是否变质了。只要化学性质不变，没有引入杂质原则上都能用。本文给出一个试剂有效期的参考表，具体的试剂的有效期会根据各个实验室的环境条件、使用条件，试验目的不同而不同，不能绝对的给个有效期，最-有效判定有效期的标准是，试剂的使用不能影响测试结果。

二氧化碳培养箱为细胞生长提供了理想的生长环境，细胞在培养箱中培养数月甚至数年，如果培养不当导致细胞死亡可能造成极大的科研成果损失。培养箱本身性能的稳定和可靠性固然重要，另外，正确的使用方法和日常保养对实验结果也是至关重要。今天为大家介绍减少实验室细胞污染的三种途径：1、正确的使用培训。实验室内往往众多实验人员共用一台培养箱，难免有人为操作失误，都会增大交叉污染的风险，因此应对所有实验人员进行培养箱的使用培训。需要注意以下几点：设备使用培训使用培养箱前必须着个人防护装备，按照实验室生物安全等级要求实施实验室管理规范、无菌操作方法、标准操作流程（SOP）。实验服袖口需扎进手套内，未扎进的袖口可能接触到洁净的培养基，会增加交叉污染的风险，另外裸露皮肤上的可能潜在的污染源也会增加交叉污染的风险；手套使用前用70%常用消毒剂消毒；培养瓶、培养盘、培养皿等在放入培养箱前需做好标记；从箱子后部依次往前摆放培养基，以免最早放置的被过多干扰。近期需要取出的材料放至靠近箱门处并做好标记；带盖的长颈瓶应远离箱门以避免交叉污染；避免堆叠太多培养基；避免干扰细胞生长尽量少开箱门。人员操作培训建立完善的实验室管理规范；新进实验员应建立培训流程；实验室内应定期或不间断进行操作培训；做好详尽的文件记录，文件记录不仅单纯的记录实验室事件，对设备定期维护、实验数据查找都能起到很好的提示和记录，比如提示每周检查过滤器、记录开门频率对细胞生长的影响。2、持续的日常维护保养培养箱日常维护保养对其性能的保障非常重要，甚至比操作技术失误对实验结果的影响更大。做好培养箱的日常维护不仅减少对实验结果的影响更能延长培养箱的使用寿命，降低实验室成本。完善的文件管理厂商提供的操作维护说明书是很好的参考文件，会列举日常使用及保养需注意的要点，可以作为实验室培养箱维护文件的参考。制定维护保养文件时需全面考虑培养箱使用频率、实验室环境洁净度、使用人员的数量、以及培养细胞的类型等，综合各方面情况列出合理的方案。箱体的定期清洁培养箱内外部的定期清洁频率取决于培养细胞的类型和实验室环境。外部清洁必须定期去除灰尘及长期附着在表面的污染物，这些污染物在开门时很可能随空气流动潜入箱体内。培养量大的实验室建议每周清洁一次，培养量小的实验室建议每月清洁一次。使用较温和的家用清洁剂或蒸馏水清洁即可。不锈钢内胆建议每月清洁一到两次，圆角的设计可以减少污染物的产生，可使用70%异丙醇、酒精或其它无腐蚀性的消毒剂擦拭，切记不可使用卤素类消毒剂（次氯酸、漂白-粉）。门口垫圈处很易滋生污染物，需注意加强清洁，或拆下进行高温灭菌。水盘的清洁水盘的清洁和换水是培养箱日常维护很重要的项目，至少一周需清洁一次，频繁加水以保障饱和湿度。水盘加水使用蒸馏水或去离子水，可以加少剂量的硫酸铜溶液抑制污染物。防止干燥如果培养环境湿度不足，培养基中的水分会蒸发造成环境干燥影响细胞生长。至少每周加一次水对保持培养箱湿度非常重要。污染风险降到最低细菌、霉菌、病毒或支原体污染是细胞生长最大的威胁。现代的培养箱的设计和特点可以适当减少污染发生。HEPA过滤器闭环HEPA过滤器是减少污染发生的一个重要设计。HEPA过滤器持续提供箱内洁净的空气。但为保证HEPA过滤的有效性，HEPA需要定期更换，每周或每两周应定期检查过滤器。进气过滤器（图F）的寿命一般在3-6个月。NuAire建议供气过滤器每使用5瓶气或已变黄时更换一次，大的囊性过滤器（图H）每两年需更换一次。配备HEPA过滤器的培养箱类似一个微型洁净间，箱内持续过滤的空气使箱体空气洁净度达到百级。每一次开箱门都可能造成污染物的侵袭，NuAire培养箱每20分钟换气一次，使污染物快速被过滤，箱体内空气洁净度达ISO 5级。循环灭菌一些实验室潜在病原微生物如HIV病毒，需要145℃干热循环灭菌才能有效灭杀。145℃灭菌程序需要持续8-14小时，可选择在夜间运行。NuAire培养箱特有的层架和内部五金件耐受145℃灭菌，无需灭菌前取出，节约了灭菌时间。145℃灭菌需要按照实验室SOP根据实际需要运行，并且不能代替日常的清洁保养。3、放置适当位置培养箱需要放置在实验室内合适的位置：需远离走廊，环境温度需稳定，远离水源，远离通气设备以免空气污染，远离窗口避免阳光直射，远离其它热源如高压蒸汽灭菌器，以及离电源近的位置。

培养基制备规程1.目的规范本中心微生物实验室培养基制备工作，保证培养基的质量。2.适用范围本规程适用于使用商品化干粉培养基制备各种待用培养基。3.职责3.1培养基制备人员负责按本规程制备各类培养基，及时填写成品培养基制备记录，编制培养基目录，粘贴标签。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员按规程制备培养基。4.制备程序4.1概述4.1.1制备培养基所用的化学药品，均为化学纯。有些试剂在使用前应先试用。4.1.2使用脱水培养基和其他含有有害物质（如胆盐或其他选择剂）的成分时，应遵循良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。4.1.3使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制。如质量/体积、PH、制备条件、灭菌条件和操作步骤等。4.1.4使用各别成分制备培养基时，应按配方准确配制，并记录所使用成分的特性。4.1.5制备培养基常用的容器为玻璃、不锈钢铝、锅或搪瓷容器。不宜使用铜或铁锅。培养基中的含铜量过高时（＞0.3mg/1000ml），细菌不易生长；含铁量过高时（＞0.14mg/1000ml），则妨碍细菌毒素的产生。4.2水4.2.1制备培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，以排除测试条件下抑制或影响微生物生长的物质。电阻率在25℃时应≥300000Ω·cm。最-好每周检测一次。4.2.2制备培养基时避免采用离子交换器生产的去离子水，其微生物含量可能较高，这种水在过滤灭菌后仍可能带有细菌生长的抑制因子。4.3称量和复水4.3.1称量所需量的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。4.3.2 必须选择合适的天平和量筒，以确保称量和移液的准确性。4.4溶解和分装脱水培养基加水后应适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟。用各别成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。4.5  测定和调整PH4.5.1用PH计或精密PH纸测pH，必要时进行调整。4.5.2在实验室用各别成分制备的培养基，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，PH的变化不应超过0.2个单位。4.5.3一般使用浓度约为40g/L(约1mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L(约1mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。4.6分装将配制好的培养基根据使用要求分装到适当的容器中，并及时密封好。4.7灭菌4.7.1分装好的培养基应当天进行灭菌处理（2小时内灭菌最-佳）。4.7.2实验室采用湿热灭菌对培养基进行灭菌处理，按照培养基使用说明采用合适的灭菌温度和时间。4.8保存制就的培养基不宜保存过长，以少量勤做为宜。培养基存放于暗处和（或）4℃～12℃冰箱的密封袋或平皿筒中可延长贮存期限。4.9制备记录培养基制备完毕后，应及时填写“成品培养基制备记录”和“成品培养基目录清单”，并在外包装上贴好相应的标签，标明名称，编号，制备日期和有效期等内容。培养基使用规程1. 目的规范本中心微生物实验室培养基的使用和管理。2. 适用范围本规程适用于培养基的储存、融化和废弃等。3. 职责3.1 检验人员：按照本规程规范使用培养基、定期检查培养基是否失效。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员规范使用培养基。4.使用程序4.1培养基的储存4.1.1除特殊说明和标准规定，通常情况下基础培养基（如营养琼脂培养基）应在4℃冰箱中保存不超过3个月，或在室温（20℃）下保存不超过一个月。4.1.2灭菌后的培养基应置适当条件下保存至规定的有效期，并对保存条件进行确证。4.2琼脂培养基的融化4.2.1将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽，如100℃）使之融化。经过高压的培养基应尽量减少重加热时间，避免过度加热。4.2.2培养基融化后放入47℃±2℃的恒温水浴锅或恒温培养箱中保温，直至使用。4.2.3融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h，不可二次融化。4.3培养基的脱气必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧，并迅速冷却至使用温度。4.4添加成分的加入对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃±2℃时再加入。灭菌的添加成分在加入之前，应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。将加入添加成分的培养基缓慢充分混匀，尽快分装到待用的容器中。4.5平板的制备和储存4.5.1倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（直径90mm的平皿通常要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。4.5.2为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。4.5.3凝固后的培养基应立即使用或放于暗处和（或）4℃～12℃冰箱中，储存期限见“4.1培养基的储存”。 并在外包装上贴好相应的标签，标明名称，编号，制备日期和有效期等内容。4.5.4对于采用表面接种形式培养的固体培养基。应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱/培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。4.6培养4.6.1培养时每垛最多堆放六个平板，平板间要留有空隙以保证空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致。4.6.2在培养过程中，培养基会损失水分。当水分损失的量大于培养基总量的15%时，就会影响微生物的生长。造成培养基水分损失的因素较多，如培养基成分，平皿中培养基总量和培养箱的类型等（如使用带风扇的培养箱，培养箱中的湿度偏低，平板在培养箱中位置靠近培养箱内壁等），操作时应注意避免。4.7培养基的弃置培养基废弃前，实验室采用121℃、15分钟蒸汽灭菌，或煮沸消毒30分钟。

试剂耗材作为高校/实验室的常用物资之一，也是试验人员必不可少的物品。但是试剂耗材不管是在申购、购买还是在使用上都会有一系列的问题摆在试剂耗材管理人员及使用人员面前，具体是哪些问题呢，下面我来给大家简单来说下。对于试剂耗材的购买，因为它们信息的不对称，再加上试剂耗材供应商雇佣了推-销人员进行销售，经过一层层的加价后造成价格虚高。导致同一高校/实验室、同一层楼隔壁的两个实验室购买同一种试剂的价格都相差巨大。并且大多数科研/试验人员无法鉴别供应商的资质，导致收到了“假货”、“水货”，以至于到最后辛苦做了大半年的实验，却因买到的是假试剂导致实验结果完全无效。试剂耗材造假严重影响科研和试验结果，让科研工作者花费大量时间、金钱、精力做的研究没有成效的事并不鲜见。有的造假手段隐蔽性很强，这种ELISA试剂盒，也会用某种指标的产品冒充其他指标试剂盒。但比之前VEGF一种产品包打天下的做法“高明”之处在于，用于替换的指标更加多样化和隐蔽，让人防不胜防。那么该怎样找到正品试剂耗材，少吃亏上当呢？下面列举了几个方法：一、找对耗材试剂供应商购买试剂耗材，肯定要从源头上避免买到假的试剂耗材。那么，如何选择对的试剂耗材供应商非常重要。选择供应商可以从两点出发，1 是选择两家以上的大品牌、口碑信誉好的供应商；2建立健全的供应管理体制。对试剂耗材供应商建立考核标准，登记好每次供应试剂耗材的质量情况，如有违规要有惩罚机制，比如在一个供应周期内禁止其参与招标和供应等。选择两家以上的供应商，可以用来对比双方的质量以及价格，以便于给高校/实验室相关人员提供更好更多的选择。二、学会简单的辨识技巧试剂耗材的辨识技巧有多种，下面只是简单的列举2个：1、看包装我们在拿到试剂耗材时，都应该最-先确认封条未被撕开或没有其它任何动过的痕迹。检查是否有动过的封条时，注意封条图案、图形的线条是否连接正确。如果图案、图形的线条不匹配，则包装已被动过。2、看变色/涂层防伪标最直观的辨别试剂耗材的方法，就是变换观察角度，可看到变色防伪标呈现以下两种颜色。首先，刮开包装上的“涂层防伪标”，得到防伪码，然后登陆相应官-网查询即可。现在国内市场上的假-冒试剂产业还是比较猖獗的，虽然目前还是没办法彻底制裁这些假-冒试剂制造者，但是我们可以各种方法去辨别和采用合理方法来规避买到假-冒/伪劣试剂。购买试剂耗材只是耗材管理中的其中一项，如何做好试剂耗材管理光靠人工肯定管理不好，必须结合专业的试剂耗材管理系统才能事半功倍。

（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。（二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。（三）实验器材1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜（四）实验方法：1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。（五）实验作业给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。（六）注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

对实验室管理人员来说，选择科学、有效的样品标识表示形式可以提升样品管理水平，提高检测工作效率，确保样品管理的可靠性和准确性。实现高效、便捷的样品管理，建立科学的样品标识系统是核心和关键，它为每个样品赋予识别和记录的唯1标记，也就是样品的身-份证明。有了科学的标识管理，再也不用为弄混样品而烦恼了。01、样品标识的重要性样品的代表性、有效性和完整性将直接影响检测结果的准确度，因此必须对样品的取样、贮存、识别以及样品的处置等各个环节实施有效的控制，确保检验结果准确、可靠。并做好样品的保密与安全工作。标识是信息传递的一种重要的手段，例如：对于有追溯性要求的要素，须有唯1性的标识以便于追溯；对受控对象加以标识可使受控的状态明确；为使环境物品整洁有序，提高工作效率，减少差错，可进行定置标识；危险标识、操作禁示等使员工能正规操作，避免危险等。规范、科学的标识是质量体系安全、高效、经济运转的前提条件。02、标识的功能标识是以文字、数字、符号、图案及颜色等形式体现的，能够清楚鲜明地表明对象或过程的质量、数量、特性、要求和状态等的一种信息载体，标识常用的方法有记录、卡、标签、标牌、图标、印章等。标识具有识别、定位、导向、提示、警示、说明的功能，它的特点是及时、简明、直观、易于目视。03、标识管理的优点1、标识管理是以人为本的管理方法，可使工作人员在短时间内知道程序的要求。2、标识形象直观，容易认读和识别，简化管理，使工作有序，减少差错，有利于降低管理成本，提高工作效率。3、标识可作为证据或依据，标识管理是源头管理，完整规范的标识是实现追溯的手段。4、标识管理透明度高，为目视管理、自主管理创造了条件，便于现场人员默契配合、互相监督，发挥激励作用。5、标识具有安全保障作用。04、样品的标识1 样品的识别包括不同样品的区分识别和样品不同检测状态的识别。2 样品区分识别号可贴在样品上或贴（写）在样品包装物上。识别号由收样部门统一编排。3 样品所处的检测状态，用“待检”、“在检” “检毕” 和“留样”标签加以识别。4 样品在不同的检测状态，或样品的接收、制备、流转、贮存和处置等阶段，应根据样品的不同特点和不同要求，如样品的物理状态、样品的备样要求（如分样或混样）、复检样要求、样品形状的大小、样品制备、加工及分解要求、样品的包装状态和其他有特殊要求的样品，根据检测活动的具体情况，做好样品标识的转移工作，以保持清晰的样品识别号，保证各检测室内样品编号方式的唯1性和必要时的可追溯性。根据要求，实验室应具有检测和/校准物品的标识系统。实验室通常都会设计样品标签来标识样品，有条件的实验室甚至采用条形码的方法来标识。不过在使用标签或条形码标识样品时会遇到如下的问题：1、使用标签或条形码标识系统不仅仅是给样品分配一个唯1性编号，样品有了唯1性编号可以避免在文件中出现混淆，但为避免实物出现混淆，还需要清楚地标识出样品的目前状态，比如：待检、检测中、检测完成等，对于要顺序开展多个试验的样品，甚至还需要清晰地标识哪些试验项目已经完成等信息。2、如果试验样品体积较小或试验环境十分恶劣，会导致样品标签或条形码无法粘贴到样品上或在试验过程中发生标签脱落丢失的情况，但这些样品无法有效地标识会导致产生混淆。针对如上的两个问题，推荐的解决方法如下：1、如果实验室的样品体积足够大，建议设计能够容纳较多信息的样品标签，标签上除了标注样品的编号和基本信息外，还可以留出空间让实验室检测操作人员能够在检测过程中实时地标注样品的状态，比如标注哪些检测项目已经完成。如果无法做到上述要求，建议建立每个样品的检测历史记录表，通过记录表的内容可以清楚地了解样品的状态，也就是将标签和记录表结合在一起做为样品的标识系统。2、如果样品体积太小或试验环境恶劣，无法有效进行标识时，建议建立样品分配表和样品的检测历史记录表来做为样品的标识系统，样品分配表是为了将样品的编号与样品对应而建立的记录表格，通常即使体积再小的样品在其生产时也会有相应的且唯1产品编号，将该产品编号与试验过程中的编号对应起来而建立的表格就是样品分配表，如果样品没有产品编号又体积特别小，那么可以有实验室人员在可能的空间上对样品进行灵活的唯1性标识，然后同样地将该标识和实验室检测过程的编号相对应建立分配表，同时结合上述介绍的样品的检测历史记录表来建立样品的标识系统，从而避免实物的混淆。提醒：为了使样品在接收、处理、保管、检测等各环节汇总，保持其完整性，防止不同样品和不同检测状态样品不发生混淆的现象，并保护实验室利益，检测实验室需加强对样品标识的管理。

色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。01柱色谱为向玻璃管中填入固定相，以流动相溶剂浸润后在上方倒入待分离的溶液，再滴加流动相，因为待分离物质对固定相的吸附力不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而实现分离。02纸色谱以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分离的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流动相溶剂中悬挂，溶剂因为毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分离。03薄层色谱是在玻璃板上涂以固定相涂层，然后点样，下端浸入溶剂，同样自下而上分离。常用于探索柱色谱实验条件，溶剂和固定相的选择等。常用固定相有石膏、氧化铝、蔗糖、淀粉等，常用流动相为水、苯等各种有机溶剂。影响色谱柱使用寿命的主要因素流动相因素1.流动相pH不同基质的填料具有不同的pH适用范围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100mg·L-1，且在pH1～9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量，考虑到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动相pH范围约为1～8。键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用,使填料对流动相的适应范围大大增加，如现在广泛使用的反相色谱填料C18(十八烷基硅烷键合硅胶)，其pH适用范围可达2～10。当流动相pH值超出酸性范围时，键合相易发生水解而流失；当流动相pH超出碱性范围时，会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子，这两种反应均是不可逆反应，特别是在温度较高（>40℃）的环境下，会使柱效迅速降低而报废。2.流动相变质当前使用最为广泛的是硅基键合相填料，当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸盐缓冲液时，水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或霉菌，从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动比例混合的高效液相色谱仪来说,水相或缓冲盐相独立存贮，因存放时间较长而容易发生此类问题。3.流动相纯度目前，广泛使用的填料颗粒粒径范围在3～10μm,孔径在6～10nm,色谱柱在使用中会有大量的流动相通过,如流动相含有微量不溶性杂质颗粒,则很容易在柱头部位被截留,久而久之,造成色谱柱机械性堵塞,引起柱压升高而无法正常使用。4.其它因素如，流动相的极性对柱子也有一定影响，甲醇、水、冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱，正丁醇、二氯甲烷等极性小的物质会破坏化学键合硅胶柱，碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱,酸性溶液容易损坏阴离子交换树脂柱。样品因素1.样品的溶解性样品试样在配制中，如有少量微粒未能完全溶解，则会随试样一起进入色谱柱，同样，会沉积在柱头处，造成色谱柱的堵塞。2.样品的纯度样品中可能含有待分析组分以外的各种组分或杂质，这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸附，从而，使固定相的活性点被覆盖，保留特性发生变化。3.样品的化学性质待测试样中的各种组分与填料之间应具有化学稳定性，比较典型的是在使用氨基键合柱时，应避免使用含羰基的化合物和流动相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮发发希夫(Schiff)缩合而使固定相破坏。其它因素影响色谱柱寿命的因素很多，除流动相和样品因素外，还有其它一些外在因素，如，柱压的影响，温度的影响，色谱柱的正确冲洗，色谱柱的正确安装等。色谱柱出现问题的解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：1.色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染。解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。2.色谱柱头的填料被样品污染。解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。3.色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出。解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。4.流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因pH值使用不当，很难恢复。

一、基本原理　　芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。二、器材　　枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；　　孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液等。三、操作步骤方法1、（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。方法2、（1）取二支洁净的小试管，分别加入0．2ml无菌水，再往一管中加入1—2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1—2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。（2）在菌悬液中分别加入0．2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3—5分钟。（3）用接种环分别取上述混合液2—3环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出。（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。（5）取1—2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。四、实验报告  

灵长类动物主要有四种免疫球蛋白，即IgG、IgM、IgA、和IgE。 所有用于检测抗原的免疫学方法经适当改良后，均可用于抗体的检测，如IFA、ELISA、RIA、LA......由于抗原方法的敏感性提高和PCR技术的应用，使得HSV抗体在HSV感染个体中的不均一性和不稳定性影响了这类指标在临床诊断中的意义，但作为一种感染有关指标，在一定的范围和情况下，仍有必要进行检测和深入研究.目前HSV特异性抗体的检测，主要有IgG、IgM和IgA三种. 1.IgG抗体:HSV-IgG主要用于HSE诊断中，单份血清中IgG抗体水平表示自然免疫状况，在我国HSV-IgG阳性率达90%以上，只有在特定部位如CSF中>1∶80、或神经鞘内HSV-IgG阳性才有提示感染的意义;双份血清中IgG抗体滴度有4倍以上升提高者、或血/CSF值在20～40∶1，才能诊断HSV近期感染;有些研究者对抗体HSV结构蛋白的特异性抗体进行了探计，结论不一，还有待进一步研究.IgG抗体在ELISA检测时可以跟IgM同步出现或稍后几天. 2.IgM抗体:HSV-IgM作为HSV感染指标，特别是脑部感染具有一定的临床积极意义.HSV-IgM出现在临床症状发作后第3天直到4周，初次感染者100%阳性、再次感染者48%阳性，虽然IgM抗体常作为许多传染病的早期诊断指标、但在HSV感染中，由于HSV反复感染均可引起IgM出现，影响了作为初次早期诊断的意义.HSV-IgM在CSF中的检测结果仍有争议，有的结果发现成人HSE的CSF中IgM滴度比血清中更高;有的则只有新生儿脑炎CSF中发现IgM抗体存在，成人脑炎CSF中未发现;但有的在HSE和急性硬化性全脑炎的CSF中未发现IgM抗体.一般认为IgM抗体不能通过血脑屏障，在CSF中检测HSV-IgM对HSE具有诊断价值. 3.IgA抗体:HSV-IgA是一种与局部免疫有关的抗体.SIgA可在HSK初次症状出现后第3～5天的泪液中达到高峰;在女性生殖道疱疹病毒感染的血清中，初次感染者以11SHSV-IgA为主，再次感染则以7S为主.单纯以ELISA检测血清中HSV-IgA出现，在初次感染者中阳性率为72.4%，再次感染阳性率为81%，所以从血清中检测HSV-IgA来确诊HSV初次感染是不可能的，但检测分泌物中SIgA作为局部感染的间接诊断指标和免疫指标仍有待进一步研究

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　　1.  为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？　　答：可以从这几个方面一一考虑：　　（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。　　（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。　　（3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。　　（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。　　（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。　　（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。　　2.  为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？　　答：可以从这几个方面考虑：　　（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。　　（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。　　（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。　　（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。　　（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。　　（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。　　（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。　　（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。　　（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。　　3.  为什么融合后得不到阳性克隆？　　答：可能的原因：　　（1）动物未免疫成功就进行了融合。具体解决方法参照本页面第1个问题。　　（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。具体解决方法，请参照本页面第2个问题。　　（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待商榷。　　（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简单的例子，如果需要制备抗BSA 的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。　　（5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA实验的讲解与讨论。　　4.  为什么我的细胞生长很慢？　　答：可能的原因：　　（1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。　　（2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。　　（3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面第二个问题。　　（4）其它问题，可以参考本页面第二个问题。　　5.  我的克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？　　答：首先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性的办法。一般可以从这几个方面加以注意：　　（1）永远保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了，除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。　　（2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。　　（3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。　　（4）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。　　（5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。　　6.  为什么我做亚克隆后长不出克隆来？　　答：亚克隆失败的原因和克隆不长的原因类似，但是除此之外，也还有一些独特的原因。　　（1）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。　　（2)亚克隆时，没有按照正确的数量取出细胞，在本站有关亚克隆操作的页面上提到过，亚克隆的过程服从泊松分布，如果取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能出现长不出克隆的结果。　　（3）未添加饲养层细胞。单个细胞在完全培养基中极难培养，如果不添加饲养层细胞，则它们很可能很快就死亡，最终就长不出克隆。　　（4）使用的HAT中HT失效或A的浓度过高，或者未添加HT。 虽然HT对杂交瘤的生长并不是必须的，但是HT确实可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。　　（5）使用无血清培养基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培养基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的实验的时候，可能会选用无血清培养基来培养杂交瘤，但是需要注意的是，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。最好的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出后再把培养基彻底更换为无血清培养基。　　7.  为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？　　答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。 对于冻存过程，需要注意：　　（1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目前认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培养基，不管是哪一种，冻存保护剂DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞最终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。如果使用第二个配方，注意一定要用养过杂交瘤的培养基，而尽量不要用一般的完全培养基，而且一定是配养需要冻存的那一株的培养基。文献中也有提到用甘油作为冻存保护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。如果新手确实对这个没把握，市场上也有商品化的冻存液，买回来按照说明书操作就OK了。　　（2）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在DMSO存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。　　（3）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1 ℃的速度下降冻存细胞是最理想的。如果条件简易，可以把细胞放在4 ℃半小时左右，然后再在-20 ℃放置1-2小时，最后转入-80 ℃放置过夜，最终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。现在市场上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80 ℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。　　（4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很容易进入冻存管。这一点很多人都没有注意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，最终可能造成细胞污染。　　（5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。　　对于复苏过程，需要注意：　　（1）快速。为了防止升温中细胞内产生冰晶，强烈建议加快融化过程。一般都要用用足够体积的37 ℃热水复苏，并不断晃动冻存管。　　（2）复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。　　（3）有的人复苏细胞时，没有去掉冻存液，这样就把冻存液里的DMSO带到了新的培养体系里，容易对细胞造成毒害，因此强烈建议将融化的细胞离心后去掉冻存液，然后用新的完全培养基重悬，再接种到新的容器内培养。　　8.  为什么我的细胞总是污染？如何可以救活污染的细胞？　　答：养细胞出现污染，几乎是每个细胞培养技术员容易出现的问题。要防止细胞污染，无非就是保证培养环境无污染，保证所用的所有试剂都无污染源，同时提高操作时的警惕性，这些基本的知识这里就不再废话了。下面讲一讲如何挽救一株已经被污染的细胞株。　　（1）体外用抗生素消灭。一般来说，一旦发现细胞被微生物污染，应该马上进行处理，也许还有一线挽救的机会。 但是这种挽救不是盲目的，首先应该决断是哪一类生物造成的污染。细胞的污染大致可以分三类：细菌污染、真菌污染和支原体污染。 在显微镜下仔细观察，这三种微生物污染区别还是比较明显的：如果有大量运动的微生物，且形态较大，轮廓清晰可见，呈较大幅度运动，并且培养基在短时间内变酸，则很可能是细菌污染；如果在显微镜下观察有典型的斑状或丝状微生物（注意与塑料屑、棉花屑和琉璃纤维区别开），基本上看不到明显的运动，则很可能是真菌污染；如果看不到明显的微生物，并且培养基没有明显的颜色上的变化，而细胞状态很差，细胞边缘极其不光滑，而且细胞又莫名其妙地死亡或生长极其缓慢，则有可能为支原体污染，但不能下明确的结论，如果非常需要知道是否为支原体污染可以使用相关的试剂盒进行检测。 对于细菌或真菌的污染，可以先把细胞收集起来，用干净的培养基洗涤离心，交替进行几次，再把洗干净的细胞放在新的培养板或培养瓶等容器内，加高浓度的抗生素培养，同时强烈建议加入小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层，以辅助消除微生物。对于细菌污染，可以把青霉素的浓度提高至10倍左右，链霉素浓度提高至5-10 倍，也可以用10倍浓度的卡那霉素替代链霉素。 对于真菌污染，可以在培养基中加入约5 ug/ml的咪康唑（注射用达克宁）抑制。 对于这两种情况的污染，采用上述方法处理后，待细胞稍有好转，并且没有发现更大规模的污染时，需要尽快重复上面的处理步骤。需要注意的是，此时细胞生长受抗生素的影响比较大故而生长很慢。如果多次传代均未发现污染复发，可以慢慢降低抗生素浓度直至常规浓度，确定是否完全根除污染。最好进行一次有限稀释的亚克隆操作，以获得更加纯净的细胞株。 而对于支原体污染，则比较麻烦，一般的抗生素是很难解决的，对于轻度的污染，可以试试使用60 ug/ml的泰乐菌素和10 ug/ml左右的环丙沙星交替处理。如果得到明显的缓解，建议马上做亚克隆操作，看看是否得到污染根除的细胞株，如果此方法无效，则不能单纯利用抗生素来解决污染问题。　　（2）体内法。这个办法很简单，原理就是动物体有强大的免疫系统，一般的微生物都可以被动物体消灭。具体操作和制备腹水的方法完全一样，即先用IFA或石蜡制敏小鼠，数天后腹腔注射污染的杂交瘤。如果情况紧急，致敏当天注射杂交瘤也行。一般十天后小鼠产生腹水，在超净台无菌采出腹水，其中即含有大量的杂交瘤细胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射杂交瘤，十几天后可以看到实体瘤形成，也可以在超净台上无菌采摘，然后放回培养板或培养瓶等容器内培养。如果被污染的细胞很少，比如说在96孔板上就被污染了，这时候不能进行腹腔注射，也不要进行皮下注射，否则细胞很容易被老鼠的免疫系统攻击而死亡的，最好的办法是采用脾内注射的方法进行，同时在腹腔内用IFA或石蜡油致敏，十几天后，同样可以形成腹水，其中即含有干净的杂交瘤细胞。 如果担心小鼠会受到微生物感染，可以在培养基中先加入高浓度的抗生素，然后连同抗生素一起注射到小鼠体内。　　如果确定细胞污染极其严重，并且细胞已大面积死亡，建议放弃，迅速做好环境清洁工作，对细胞操作间作彻底消毒，重新做融合而获得新的细胞株，不可因小失大造成其它的细胞也被污染。　　9.  为什么我的杂交瘤细胞不能制备腹水或者制备的腹水中没的抗体或腹水没有效价？　　答： 不能制备腹水的原因大部份是人为的原因：　　（1）致敏不正确，例如使用了不正确的致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久。　　（2）杂交瘤的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。　　（3）接种的杂交瘤细胞数量太少或者细胞状态不好。一般不应少于10万个细胞，建议在100万个细胞左右为宜。　　（4）制备腹水小鼠的种系与参与融合的细胞来源的动物种系相差太远，以至制备腹水的小鼠对杂交瘤有强大的免疫反应将其杀死，建议更换小鼠品系重新接种。　　对于腹水没有效价，可能的原因：　　（1）制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。　　（2）致敏小鼠时采用了错误的致敏剂，如使用了弗氏完全佐剂，这时即使不打杂交瘤，小鼠也会产生腹水。　　（3)极其罕见的情况，就是此杂交瘤生产的抗体可以与小鼠体内的分子相互作用，于是杂交瘤产生的抗体被小鼠的相关蛋白中和，这种情况下，小鼠的身体可能会出现明显的异常。　　（4）检测腹水效价的实验方案有问题，或者腹水稀释比过大。　　10.  免疫失败的可能原因及应采取的措施　　答：有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。　　（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。　　（2） 抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。　　（3） 制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。　　（4） 所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。　　（5） 免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。　　（6） 动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。　　11.  制备单克隆抗体影响因素、失败原因分析　　答：由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。 其主要失败原因和影响因素有：　　（1）污染： 包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。　　（2）融合后杂交瘤不生长， 在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：　　PEG有毒性或作用时间过长。　　牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。　　骨髓瘤细胞污染了支原体。　　HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。　　（3）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体： 融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而 抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。　　三要：　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。　　要定期进行再克隆。　　三不要：　　不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。　　（4）杂交瘤细胞难以克隆化　　可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

　　当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。　　对照/标本无染色　　①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。　　②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。　　③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。　　④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。　　⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。　　⑥检查标本的储存条件，最-好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。　　⑦检查色原/底物溶液，最-简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。　　⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。　　⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。　　弱阳性　　如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：　　①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。　　②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。　　③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最-佳的使用浓度。　　④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。　　⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。　　如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。　　非特异性染色　　①是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：　　灭活碱性磷酸酶：最-常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。　　饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。　　②是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。　　③所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。　　④一抗的使用浓度是否过高。　　⑤清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。　　⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。　　⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。　　⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

　　核酸检测存在一定的局限性　　核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，是临床诊断的“金标准”。目前使用最广泛的是实时荧光定量RT-PCR技术，通过采集检测患者鼻咽拭子、痰、粪便等标本是否有病毒核酸。但受采样、不同类型的标本以及不同厂家试剂等因素影响可能造成核酸检测结果“假阴性”，容易出现漏诊的情况。　　如何为确诊增加“砝码”呢？答案是通过增加血清抗体检测（简称抗体检测），来提高检测的准确性。　　其实，早在3月初，国家公布的《新型冠-状病-毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》中，新增加了血清学检测，并且指出：如果血清特异性IgM抗体和IgG抗体阳性或者特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期升高4倍及以上者，可以判断为新冠肺炎的确诊病-例。　　既然如此，只做抗体检测不就可以了么？并不是！　　抗体检测不能代替核酸检测　　首先我们来看看抗体是什么。抗体，又称免疫球蛋白（Ig），是人体免疫系统对外来物质（我们称之为抗原）的反应而产生的一种保护性蛋白质。抗体是淋巴细胞产生的，具有识别抗原并将其从体内清除的作用。　　抗体按其恒定区域分为五类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。　　今天唱主角的是IgG和IgM。　　IgM是人体产生的第1种抗体，主要存在于淋巴液和血液中。IgG是在人体中最丰富的抗体，存在于所有体液中，保护人体免受细菌和病毒的攻击。IgM抗体通常在人体接触疾病后发现，而IgG是人体对疾病的长期反应，也就是说IgM是反映当前感染的指标，IgG表示最近或过去接触过该疾病。　　抗体检测稳定性较高，对于采集样品，样品运输，储存方式的要求较核酸测试要低，并且在血液中分布较均匀。因此，对核酸检测阴性但怀疑是新冠肺炎感染患者时，将IgM和IgG抗体检测增加进去，可以弥补核酸检测容易造成漏诊的缺点。但是，抗原进入机体需经过一定的潜伏期才会产生IgM与IgG。在这一期间，无法检出IgM与IgG，这时就体现了核酸检测的优势，它能检测处于窗口期的患者是否受到感染，及早发现感染者。　　核酸检测及抗体检测结果这样解读　　如果患者核酸检测阳性，并且有新冠肺炎的临床表现，可判定为确诊病-例。但是如果在核酸阴性情况下，进行抗体检测，则分为下面几种情况：　　01、lgM阳性，无论lgG是何种情况，假阴性的可能性非常大，则需要再次进行核酸检测来确定。　　02、lgM阴性，lgG阳性：表示曾经感染过病毒，但已经恢复或者体内病毒被清除。　　但是需要注意的是，不同时期检测对结果判定意义不同。　　感染前期（感染0～8天），患者已经具有传染性，因为人体产生IgM抗体需要一个过程，此时只能依靠核酸检测，抗体检测基本无效。感染中期（感染8～12天），此时核酸检测呈阳性，人体也产生了lgM抗体（阳性），但是暂时没有lgG抗体。到感染后期（感染8～20天），人体才会产生lgG抗体，这时候三项指标都是阳性。在感染恢复期（20～28天），核酸检测呈阳性，lgM抗体消失（阴性），lgG抗体依然存在，抗体检测呈阳性。患者完全恢复之后（感染28天之后），核酸检测呈阴性，但lgG依旧存在（阳性）。　　温馨提示　　不管核酸检测还是抗体检测，在传染病的诊断上都发挥着十分重要的作用。核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等优点，是临床诊断的“金标准”，但其产生的“假阴性”值得注意。抗体检测具有采样方便、操作简单、结果易判读等优点，但存在无法早期诊断的不足。抗体检测可以作为核酸检测的重要补充，采取联合采用核酸检测+抗体检测的手段，有助于提高病毒检出率。

实验室的废弃物种类繁多，实验过程中产生的有毒气体和废水排放到空气中或下水道，同样对环境造成污染，威胁人们的健康；废弃物如直接丢弃，可能导致土地荒废，污染环境。因此如何处置实验过程中产生的有毒有害物质，对于环境保护和人身安全显得十分必要，今天就来介绍一下实验室废弃物的处置方式。实验室的废弃物，按照废弃物形态可以分为废液、固体废物、废气三类！废液的处理要求实验室产生的废液主要有两种，一是化学性实验废液，主要包括多余的样品、标准曲线、样品分析残液、失效的贮藏液和洗液、大量洗涤水，如各种酸碱废液、含氟废液、重金属废液等。二是一般废水，主要包括仪器清洗用水、实验室的清扫用水以及大量使用的洗涤用水等等。如果不能对这些废液进行妥善的处理，其将对周围的环境产生极大的不良的影响，甚至会危及到其他生物和人的生命。对于实验室废液收集和管理，根据不同废弃液的化学特性，实验室可以将废弃液进行分类再贮存到统一规定的密闭容器中，与此同时还要对废弃液的种类、贮存的时间进行标明。待废液打到一定量后，依据废弃液的性质和其组成成分，考虑采用合适方法进行处理回收；另一方面，如果实验室本身没有能力处理，则要将废弃液定期收集起来，并联系具有此种能力和处理资格的单位对其进行统一的处理。各类废液的处理方法1. 无机酸类：将废酸慢慢倒入过量的含碳酸钠或氢氧化钙的水溶液中或用废碱互相中和，中和后用大量水冲洗。 2. 氢氧化钠、氨水：用6mol/L盐酸水溶液中和，用大量水冲洗。 3. 含氰废液：加入氢氧化钠使pH值在10以上，加入过量的高锰酸钾(3%)溶液，使CN-氧化分解，可加入过量的次氯酸钠和氢氧化钠溶液，静置2天，经检测安全后，可倒入常规废液桶。4. 普通简单的废液: 如石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等可直接倒入废液桶中，废液桶尽量不要密封，不能装太满（3/4即可）5. 有特殊刺激性气味的液体倒入专门的废液桶内立即封盖，统一处理。在实验室规范穿戴专业防护用品：呼吸防护、身体防护、面部防护：固体废弃物的处理要求实验室所产生的固体废物包括残留的固体试剂、多余固体试剂、沉淀絮凝反应所产生的沉淀残渣、消耗和破损的实验用品(如，玻璃器皿、包装材料等)、残留的或失效的固体化学试剂。另外，还会有纸张等的办公耗材和实验室的常用滤纸等。这些固体的废弃物有复杂的组成，对环境的危害较大，尤其是一些过期失效化学药剂。若将这些固体废弃物随意排放，一旦混入居民环境，会对居民的生活环境和生命健康造成巨大威胁。不同固体废物的处理方法1. 沾附有有害物质的滤纸、包药纸、棉纸、废活性炭及塑料容器等东西， 不要丢入垃圾箱内，要分类收集。 2. 废弃不用的药品可交还仓库保存或用合适的方法处理掉。 3. 废弃玻璃物品单独放入纸箱内；废弃注射器针头统一放入专用容器内， 注射管放入垃圾箱内。 4. 干燥剂和硅胶可用垃圾袋装好后放入带盖的垃圾桶内。5. 其他危险废弃药品需进行预先处理，倒入废液桶内，由专业公司回收处理。（剧毒，易爆危险品要先预处理）6. 废弃的金属催化剂，需统一放置在固定位置，由专业人员回收处理。废液的处理要求实验室在实验过程中会产生的废气主要来源于实验过程中化学试剂的挥发、分解、泄露等，而且其成分大多是易燃和有毒气体，具体包括挥发性的试剂和样品的挥发物、实验分析过程的中间产物、泄漏或排空的标准气等。由于每次实验所产生的气体量不大，因此始终未能引起公众足够的重视，通常这些气体不经吸收和处理就被直接排入到空气中，形成较大的社会公害。产生少量有毒气体的实验应在通风橱内进行，通过排风排到室外(使排出气在外面大量空气中稀释)，避免污染室内空气。通风橱排气口应以保证对外排气不影响附近居民身心健康为原则，排气口朝向应避开居民点并有一定高度，使之易于扩散。产生毒气量大的实验必须备有吸收或处理装置。如二氧化碳、氧化氮、二氧化硫、氯气、硫化氢、氟化氢等可用导管通入碱液中，使其大部分被吸收后再排出，一氧化碳可点燃转成二氧化碳，可燃性有机废液可于燃烧炉中通氧气完全燃烧。常用的吸收剂及处理方法◆ 氢氧化钠稀溶液：处理卤素、酸气（如HCl，SO2，H2S，HCN等等）、甲醛、酰氯等等。◆ 稀酸（H2SO4或HCl)：处理氨气、胺类等等。 ◆ 浓硫酸：吸收有机物。 ◆ 活性碳、分子筛等吸附剂：吸收气体、有机物气体。 ◆ 水：吸收水溶性气体，如氯化氢、氨气等。为避免回吸，处理时用防止回吸的仪器。◆ 氢气、一氧化碳、甲烷气：如果排出量大，应装上单向阀门，点火燃烧。但要注意，反应体系空气排净以后，再点火。最好，事先用氮气将空气赶走再反应。 ◆ 较重的不溶于水挥发物：导入水底，使下沉。吸收瓶吸入后再处理。

1. 缓冲作用与缓冲溶液　　纯水在25℃时pH值为7.0，但只要与空气接触一段时间，因为吸收二氧化碳而使pH值降到5.5左右。1滴浓盐酸(约12.4mol·L-1)加入1升纯水中，可使[H+]增加5000倍左右(由1.0×10-7增至5×10-4mol·L-1)，若将1滴氢氧化钠溶液(12.4mol·L-1)加到1升纯水中，pH变化也有3个单位。可见纯水的pH值因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸加入到1升HOAc-NaOAc混合溶液或NaH2PO4-Na2HPO4混合溶液中，[H+]的增加不到百分之一(从1.00×10-7增至1.01×10-7mol·L-1)，pH值没有明显变化。这种能对抗外来少量强酸\强碱或稍加稀释不引起溶液pH值发生明显变化的作用叫做缓冲作用；具有缓冲作用的溶液，叫做缓冲溶液。2. 缓冲溶液的组成　　缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸，能对抗外来强酸的称为共轭碱，这一对共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系，常见的缓冲对主要有三种类型。(1) 弱酸及其对应的盐　例如，HOAc-NaOAc(实际上是OAc-)；H2CO3-NaHCO3；H2C8H4O4-KHC8H4O4(邻苯二甲酸-邻苯二甲酸氢钾)；H3BO3-Na2B4O7(四硼酸钠水解后产生H2BO-3)。(2) 多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，例如，NaHCO3-Na2CO3；NaH2PO4-Na2HPO4；NaH2C5HO7(柠檬酸二氢钠)-Na2HC6H5O7；KHC8H4O4-K2C8H4O4。(3) 弱碱及其对应的盐例如NH3-NH+4CL-；RNH2-RNH+3A-(伯胺及其盐)；Tris-TrisH+A-(三羟甲基烷及其盐)。3. 缓冲容量与缓冲范围　　缓冲容量　　缓冲能力的强弱，可用缓冲容量β表示。缓冲容量也叫缓冲值或缓冲指数。    对任何一种缓冲溶液的每一个pH值，都有其相应的缓冲量。缓冲容量实际上是一个微分比，可定义为：使1升缓冲溶液的pH值增高很小一个数值dpH时，需加入的强碱物质的量为db，则db与dpH之比值叫缓冲容量，用数学式表示为β=db/dpH缓冲mol·L-1·pH-1。如总浓度(即共轭酸与共轭碱浓度之和)为0.100mol·L-1 pH4.45的HOAc-NaOAc缓冲溶液(即醋酸缓冲溶液)的缓冲容量为0.051(mol·L-1·pH-1)。

随着洋快餐的进入及人们对牛羊肉、乳制品的不断增加，反式脂肪酸越来越多的进入我们的饮食结构。据研究表面反式脂肪酸对人体有诸多伤害，本文从反式脂肪酸的来源、危害及检测方法进行综述。引言：  反式脂肪酸（TFA）是指在不饱和脂肪酸碳链上存在反式构型双键的脂肪酸，即一类含有一个或多个非共轭双键构型的不饱和脂肪酸。随着2006年“麦当劳反式脂肪酸”事件的发生，2010年氢化油事件表明人们对反式脂肪酸越来越关注。2016年10月，国家食品药品监督管理总局组织抽检婴幼儿配方乳粉227批次，不合格样品5批次。其中甘肃东方百佳商贸有限公司南苑店销售的标称合水县古象奶业有限责任公司生产的宝贝健较大婴儿配方乳粉2、宝贝健幼儿配方乳粉3和宝乐慧较大婴儿配方乳粉2等3个批次两个指标不合格：（1）反式脂肪酸与总脂肪酸比值检出值分别为3.58%、3.54%和3.50%，比食品安全国家标准规定（不超过3%）分别高出19.3%、18.0%和16.7% 。1、反式脂肪酸来源1.1 反刍动物(如牛、羊) 的脂肪和乳与乳制品  反刍动物体脂及乳制品中的TFA约占总脂肪酸含量的1%～8%，主要来源于饲料中不饱和脂肪酸在反刍动物肠腔中丁酸弧菌属菌群的酶促生物氢化。鸡和猪也通过饲料吸收反式脂肪酸，反式脂肪酸因此进入猪肉和家禽产品中。1.2 食用油的氢化产品  食用油脂选择性氢化是TFA的主要来源。人造奶油、起酥油、煎炸油等以氢化油为原料，其TFA含量较高。人造奶油中TFA含量随品种的不同而有所差别，一般在5%～30%；起酥油为20%～30%；深度煎炸油在30%以上，有的甚至高达50%。西式饮食摄入反式脂肪酸有80％～90％来源于氢化油，烹调油反式脂肪酸含量较高。糊状品、面圈、煎炸鸡、煎炸土豆、快餐模拟奶酪、日常用品和肉类品含35％～38％反式脂肪酸。此外，许多油脂为了延长货架期和增加热稳定性，采用全部或部分氢化油，也增加了反式脂肪酸含量。2、反式脂肪酸的危害  很多研究表明TFC摄入过多会对人体健康和婴儿发育产生不良影响。2.1 导致心血管疾病的形成且TFC也会增加血液粘稠度和凝聚力促进血栓的形成。2.2 提高低密度脂蛋白也就是“坏脂蛋白”，降低高密度脂蛋白也就是“好脂蛋白”促进动脉硬化。2.3 促进导致血糖不平衡，减少红血球对胰岛素灵敏性Ⅱ型糖尿病的发生。2.4 反式脂肪酸可能导致乳-腺癌。妇女在绝经后乳-腺癌人数增加和反式脂肪酸摄入量之间存在正比关系。2.5 哺乳期妇女如果大量摄人氢化植物油，TFA可以通过胎盘和乳汁进入婴幼儿体内。使他们被动摄人，对婴儿生长发育产生不可低估的影响。3、反式脂肪酸的检测方法  目前，测定食品中TFA的方法主要包括：气相色谱法（GC）、红外光谱法（IR）、气相色谱质谱法等。其中，气相色谱法可以有效分离各种TFA并准确测定其含量，灵敏度，目前应用较多。3.1 红外光谱法（IR）  红外吸收光谱法是一种使用较早的检测反式脂肪酸含量的方法 ,特别是它能准确测定独立双键的数量。原理是将油脂中的脂肪酸甲酯化 ,然后再在900～1 050/ cm波数范围内进行红外光谱分析 ,该法最大优点是快速方便 ,但由于实验中基线漂移带来误差 ,故该法可导致低反式酸品的测量不准确性 ,且当含量低于 1 %时不易检出。目前利用衰减全反射红外光谱法对方法进行改进 ,减少了样品中脂肪酸的衍生 ,使测定更方便 ,结果更准确。3.2 气相色谱法  在目前研究中，气相色谱法是主要的定量测定反式脂肪酸的方法，其试验费用低，且能成功分离大量脂肪酸，但是也存在顺式和反式异构体会部分同时洗脱下来的问题。3.3 气相色谱质谱法  气相色谱质谱法具有较宽的检测范围和较高的检测水平，并且目标分析物不会被降解。利用气相色谱的高分离度和质谱的高灵敏度，低检测限对于复杂结构样品有很好的检测效果，同时不需要标准品对照是较为理想的检测手段。前景：  TFA是一种不可忽视的具有危害的不饱和脂肪酸，且与人类日常生活联-系密切，广泛存于诸如早餐麦片、面包、咖啡、蛋糕、油炸松脆食品、冷冻食品、方便汤、巧克力、沙拉酱及各类糖果中。且导致多种人类疾病，引起各国学者的关注。2015年6月，美国食品和药物管理局宣布，3年内禁止在食品中使用人造反式脂肪，以助降低心脏疾病发病率。2016年10月26日欧盟成员通过支持对食品中反式脂肪酸设定限量措施。随着国际接轨的加快相信中国也会有越来越多措施出台,以保证食品安全。  目前TFA检测中应用较多的是气相色谱法，已有研究结果表明 不同色谱条件下能够检测到的脂肪酸种类和含量有所不同，因此针对我国食品原料及食品加工工艺的特点，建立标准气相色谱检测法，在能够较全面的检测出中式食品中TFA含量的前提下，如何提高检测速度是一个需要研究的内容。

　　生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；或者抵抗、适应环境条件的某些改变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。　　为了抑制和消除微生物的有害作用，人们常采用多种物理、化学或生物学方法，来抑制或杀死微生物。常用以下术语来表示对微生物的杀灭程度。　　灭菌：用物理或化学方法杀灭物体上所有的微生物（包括病原微生物和非病原微生物及细菌芽胞、霉菌孢子等），称为灭菌。　　消毒：用物理或化学方法仅能杀灭物体上的病原微生物，而对非病原微生物及芽胞和孢子不一定完全杀死，称为消毒。用来消毒的药物称为消毒剂。　　防腐：防止或抑制微生物生长和繁殖的方法称为防腐或抑菌。用于防腐的化学药品称为防腐剂。某些化学药物在低浓度时为防腐剂，在高浓度时则成为消毒剂。　　无菌：指没有活的微生物存在。采取防止或杜绝一切微生物进入动物机体或物体的方法，称为无菌法。以无菌法操作时称为无菌操作。在进行外科手术或微生物学实验时，要求严格的无菌操作，防止微生物的污染。　　不同的微生物对各种理化因子的敏感性不同，同一因素不同剂量对微生物的效应也不同，或者起灭菌作用，或者可能只起消毒或防腐作用。在了解和应用任何一种理化因素对微生物的抑制或致死作用时，还应考虑多种因素的综合效应。例如在增高温度的同时加入另一种化学药剂，则可加速对微生物的破坏作用。大肠杆菌在有酚存在的情况下，温度从30℃增至42℃时明显加快死亡；微生物的生理状态也影响理化因子的作用。营养细胞一般较孢子抗逆性差，幼龄的、代谢活跃的细胞较之老龄的、休眠的细胞易被破坏；微生物生长的培养基以及它们所处的环境对微生物遭受破坏的效应也有明显的影响。如在酸或碱中，热对微生物的破坏作用加大，培养基的粘度也影响抗菌因子的穿透能力；有机质的存在也干扰抗微生物化学因子的效应，或者由于有机物与化学药剂结合而使之失效，或者有机质覆盖于细胞表面，阻碍了化学药剂的渗入。　　常见的影响微生物生长与死亡的物理、化学因素主要有：　　1.温度：　　温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。　　就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12-100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。　　最低生长温度：是指微生物进行繁殖的最低温度界限，如果低于此温度，则生长完全停止。　　最适生长温度：能够使微生物迅速生长繁殖的温度叫做最适生长温度，在此温度下，微生物群体生长繁殖速度最快，代时最短。不同微生物的最适生长温度是不一样的。　　最高生长温度：是指微生物生长繁殖的最高温度界限。　　致死温度：最高生长温度若进一步升高，便可杀死微生物，这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度，致死温度与处理时间有关。　　微生物按其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。　　2.氢离子浓度(pH)：　　环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即pH值来表示。环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。　　每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5，在pH 4-10之间也可以生长；放线菌一般在微碱性即pH7.5-8最适合；酵母菌、霉菌则适合于pH5-6的酸性环境，但生存范围在pH1.5-10之间。有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活。　　微生物在基质中生长，代谢作用改变了基质中氢离子浓度。随着环境pH值的不断变化，微生物生长受阻，当超过最低或最高pH值时，将引起微生物的死亡。为了维持微生物生长过程中pH值的稳定，配制培养基时要注意调节pH值，而且往往还要加入缓冲物以保证pH在微生物生长繁殖过程中的相对稳定。　　强酸和强碱具有杀菌力。无机酸杀菌力虽强，但腐蚀性大。某些有机酸如苯甲酸可用做防腐剂。强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对革兰氏阴性细菌与病毒比对革兰氏阳性细菌作用强。　　3.氧化还原电位：　　氧化还原电位(Φ)对微生物生长有明显影响。环境中Φ值与氧分压有关，也受pH的影响。pH值低时，氧化还原电位高；pH值高时，氧化还原电位低。　　各种微生物生长所要求的Φ值不一样。一般好氧性微生物在Φ值＋0.1伏以上均可生长，以Φ值为＋0.3伏－＋0.4伏时为适。厌氧性微生物只能在Φ值低于＋0.1伏以下生长。兼性厌氧微生物在＋0.1伏以上时进行好氧呼吸，在＋0.1伏以下时进行发酵。　　4.辐射：　　辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能源。它们或是离子或是是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和Υ射线等。　　(1)紫外辐射 紫外线是非电离辐射，以波长265-266纳米的杀菌力最强。紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂，紫外杀菌灯管在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒。　　(2)电离辐射 X射线与α射线、β射线和Υ射线均为电离辐射。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。常用于一次性塑料制品的消毒，也用于食品的消毒。　　5.干燥：　　水分是微生物的正常生命活动必不可少的。干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以至死亡。微生物的种类，环境条件，干燥的程度等均影响干燥对微生物的效果。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏，如用砂土管来保藏有孢子的菌种。在日常生活中也常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。　　6.渗透压：　　水或其他溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象就是渗透。在渗透时溶剂通过半透性膜时的压力即谓渗透压。其大小与溶液浓度成正比。　　适宜于微生物生长的渗透压范围较广，而且它们往往对渗透压有一定的适应能力。突然改变渗透压会使微生物失去活性，逐渐改变渗透压，微生物常能适应这种改变。对一般微生物来说，它们的细胞若置于高渗溶液中，水将通过细胞膜从低浓度的细胞内进入细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡。相反，若将微生物置于低渗溶液或水中，外环境中的水将从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至使细胞破裂。　　由于一般微生物不能耐受高渗透压，所以日常生活中常用高浓度的盐或糖保存食物，如腌渍蔬菜、肉类及蜜饯等。　　7.超声波：　　超声波具有强烈的生物学作用。超声波的作用是使细胞破裂，所以几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。　　8.重金属及其化合物：　　一些重金属离子是微生物细胞的组成成分，当培养基中这些重金属离子浓度低时，对微生物生长有促进作用，反之会产生毒害作用；也有些重金属离子的存在，不管浓度大小，对微生物的生长均会产生有害或致死作用。因此，大多数重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂。其作用最强的是Hg、Ag和Cu。如：二氯化汞又名升汞，是杀菌力极强的消毒剂。0.1-1%浓度的硝酸银常用于皮肤的消毒。　　9.有机化合物：　　对微生物具有有害效应的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性，是常用的杀菌剂。　　酚：酚又名石炭酸。它们对细菌的有害作用可能主要是使蛋白质变性，同时又有表面活性的作用，破坏细胞膜的透性，使细胞内含物外溢。当浓度高时是致死因子，反之则起抑菌作用。　　甲酚是酚的衍生物。杀菌力比酚强几倍。甲酚在水中的溶解度较低，但在皂液与碱性溶液中易形成乳液。市售的消毒剂煤酚皂液（来苏尔）就是甲酚与肥皂的混合液，常用3-5%的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等。　　醇：它是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，损害细胞膜而具杀菌能力。乙醇是普遍使用的消毒剂，常用于实验室内的玻棒、玻片及其他用具的消毒。50-70％的乙醇便可杀死营养细胞；70%的乙醇杀菌效果最好，超过70%以至无水酒精效果较差。　　甲醛：甲醛也是一种常用的杀细菌与杀真菌剂，效果良好。纯甲醛为气体状，可溶于水，市售的福尔马林溶液就是37-40％的甲醛水溶液。　　10.卤族元素及其化合物：　　碘：是强杀菌剂。3-7%碘溶于70-83%的乙醇中配制成碘酊，是皮肤及小伤口有效的消毒剂。碘一般都作外用药。　　氯气或氯化物：这是一类最广泛应用的消毒剂。 氯气一般用于饮水的消毒，次氯酸盐等常用作食品加工过程中的消毒。氯气和氯化物的杀菌机制，是氯与水结合产生了次氯酸(HClO)，次氯酸易分解产生新生态氧，这是一种强氧化剂，对微生物起破坏用。　　11.表面活性剂：　　具有降低表面张力效应的物质称为表面活性剂。这类物质加入培养基中，可影响微生物细胞的生长与分裂。如肥皂、漂白粉、洗衣粉等。　　12.染料：　　染料，特别是碱性染料，在低浓度下可抑制细菌生长。由于这些染料具有选择性抑菌的特点，故常在培养基中加入低浓度的染料配制成选择培养基。例如：碱性三苯甲烷染料，包括孔雀绿、亮绿、结晶紫等，对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用。　　13．化学疗剂：　　能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物即为化学疗剂。它能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。但对人体细胞毒性较小，故常用于口服或注射。化学疗剂种类很多，按其作用与性质又分为抗代谢物和抗生素等。

1.甲醛薰蒸:40％甲醛溶液(药用规格、福建三明化工总厂出品),用量30 ml／m3,室内温度21～24℃,相对湿度75％～85％,加热薰蒸使蒸汽弥漫全室,关闭门窗1 h.甲醛水溶液为无色,具有强烈刺激性气味的液体,可杀灭多数微生物,价廉,熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等.市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛.其主要用法为:①熏蒸消毒:对室内消毒其用量为20－25%毫升/米,在加热该溶液时最-好同时煮沸一壶水,使室内相对温度保持在70-90%左右,室内温度最-好在20摄氏度以上,作用时间12-24小时.如消毒皮毛服装,甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,挂衣密度为每平方米3套为宜.熏蒸消毒时应密闭门窗.消毒后一般多用自然通风驱-散甲醛气体,其需时较长,急于排出气体,可将25%氨水加热蒸发中和.氨水用量为所用甲醛水溶液的一半,中和时间为30分钟.②自然挥发: 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器中,室内温度保持在18摄氏度以上,同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上,经16小时可达到室内消毒的目的.关于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比较:甲酸的毒性比甲醇大6倍,甲醛的毒性比甲醇大30倍.所以吃进4-10克甲醇,就能引起慢性中毒.它的毒性作用主要表现在损伤视力,使视力减退(不能矫正),视野缩小,以致双目失明,直到死亡.每个房间是7个平方,约20个立方.按书上的算要福尔马林300ml,高锰酸钾100g.高锰酸钾放入甲醛液体中后,在开始的3秒钟内没有反映,3秒钟以后,会产生大量烟气.所以一旦在甲醛中加了高锰酸钾请马上离开灭菌室,并关上门.高锰酸钾放入甲醛液体中会使液体沸腾,所以反应要在比较大的大口径容器进行甲醛气体毒性非常强,所以操作时一定要带上防毒面具.2.关于紫外线:紫外线的穿透能力非常弱的,主要靠电离产生氧自由基来消毒.细胞培养室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料盖住.如:玻璃和有机玻璃都可以的.紫外有些人认为大型精密的显微镜是不可以照紫外的,因为它们的镜头上涂的膜会被分解掉,但我特意问了我校光学系的老师,他们认为是没有关系的.紫外线在许多实验室被认为是起心理安慰作用的.我参观过的一个细胞培养 间他们的房间大约6平方米,但是只装了30W的紫外灯,但前提是他们有一个层流系统.如果细胞培养间有层流系统,那紫外的作用是可以被忽略的,但如果没有层流系统,那么紫外的作用还是相当重要.此外,不要担心紫外不能照射到的角落,因为紫外杀菌功能除了紫外本身以外,还可以由产生的臭氧来完成.臭氧过量吸入的作用应该和双氧水的作用是一样的,也许有一定的致癌性.所以紫外灭菌以后,最-好过一个小时再进去.

　　细胞冻存是将细胞储存在低温环境中，减少细胞代谢，实现长期储存的一种技术。在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和演化不断的积累改变，造成表型和基因型的“培养漂移”，在冻存过程中，适当的操作和合适的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丢失，起到细胞保种的作用。因而，正确且成功的冻存对于细胞的长久应用起着非常重要的作用。　　01、正确的培养和温和的细胞收集　　在冻存前，细胞应保持最-佳的生长状态(处于对数期或指数期)，理想情况下，培养基应在收获前24h更换。建议对培养物进行微生物污染物检测，特别是支原体，确保细胞没有任何的污染。在细胞的收集过程中，实验操作要尽可能的温和，避免细胞受损。　　02、适当的低温保护剂　　目前，细胞冻存最-常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞，减少在冷冻过程中对细胞的损害。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。　　聚乙烯基吡咯烷酮、乙二醇、甲醇和甲基乙酰胺等都是低温保护剂。在细胞冻存中最-常见的是二甲基亚砜(DMSO)和甘油，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，关键在于对细胞无明显毒性。DMSO通常浓度为5 - 10% (v/v)，最-佳浓度随细胞系的不同而不同。甘油在冷冻介质中的最终浓度为5 - 15%，同样，最-佳浓度取决于细胞系。为了提高较难保存的细胞的存活率，冻存时可以选择增加保存液中的血清浓度。想要冻存细胞更快更稳，细胞冻存液会是不错的选择，无需配制，直接在细胞中加入适量的冻存液即可，操作简单，就能拥有高活率的细胞。　　03、缓慢的冻存速度　　慢速冻存对细胞活力的恢复是非常重要的。对大多数动物细胞，每分钟降低-1到-3℃能让细胞更好适应冻存状态。目前大多数实验室常用的方法是梯度降温法：在4℃放置30 min，再转入-20℃存放 2h，接着转入-80℃冰箱冷冻过夜，次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。一款可重复使用的细胞冻存盒，可省去多次反复转移细胞的时间，将准备好的细胞冻存管放进冻存盒，直接在-80℃过夜后就可以转移至液氮罐中。无论使用哪种冻存方法，重要的是在转移存放位置的过程中一定要迅速，转移时建议将冻存管放在干冰中恒温，尽量避免转移过程因温度变化对细胞活力的影响。　　04、持续的低温储存　　细胞温度应始终保持在-130℃以下，才能达到最-佳存活率。如果存放温度控制不好，存活率会随着时间的推移而降低。建议将细胞在液氮条件下长期保存，需要定期人工检查液氮罐的密闭性和液氮量是否充足，避免因储存条件造成细胞的损毁。

微生物检测实验中，接种通常是我们避不开的操作，然而在这小小的两字中却蕴含着大乾坤~具体是什么样？一起来看看——接种定义：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。接种和分离工具1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：1、划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。2、三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。3、穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。穿刺接种的两种方法：垂直法和水平法4、浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。5、涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。6、液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。7、注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。8、活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。注：所有接种必须无菌操作

滴定操作看似简单，却是实验操作里重要的环节之一。样品预处理、溶液配制、稀释浓度、融化···几乎随处可见“滴定”这位小朋友的身影。那关于滴定，这些知识你知道吗？滴定操作小知识快问快答12题，助你成长为合格的化验员！！ 1.酸式滴定管涂油的方法是什么？答：将活塞取下，用干净的纸或布把活塞和塞套内壁擦干，用手指蘸少量凡士林在活塞的两头涂上薄薄一圈，在紧靠活塞孔两旁不要涂凡士林，以免堵住活塞孔，涂完，把活塞放回套内，向同一方向旋转活塞几次，使凡士林分布均匀呈透明状态，然后用橡皮圈套住，将活塞固定在塞套内，防止滑出。2.酸式滴定管如何试漏？答：关闭活塞，装入蒸馏水至一定刻线，直立滴定管约2 min，仔细观察刻线上的液面是否下降，滴定管下端有无水滴滴下，及活塞隙缝中有无水渗出，然后，将活塞转动180°等待2 min再观察，如有漏水现象应重新擦干涂油。3.碱式滴定管如何试漏？答：装蒸馏水至一定刻线，直立滴定管约2 min，仔细观察刻线上的液面是否下降，或滴定管下端尖嘴上有无水滴滴下，如有漏水，则应调换胶管中玻璃珠，选择一个大小合适比较圆滑的配上再试，玻璃珠太小或不圆滑都可能漏水，太大操作不方便。4.酸式滴定管如何装溶液？答：装之前应将瓶中标准溶液摇匀，使凝结在瓶内壁的水混入溶液，为了除去滴定管内残留的水分，确保标准溶液浓度不变，应先用此标准溶液淋洗滴定管2～3次，每次用约10 mL，从下口放出少量（约1/3）以洗涤尖嘴部分，应关闭活塞横持滴定管并慢慢转动，使溶液与管内壁处处接触，zui后将溶液从管口倒出弃去，但不要打开活塞，以防活塞上的油脂冲入管内。尽量倒空后再洗第二次，每次都要冲洗尖嘴部分，如此洗2～3次后，即可装入标准溶液至“0”刻线以上。5.碱式滴定管如何赶气泡？答：碱式滴定管应将胶管向上弯曲，用力捏挤玻璃珠使溶液从尖嘴喷出，以排除气泡。碱式滴定管的气泡一般是藏在玻璃珠附近，必须对光检查胶管内气泡是否完全赶尽，赶尽后再调节液面至0.00 mL处，或记下初读数。6.滴定的正确方法？答：滴定时，应使滴定管尖嘴部分插入锥形瓶口（或烧杯口）下1～2 cm处，滴定速度不能太快，以每秒3～4滴为宜，切不可趁液柱流下，边滴边摇。向同一方向作圆周旋转而不应前后振动，因为，那样做会溅出溶液。临近终点时，应1滴或半滴地加入并用洗瓶吹入少量冲洗锥形瓶内壁，使附着的溶液全部流下，然后摇动锥形瓶，观察终点是否已达到。如终点未到，继续滴定，直至准确到达终点为止。7.滴定管读数应遵守下列规则？答：（1）注入溶液或放出溶液后，需等待30 s～1 min后才能读数；（2）滴定管应垂直地夹在滴定台上读数或用两手指拿住滴定管的上端使其垂直后读数；（3）对于无色溶液或浅色溶液，应读弯月面下缘实际的zui低点，对于有色溶液，应使视线与液面两侧的zui高点相切，初读和终读应用同一标准。8.滴定管使用注意事项？答：（1）用毕滴定管后，倒去管内剩余溶液，用水洗净，装入蒸馏水至刻度以上，用大试管套在管口上，这样，下次使用前可不必再用洗液清洗；（2）酸式滴定管长期不用时，活塞部分应垫上纸，否则，时间一久，塞子不易打开，碱式滴定管不用时胶管应拔下，蘸些滑石粉保存。9.移液管和吸量管的洗涤方法？答：移液管和吸量管均可用自来水洗涤，再用蒸馏水洗净，较脏时（内壁挂水珠时）可用铬酸洗液洗净。10.用洗液洗移液管或吸量管的方法是什么？答：右手拿移液管或吸量管，管的下口插入洗液中，左手拿洗耳球，先将球内空气压出，然后把球的尖端接在移液管或吸量管的上口，慢慢松开左手手指，将洗液慢慢吸入管内直至上升到刻度以上部分，等待片刻后，将洗液放回原瓶中。11.用吸量管吸取溶液的方法？答：用右手的拇指和中指捏住移液管或吸量管的上端，将管的下口插入欲取的溶液中，插入不要太浅或太深，太浅会产生吸空，把溶液吸到洗耳球内弄脏溶液，太深又会在管外沾附溶液过多。12.使用吸量管和滴定管注意事项？答：（1）在精密分析中使用的移液管和吸量管都不允许在烘箱中烘干；（2）移液管与容量瓶常配合使用，因此，使用前常作两者的相对体积的校准；（3）为了减少测量误差，吸量管每次都应从zui上面刻度为起始点，往下放出所需体积，而不是放出多少体积就吸取多少体积。滴定几乎是我们入门级的操作，作为合格的化验员我们必须将标准的操作牢记于心，才能检验出正确的结果，更好地服务客户！

做生物检测每一步都需要耐心、细心和恒心，否则就是分分钟重来一次，培养周期几个轮回又将不知何年何月···做生物检测，首先说培养基的灭菌与使用，因为筑牢地基才能建造房子。如何正确地使用并规范地操作，这里关于培养基的重点知识点已经划出——1.每次配置时，要注意其生产日期是否在保质期内，查看其开瓶日期及瓶口密封性，保证其未变质，并且未吸潮。2.培养基配置时，称量要准确，包括盐水的分装要准确。3.一定要保证现配制现灭菌，未灭菌的配好培养基不能长时间放置，更不可隔夜。4.灭菌时要保证恒温、恒压，同时要保证有效灭菌时间。5.灭菌过的培养基要冰箱保存，可保存一周，一般不超过 3 天。而且要遵循“先入先出”原则，先配制的要先使用。6.在使用时，要根据当班次的使用量，先将培养基溶化为液态，然后及时调低水域温度（先化好的可从水域取出，放在水浴锅锅盖上）待用，千万不可长时间使培养基处于高温状态。7.做产品微生物检测时，倾倒培养基温度在 45℃左右，不可过烫，避免将菌烫死；也不可过凉，化好的培养基又结块凝固，不便于观察结果。8.每瓶培养基均要做空白。9.尽量集中做样，避免频繁打开同一瓶培养基瓶塞，增大培养基的污染几率，出现误差结果。10.培养基剩余过少时，可先将其倾倒成空白用板。

众所周知食品安全是重大的民生问题，那么在食品加工过程中有哪些需要避开的雷区？又有什么样的手段和设备能够快速检测出这些危害呢？今天我们就一起聊聊快检那些事儿。一、食品加工中危害分为哪三个方面，每一方面包括哪些因素?● 生物性危害：细菌性危害、真菌性危害、病毒性危害、寄生虫危害、虫鼠害。● 化学性危害：天然毒素及过敏原、农药残留、兽药残留、激素残留、重金属超标、添加剂滥用和非法使用、包装材料、容器与设备带来危害。● 物理性危害：非正常外来杂质(如玻璃、石头、金属、塑料等)。二、简述快速检测定义?在短时间内，如几分钟、十几分钟，采用不同方式方法检测出被检物质是否处于正常状态，检测得到的结果是否符合标准规定值，被检物质本身是不是有毒有害物质，由此而发生的操作行为称之为快速检测。三、简述食品安全快速检测意义?● 快速检测是食品安全监管人员的有利工具：在日常卫生监督过程中，除感官检测外，采用现场快速检测方法，及时发现可疑问题，迅速采取相应措施，这对提高监督工作效率和力度，保障食品安全有着重要的意义。● 快速检测是实验室常规检测的有益补充: 采用快速检测，可使食品安全预警前移，可以扩大食品安全控制范围。对有问题的样品必要时送实验室进一步检测，既提高了监督监测效率，又能提出有针对性的检测项目，达到现场检测与实验室检测的有益互补。● 快速检测是大型活动卫生保障与应急事件处理的有效措施：在大型活动卫生保障中，为了防止发生群发性食物中毒● 快速检测是中国国情的一种需要：中国在提高食品安全整体水平方面仍有很长的路要走，快速检测将会在其中起到积极有效的作用。四、现场快速检测方法形式有哪些?● 试纸法:用试纸直接显色来定性并作为限量指示、用试纸层析显色或层析后胶体金显色来定性或作为限量指示、用试纸显色的深浅来半定量。● 试管法：用速测管显色来定性、用速测管显色的深浅半定量。● 滴瓶法：将标准溶液放在滴瓶中，根据消耗的滴数来判定被检物质的含量。五、快速检测结果表述形式有哪些?● 定性检测：即快速地得出被检样品中是否含有有毒有害物质，或其本身就是有毒有害物质。通常以阴性或阳性表述。阴性表示用本方法未检出要检测的物质。阳性表示检出了有毒有害物质。● 限量检测：即快速地得出被检样品中有毒有害物质是否超出标准规定值或有效物质是否达到标准规定值。通常以合格或不合格表述。● 半定量检测：能够快速地得出所测物质的大概含量，通常以合格或不合格表述，也可标示出具体数值。● 定量检测：如温度、湿度、消毒间紫外线辅照强度、纯净水电导率等物理指标的检测。通常以具体数值表述。六、简述快速检测注意事项及采样的注意事项?● 检测注意事项：①对于阳性结果以及不合格结果的样品：应重复测试，排除偶然误差。重要样品，如含急性中毒物质或可能会对后期处理带来较大社会影响或较大经济损失的样品，应注意留样，并将样品送实验室进一步确证。②对于阴性与阳性、合格与不合格之间不易判定的样品：应重复测试，以多次重复相同的结果报告之。● 采样注意事项：①为了监测总体样品的安全卫生状况，应注意采样的代表性原则。均衡地，不加选择地从全部批次的各部分随机性采样。②为了检验样品掺假、投毒或怀疑中毒的食物等，应注意采样的典型性原则。根据已掌握的情况有针对性地采样。如怀疑某种食物可能是食物中毒的原因食品，或者感官上已初步判定出该食品存在卫生质量问题，而进行有针对性的选择采样。③当检出阳性样品或不合格样品时，应考虑采样方法是否正确。必要时送实验室进一步检测。

一、实验室洗眼器使用攻略洗眼器是安全和劳动保护必-备的设备，是接触酸、碱、有机物等有毒、腐蚀性物质场合必-备的应急、 保护设施。在安装时，洗眼器喷头尽量不要与硬物磕碰，以免损坏表面光泽，要注意将管道内杂物清除后，装上洗眼器喷头。在水压不低于0.02mpa的情况下，使用一段时间以后，如果发现出水量减小，甚至出现热水器熄火的现象，可以在洗眼器的喷头处得出水口轻轻拧下晒网罩，清除杂质。另外，开关球阀不要用力过猛，顺势轻轻转动即可，也不要拧死，不要把手柄当成扶手来使用，洗眼器要注重日常保养，这样才能增长使用寿命。洗眼器在使用时也要注意以下几点：       1、冲洗身体其他部位时，用手向下拉阀门拉杆，水从喷淋头自动喷出，用后须将拉杆向上复位。        2、洗眼器用于紧急情况下，暂时减缓有害物质对身体侵害，进一步处理治疗，听从医生的指导。       3、洗眼器使用时，冲洗眼部只要用手轻推手推阀，清洁水从洗眼喷头自动喷出来，用后须将手推阀复位并将防尘盖复位。二、如何科学地选用洗眼器设备目前市场上洗眼器种类繁多，国产和进口的都有，进口产品结构不一定符合中国人的人体工程学，可选用改进型的适合中国人的产品。洗眼器、淋洗器按类型分为洗眼、洗脸、冲淋3类型及其复合类型。另外，冲洗软管在满足适当要求的情况下可以替代洗眼器或者复合洗眼洗脸器，但是不能替代淋洗器。冲洗软管作为洗眼器、淋洗器的有益补充，尤其适用于实验室等场所。便携式洗眼器主要适用于没有固定水源的工作场所或者是需要经常移动工作场所的地方。     洗眼器、淋洗器主要材质有不锈钢、铜、工程塑料，应根据不同的作业场所进行选用。进口的产品一般为ABS工程塑料制造而成；国内洗眼器、淋洗器生产商基本上都使用304不锈钢，该材质符合饮用水标准，又能抵抗一般的化学物质腐蚀。但是对于强酸如盐酸、硫酸，强碱如氢氧化钠、氢氧化钾及氯化物、氟化物等强腐蚀环境下，一般的不锈钢难以抵御，这就需要选用进口的不锈钢或者黄铜材料进行ABS浸塑的洗眼器或者具有高性能抗腐蚀的不锈钢洗眼器。对于北方寒冷地区，还应考虑冬季出水温度很低甚至结冰等情况，可采用手动排空或者脚动排空及较先-进的自动排空型洗眼器，以防止洗眼器出水管路结冰；也可采用电加热或电伴热型设备，使出水温度达到适宜温度的要求。三、洗眼器的安装要求安全防护设施 ： 如桌上型洗眼器 、 洗眼器 、安全箱等。桌上型洗眼器要放于水槽右侧， 因中国人习惯右手操作的缘故； 洗眼器要放置在出口处 ，且室内要求配地漏； 安全箱则应放在最-显眼的地方，内装急救药品。洗眼器、淋洗器的服务半径应在15m内，保证使用者直线达到设备的时间不超过10s。设备至少要有3个方向的工作的位置，周边无障碍物，以便迅速使用。洗眼器周围应没有电器开关，以防发生意外。     所有洗眼器、淋洗器的区域必须保持一条至少1m宽的通道。同时保持一个以喷淋头为中心直径不小于1.2m的空旷区域，并且该区域必须刷成安全色。在洗眼器和冲淋设备的周围，应有醒目的标志，标志最-好用中英文双语和图示，非常形象地告诉作业现场的人员洗眼器和冲淋设备的位置和用途。可在设备上安装夜光指示标志，也可以配备防爆型的声光报警器和防爆灯，在设备使用时提醒其他人员前来救助。    洗眼器的每一个喷头上面都应该有一个防尘盖。洗眼器的阀门应该容易操作，且打开时间不能超过1s，阀门应该具有防腐蚀的功能。洗眼器的喷头应加有过滤器，避免水中的杂物对人体眼睛造成伤害。四、洗眼器设备的维护、检修和培训洗眼器和冲淋设备如长期不使用，水管内可能生成杂质，如果用含有杂质的水冲洗眼睛，容易引起眼部炎症，加重眼的损伤；如用来冲洗化学性灼伤引起的皮肤破损，也容易发生感染，带来严重的后果。因此，洗眼器和冲淋设备最少每周启动一次，查看是否能够正常运行，这一频率可减少在停滞的供水管线中沉淀物积聚的机会和微生物危害成长的可能。对于可以移动的洗眼器(比如便携式洗眼器，便携式压力洗眼器)，需要安排专人每天检查储备的水源是否充足。同时建议储备的水源每天更换1次，以保证水质。每年需要对洗眼器和冲淋设备进行1次年检，查看设备是否处于完好状态。     对于长期暴露在危险作业环境下的作业人员，设备供应商应该提供更多的技术指导和正确使用洗眼器和冲淋设备的方法。作业人员心须熟知急救设备的位置，尤其当应急设备或者布局发生变动时。应定期对作业人员进行再培训，提醒员工知道应急设备的设置不能取代利用基本的个人防护用品，如防护眼镜、防飞溅面罩、防护手套、防飞溅长袍、防化服。对于洗眼器和冲淋设备的维护、检修，生产商应该提供相应的技术培训。五、洗眼器引发的思考对作业场所潜在的危险有害因素和风险程度进行详细的评估，对于选择和安装适当的应急设备是至关重要的，将确保选择适宜的设备。危险源辨识可参考化学物资的MSDS中物质的危险特性和健康危害、急救措施等条目。另外，在项目的安全预评价及安全现状评价中都有对危险源进行辨识，为危险源的确认提供了依据。   通过辨识，具有有毒物质危害、尘毒危害、低温危害、高温危害及具有化学性灼伤危害的生产车间、仓库、罐区、实验室及露天作业场所等需要设置应急洗眼器、应急淋洗器。    应急洗眼器、应急淋洗器的设备制造商也能协助对作业场所的危险源进行辨识，并作出危险性评估，为应急洗眼器、应急淋洗器的设置提供更具操作性的建议。小结考虑到我国目前多数地区针对化学品急性中毒的专业救治机构和专业救治队伍的建设还很不完善，因此在化工企业内或者行业实验室设置应急救援设备如洗眼器等个人防护设备，显得尤为必要，能够争取紧急救治的“黄金时间”。企业应制定完善的应急救援预案，明确岗位职责，建立实验室内部的应急救援队伍，并定期进行专业知识学习、技能培训。