细胞坏死是细胞受到急性强力伤害时立即出现的早期反应，包括细胞膜直接被破坏，大量水进人细胞；线粒体外膜肿胀而密度增加；核染色质呈絮状；蛋白质合成减慢。如及时去除伤害因素，以上早期反应尚可逆转。若伤害外因持续存在，则发生不可逆的变化，如细胞骨架破坏，溶酶体解体，pH下降，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。细胞凋亡（cell apoptosis）是借用古希腊语，表示细胞像秋天的树叶一样凋落的死亡方式。1972年Kerr最先提出这一概念，他发现结扎大鼠肝的左、中叶门静脉后，其周围细胞发生缺血性坏死，但肝动脉供应区的实质细胞仍存活，只是范围逐渐缩小，其间一些细胞不断转变成细胞质小块，不伴有炎症，后来在正常鼠肝中也偶然见到这一现象。细胞凋亡不同于细胞坏死的特点是：（1）染色质聚集、分块、位于核膜上，细胞质凝缩，最后细胞核破裂；（2）细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体，凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内容物释放，故不会引起炎症；（3）线粒体无变化，溶酶体活性不增加；（4）内切酶活化，DNA降解，凝胶电泳图谱呈梯状；（5）凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。

健康红细胞(RBCs)的平均寿命是120天，但在某些病理状况下，如败血症和镰状细胞病一类干扰了RBCs正常生成的疾病中它们的寿命会缩短。在冠状动脉搭桥手术或透析过程中这些细胞也可以受损，输血有可能包含了在采集、储存和管理过程中受损的RBCs。受损的RBCs可以释放出非结合形式的携铁血红蛋白，引起肾损伤并可导致贫血，减少了输送到组织的氧气量。如果疾病相关RBC损伤压倒了细胞清除衰老RBCs的能力，就会释放出毒性水平的游离铁原子。在当前的研究中，研究小组采用了几种不同的RBD损伤模型来调查与红细胞清除和铁原子回收相关的机制。小鼠实验揭示血液中存在受损RBCs导致了一种特殊的单核细胞群迅速增加，这些细胞摄取受损RBCs，移动到了肝脏和脾脏中。但数小时后所有这些RBCs都定位在了只观察到存在于肝脏的一个特殊的巨噬细胞群中——这些细胞是由吞食和处理碎片、受损细胞和微生物的单核细胞所生成。这些巨噬细胞最终会在不再需要它们时消失。研究人员还证实表达趋化因子（指导其他细胞移动的蛋白）将摄取RBC的单核细胞吸引到了肝脏处，导致了铁回收巨噬细胞累积。阻断这一过程可导致RBC清除受损的几种征象，包括毒性水平的游离铁原子和血红蛋白，肝脏和肾脏受损的迹象。肝脏是清除RBC和回收铁的主要器官，这一事实令人感到惊讶，是因为肝脏依赖于由骨髓源性单核细胞组成的一个缓冲系统，这些单核细胞可以破坏血液中受损的红细胞，它们定居在肝脏中，在那里变成了能够回收铁的过渡巨噬细胞。我们发现的这一机制有可能是有益或是有害的，这视乎情况而定。如果过度活化，它可以清除过多的RBCs，但如果它行动迟缓或是受损，则可以导致铁中毒。进一步的研究可以提供给我们有关这一机制起初如何发生的细节，帮助我们了解如何在各种情况下利用或抑制它。红细胞穿越血管把氧气输送到几乎身体的各个角落和缝隙。但并不是所有的红细胞能够携运氧气的。麻省理工学院的的一个研究人员团队，通过工程红细胞表面上具有的“粘性”蛋白，赋予红细胞携运无论从治疗免疫性疾病或癌症的药物到用于血管成像的放射性分子的能力（把红细胞转变为药物载体 ）。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

一、本质不同：间接的酶标抗体是二抗，与待检抗体结合；阻断酶标抗体是一抗，与抗原结合。间接中底物降解的量与抗体量相等，阻断底物降解量与抗体。二、实验结果不同：酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法。OD值不同是因为前后样液的浓度不同，所以透光率也不一样，但是前后的OD值都是表示同一种物质在不同浓度时的OD值，只是相对在0.2-0.8范围内比较精确而已。三、用途不同：ELISA更为简便实用和标准化,从而使其成为最广泛应用的检测方法之一，目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断，在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。用于标记的酶 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。

阴树脂和阳树脂有什么不同？交换原理：阴离子交换树脂体内含有大量的碱性基团，是通过氯来与水中的杂质交换，而阳离子交换树脂则含有大量的酸性基团，是通过钠离子或者氢离子与水中的杂质进行交换。交换顺序：1、混床树脂的交换顺序一般是先阳离子，然后才是阴离子，阳离子交换树脂会释放出酸性基团，而阴离子交换树脂则会释放出碱性基团，两者中和，成为纯水。2、离子所带有的电荷多，就容易被树脂吸附，而所带有的电荷较少，则比较难吸附。3、如果带有相同电荷量的离子，原子序数大的元素，形成离子的水合半径小，较易被吸着。温度：阳离子交换树脂的耐温性比较好，所以一般阳离子交换树脂的使用温度或者储存温度都要比阴离子交换树脂高一些。预处理：阴阳离子交换树脂的功能基团不同，所以树脂预处理时使用的溶液也不同，阴阳树脂在使用饱和食盐水浸泡18-20小时之后，使用清水清洗干净。阴树脂使用浓度为5%的氯化氢进行浸泡4-8小时，清洗干净，再使用浓度在2%-4%左右的氢氧化钠浸泡4-8小时，清洗至中性即可。而阳树脂则使用浓度在2%-4%左右的氢氧化钠浸泡2-4小时，清洗干净后，使用浓度为5%的氯化氢进行浸泡4-8小时，清洗至中性即可。

原代组织细胞的解离从原代组织上获取单个细胞悬液的常用方法是利用酶的解聚作用。尽量缩短用酶处理细胞的时间，以获得高的存活率。按下面的方法解聚整个组织，以获得大量细胞。胰酶1．先去除无关组织，然后用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。通过在不含钙镁的平衡盐溶液进行重悬来清洗组织碎块。待组织碎块沉降后去掉上清液。重复清洗2-3次。2．将装有组织碎块的容器置于冰上，去掉所有上清液。在不含钙镁的平衡盐溶液中加入0.25%胰酶（每100mg组织大约需要1ml 胰酶）。3．在4℃ 下孵育6-18小时，使低活性的胰酶尽量渗入组织。4．缓慢倒掉胰酶。在37℃ 下将残余的胰酶与组织碎块共同孵育20-30分钟。5．向组织碎块加入温热的完全培养基，并轻轻地吹吸以分散组织。如果使用无血清培养基。还应加入大豆胰酶抑制剂。6． 用灭菌的不锈钢网（100-200μm）过滤细胞悬浮液，直至所有组织完全散开。计算细胞个数，然后接种细胞进行培养。胶原酶1．用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。用Hanks平衡盐溶液（HBSS）将组织碎块清洗数次。2．加入胶原酶（50-200单位/ml胶原酶HBSS）。3．在37℃ 下孵育4-18小时。加入3mM CaCl2 可以提高解离效率。4．用灭菌的不锈钢网或尼龙网过滤细胞悬浮液，将离散的细胞和组织片段与大块的组织碎片分离。如需进一步解离，可向组织片段中加入新鲜的胶原酶。5．通过离心HBSS清洗细胞悬浮液数次。6．用培养基重悬细胞。计算细胞个数，然后接种细胞进行培养。分散酶1．用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。用不含钙镁离子的平衡盐溶液清洗组织碎块数次。2．加入分散酶（0.6-2.4单位/ml分散酶不含钙镁的平衡盐溶液）。3．在37℃下孵育20分钟至数小时。4．用灭菌的不锈钢网或尼友网过滤细胞悬浮液，将离散的细胞和组织片段与大块的组织碎片分离。如需进一步解离，可向组织片段中加入新鲜分散酶。5．通过离心平衡盐溶液清洗细胞悬浮液数次。6．用培养基重悬细胞。计算细胞个数，然后接种细胞进行培养。

　　影响质粒提取的因素：　　质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。　　宿主菌种类　　质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，多数情况下我们是从大肠杆菌中提取质粒。大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的质量。从宿主菌如DH5α和*0中可以得到高质量的质粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖类，如果没有完全去除，将抑制后续实验中的酶活性，影响质粒DNA提取的质量。另外，有些菌株有非常高的内切酶活性，会降低DNA的得率。因此推荐使用DH5α和*0来提取质粒DNA。　　培养时间　　从固体培养基平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（含有相关抗生素的液体培养基中），振荡培养12-16小时。不应超过16小时，因为这时细胞开始裂解，使得质粒的得率降低，也会导致质粒丢失或质粒变异。　　质粒扩增　　氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成，但对松弛型质粒的复制没有影响。因此，在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质粒的拷贝数。由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成，从而抑制了染色体的复制，但质粒复制所用的酶半衰期较长，故质粒仍可继续复制，这样既可增加质粒产量，又可降低细胞的数量，使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于扩增的氯霉素浓度为170ug/ml 。　　抗生素　　在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。现在用的许多质粒都不含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点，无质粒的子细胞在无抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。

　　天然产物提取工艺学简介：资源、环境与持续发展战略问题已成为人类社会所面临的全球性热点问题，要求精细、高效利用生物资源。吾国生物资源丰富，每种生物又由多种物质组成，它们都属于动物、植物、昆虫、海洋生物及微生物主代谢和次代谢的化学物质，也叫天然产物，这就构成了丰富多彩的天然产物资源。　　常温超高压技术　　高压生物化学研究已经证明：压力达到一定值，蛋白质、多糖（淀粉、纤维素）等有机大分子会发生变性，但生物碱、低聚糖、甾、萜、苷、挥发油、维生素等小分子物质则不发生任何变化。　　在高压生物化学的研究中还证明了：高压灭菌的机理是，压力作用于微生物，使细胞壁变性、破裂，细胞内容物外泄，从而使微生物致死。在肉、鱼、水果、蔬菜的高压加工中也证实了细胞的这种变化。　　超高压提取就是利用了超高压对生物材料的这种作用实现有效成分提取的。植物细胞壁上有很多微孔，因此我们可以把植物细胞壁看作是由许多微孔组成的薄膜。当植物细胞处于溶剂中时，溶剂将通过这些微孔进入细胞内部。　　超声波提取技术　　超声波是一种高频率的机械波。超声场主要通过超声空化向体系提供能量。频率范围在15-60kHz的超声，常被用于过程强化和引发化学反应，超声波在天然产物有效成分提取等方面已有了一定作用。其原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的回流提取、索氏提取发比较，具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等优点。已被许多天然产物分析过程选为供试样处理的手段。　　微波辅助提取技术　　微波是一种非电离的电磁辐射。微波辅助提取（Microwave Assisted Extraction，MAE）是利用微波能来提高萃取率的新发展起来的技术。被提取的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，可以保证能量的快速传递和充分利用，易于溶出和释放。微波辅助提取（以下简称微波提取）的研究表明，微波辐射诱导萃取技术具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分收率高的特点，已被成功应用在药材的浸出、中药活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、挤压，这样有利于有效成分的浸出，提取过程中，药材不凝聚，不糊化，克服了热水提取易凝聚、易糊化的缺点。　　微波萃取技术有一定的局限性，只适宜于对热稳定的产物。　　酶法提取技术　　天然植物的细胞壁由纤维素构成，其中的有效成分往往是包裹在细胞壁内。酶法就是利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等（主要是纤维素酶），破坏植物的细胞壁，以利于有效成分最大限度溶出的一种方法。酶反应可以较温和的将植物组织分解，从而大幅度提高提取效率。　　分子蒸馏技术　　分子蒸馏技术出现于20世纪30年代，目前在许多国家工业上得到了规模化应用。中国的分子蒸馏技术现在已经成功运用于医药、精细化工、油脂化工、食品添加剂等行业中，在中药产业正逐步得到重视。　　在高真空度下，液体分子只需很小的能量就能克服液体内部引力，离开液面而蒸发。分子蒸馏是在极高的真空度下，依靠混合物分子运动平均自由程的差异，是液体在远低于其沸点的温度下迅速得到分离。　　分子运动自由程指一个分子与其它分子相邻两次碰撞之间所走过的路程。某时间间隔内自由程的平均值称为分子运动平均自由程。在压力和温度一定的条件下，不同种类的分子由于分子有效直径的不同，其分子平均自由程也不同。从统计学观点来看，不同种类的分子逸出液面后不与其他分子碰撞的飞行距离是不同的，轻分子的平均自由程大，重分子的平均自由程大小。如果冷凝面与蒸发面的间距小于轻分子的平均自由程，而大于重分子的平均自由程，这样轻分子可达到冷凝面被冷却收集，重分子因达不到冷凝面相互碰撞而返回液面，从而实现了混合物料的分离。　　超临界流体萃取技术　　超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction， SFE）技术是20世纪60年代兴起的一种新型分离技术。20世纪80年代中期以来，由于其选择分离效果好、提取率高、产物没有有机溶剂残留、有利于热敏性物质和易氧化物质的萃取等特点SFE技术逐渐被运用到天然产物有效成分的提取分离上，并且与GC、IR、GC-MS、HPLC等联用形成有效的分离技术。　　超临界流体（Supercritical Fluid，SF）是指在临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，以流体形式存在的物质，目前研究较多、最常用的超临界流体是二氧化碳。在超临界状态下将SF与待分离的物质接触，使其有选择性地溶解其中的某些组分。SF的密度和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加，因此利用程序升压可将不同极性的成分进行分步提取。然后通过减压、升温或吸附的方法使超临界流体变成普通气体，让被萃取物质分离析出，从而达到分离提纯的目的，这就是超临界流体萃取的基本原理。　　目前，超临界萃取技术的分离主要用于挥发油、生物碱类、香豆素和木脂素类、黄酮类、萜类、苷类、醌类等天然产物活性成分提取。　　大孔树脂吸附　　大孔吸附树脂是20世纪60年代开发出的一类新型高分子分离材料，是一种高聚物吸附剂，根据其孔径、比表面积及构成类型分为许多型号。20世纪70年代末我国有学者开始用来进行天然产物有效成分的分离纯化研究。　　大孔吸附树脂分离技术的应用原理主要是利用特殊的吸附剂——大孔吸附树脂的吸附性和分子筛相结合的原理，从天然产物提取液中有选择的吸附住其中的有效成分，去除杂质。特别是非极性吸附树脂，在吸附提取液中的有效成分时，主要是物理结构（如比表面积、孔径等）在起吸附作用。　　采用大孔吸附树脂分离纯化操作的基本程序大多是：天然产物提取液?通过大孔树脂吸附有效成分?乙醇溶液梯度洗脱?回收溶剂?得到提取液浸膏?干燥?半成品。　　大孔吸附树脂工艺对于富集天然产物中的黄酮类、生物碱类、苷类等有效成分是卓有成效的。　　膜分离技术　　膜分离技术（Membrane Separation Technique，MST）是一项新兴的高效分离技术，已被国际公认为是20世纪末到21世纪中期最有发展前途的一项重大高新生产技术。是利用天然或人工合成的具有选择透过性的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分体系进行分离、分级、提纯或富集的技术。膜分离技术（以下简称膜技术）包括超滤、微滤、纳滤和反渗透等。　　目前该技术也被广泛应用于中药制剂的生产方面，尤其是超滤技术自20世纪90年代以来以其高效、节能和绿色等特点，在中药制剂中的应用越来越多。　　膜分离技术的应用原理近似机械筛，是以压力为推动力，实现溶质与溶剂的分离，溶剂（水）和其它小分子量溶质透过具有不对称微孔结构的滤膜，大分子溶质和微粒（如蛋白质、病毒、细菌、胶体等）被滤膜阻留，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。在常温下操作，无相变，能耗低。　　采用超滤技术可以滤除天然产物水提液中的相对分子量大于几万的杂质（无效成分），如纤维素、黏液质、树胶、果胶、淀粉、鞣质、蛋白质（少数药材除外）、树脂等成分。　　澄清技术　　近年来，一些新材料、新技术开始应用于天然产物提取液的澄清。不仅可降低成本、缩短生产周期，也能保证制剂稳定性及有效成分的含量。如101果汁澄清剂、甲壳素、ZTC天然澄清剂等在提取液澄清方面的应用，很大程度上解决了经典乙醇沉淀法引起的饿问题。101果汁澄清剂是水溶性胶状物质，安全无毒，不引入杂质并可随沉淀后的不溶性物质一同除去。甲壳素类（如壳聚糖）带正电荷，可沉降提取液中带负电荷的悬浮物。ZTC天然澄清剂可出去鞣质、蛋白质、胶体等不稳定成分，且对有效成分影响不大。　　分子印迹技术　　分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology，MIT）是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，这种技术是选用能与印迹分子产生特定相互作用的功能性单体，在印迹分子周围与交联剂进行聚合，形成三位交联的聚合物网络，然后，通过合适的溶剂除去印迹分子，在聚合物网络中形成空间和化学功能与印迹分子互补的空穴。整个聚合过程可分为三步：印迹、聚合、去除印迹分子。

抗衰老，一听这几个字大家都会不自觉地想到皮肤抗衰老，因为这是在日常生活中大家都会注意到的一个点，但其实除了皮肤抗衰以外，我们更应该重视身体的抗衰！一、为什么要重视身体抗衰？因为无论是皮肤还是身体，人体的衰老都是从细胞开始的，我们之所以看重皮肤抗衰老，其中一个重要的原因就是“觉得自己的皮肤没有以前好了”，那么同样的我们的身体特别是身体的免疫力，在达到巅峰后也会随着年龄的增长，加之生活环境、心理压力以及不良生活习惯的影响下逐渐走下坡。而当人体免疫失衡或是生病，就意味着免疫细胞不再是一个健康状态，那么它对抗病毒、细菌的能力就下降了，无法及时清除受损、癌变细胞的同时，导致衰老、罹患感染疾病、慢性疾病与癌症的风险也相应提高，这也是年龄越大越容易生病的道理，所以比起皮肤抗衰我们更应该注重身体抗衰！二、免疫细胞是如何抗衰的？人体内免疫细胞主要的分为NK细胞、T细胞、B细胞、吞噬细胞，这些免疫细胞在我们体内承担着免疫监视、免疫防御和免疫自稳的作用，所以它们的数量和质量与我们的健康息息相关！免疫细胞对细菌、病毒以及癌细胞具有强大的杀伤力，奉行着“非我族类统统杀掉”的原则，当免疫细胞消灭入侵的有害物时（即排异反应）人才会不生病，而当免疫细胞发挥保护自身组织功能和结构稳定时，便可以达到抗衰老的目的。就拿NK细胞来说，它的抗衰原理可以分为以下这几点：1.天然细胞毒性：NK细胞活化后释放穿孔素（perforin）和颗粒酶（GranzymeB），穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶B进入靶细胞发挥直接的广谱性杀伤作用；2.NK细胞介导的靶细胞凋亡：NK细胞表达可以诱导细胞凋亡的蛋白（FasL）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），可使靶细胞进入程序性凋亡状态。3.抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）：特异性抗体通过其Fc段结合到NK细胞表面的Fc受体上，把NK细胞导向靶细胞，赋予NK细胞特异性，是多种抗癌单克隆抗体的重要作用机理；4.NK细胞产生的细胞因子：活化的NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等多种细胞因子，或直接作用于靶细胞，或通过进一步激活其他种类的免疫细胞来攻击靶细胞。免疫细胞不仅能直接清除人体衰老细胞，建立强大的免疫屏障补充有活力的新细胞外，还能减缓器官衰老进程在完善机体的同时，激活人体本身的其他免疫细胞功能。

一、免疫组化技术的基本原理应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。二、免疫组织化学染色方法1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。三、几种常用免疫组织化学方法的原理1、免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法、ABC法、SP法等。3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。四、免疫组化技术的优点1、特异性强 免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。2、敏感性高 在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3、定位准确、形态与功能相结合 该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养液或培养基的含义几乎相同，英文都是medium。当它是粉剂时，倾向性地称为培养基，而将粉剂配成液体后，多称为培养液。培养液中常常补加血清、抗生素等成分。培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。细胞培养基的质量标准和检测方法澄清度水是细胞培养基的溶剂。细胞培养基中的营养成分只有完全溶解于水才能被细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此细胞培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。该项目是通过对水溶解后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的澄清度。 按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅸ B进行。pH 值哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，pH过高或者过低都会导致细胞死亡。pH值的测定也可以检查细胞培养基的批间差。清大天一标准规定取规定量供试品，用注射用水（水温20℃-30℃）溶解至1L，加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中，用与细胞培养基溶液pH值相近的两点标准缓冲液校准后的酸度计进行测定。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行；加入规定量的碳酸氢钠到上述溶液中，按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行干燥减量的质量分数细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥减量的质量分数表示产品中含湿量。细胞培养基是有菌制剂，其丰富的营养成分有利于微生物生长，控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养基的养分。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进行。渗透压溶剂通过半透膜由低浓度向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗透所需施加的压力，称为渗透压。细胞必须生活在等渗环境中，动物细胞借助K＋、Na＋维持渗透平衡。大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水wei缩，培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂，因此要控制培养基的渗透压范围。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法进行。细菌内毒素细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。它的特殊性在于不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。培养基细菌内毒素过高，对生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程药品等注射用的药品都需要检查细菌内毒素。 因此本项目的检验符合生物制品质量控制要求。常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为＜10 EU/ml。称取本品规定量（见表4-12）的1/100，加入细菌内毒素检查用水10 mL溶解，吸取该溶液0.1 mL加细菌内毒素检查用水3.9 mL，混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。微生物限度细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。清大天一在参考《中华人民共和国药典》2005版二部附录第100页的口服给药制剂的微生物限度标准，并严于该标准，规定细胞培养基产品的细菌数每1g不得超过200个，霉菌数每1g不得超过50个。称取样品1 g，加入无菌纯化水10 mL溶解，混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。细胞生长试验这是一个性能特性表述的要求。细胞培养基的功能就是培养哺乳类动物细胞，因此经过细胞培养效果的检验是产品质量优劣的直观表述，这也是很多生物制药用户要求的一项指标。目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，可参考《体外培养的原理与技术》中细胞计数fa论述的内容给出。按产品说明书配制培养液进行细胞培养，前四天用含10％小牛血清的培养液培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基是否有促生长的能力。后三天用不含小牛血清的培养液维持培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基中是否有不利细胞生长的毒素。本试验用细胞为VERO细胞。细胞培养液的储存，细胞培养液的储存条件一般为2－8℃、密闭、避光保存，但要注意如下几点：1） 过滤后的完全培养液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用，一般在2－3周内使用完。培养液中的L-谷氨酰胺是不稳定的，不同温度L－谷氨酰胺的降解。2） 灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液，一般可在4℃保存6～9个月，也可冷冻保存，用时解冻3） 高压除菌后的培养基应置4℃保存，不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。4） 添加某些生长因子、激素等添加物，可能会改变培养液的储存条件，比如温度、时间等方面的要求

　　蛋白纯化似乎是生物学“研究僧”们躲不过的一个“劫”，很多童鞋开始就难住了，微珠怎么选？选哪一种？小朋友你是否也有很多问号？不用担心，远慕为您解惑！　　长久以来，多孔的琼脂糖珠 （也称琼脂糖树脂） 作为免疫沉淀实验中的固相支持物常用的材料。　　琼脂糖珠海绵状的结构 （直径 50-150 μm） 可以结合抗体 （继而结合靶蛋白），它能够直接高效、快速结合抗体，而不需借助特殊的专业设备。磁珠　　在无需抗体饱和的情况下，琼脂糖珠能很好的结合极大量目的蛋白。但值得注意的是，在免疫沉淀实验中，抗体的量常常不足以满足琼脂糖珠的饱和荷载量，没有被抗体覆盖的琼脂糖珠的部分则可以自由地结合任何可粘附的物质，这种非特异性结合升高引起背景信号升高，这时，“高荷载量优势”会变成“高荷载量劣势”。对裂解样本进行预处理操作，是去除非特异性结合物最为简单有效的方法。　　预处理　　裂解样本是蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸的混合物，与抗体、蛋白 A/G、微珠材料会发生非特异性结合，从而对免疫沉淀结果造成影响。主要方法有两种：　　a. 排除由于微珠本身材质引起的非特异性结合：将裂解样本与微珠单独混合孵育，随后去除微珠并收集上清液，再进行免疫沉淀实验。　　b. 排除由细胞成分引起的非特异性结合：使用相同抗体亚型类别但不靶向目的蛋白的抗体，在相同的组分条件中与裂解样本混合孵育，再进行免疫沉淀实验。　　目前，超顺磁性微珠已经大幅取代琼脂糖珠，成为免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法的首先选择。　　与琼脂糖珠不同，磁珠是固体，抗体的结合仅限于磁珠的表面。磁珠 （直径 1-4 μm） 明显小于琼脂糖珠，尽管磁珠没有多孔中心增加结合能力，但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多，使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合。琼脂糖珠　　结合能力　　由于琼脂糖珠直径较大且具有海绵状结构，因而比磁珠有更大的表面积和更大的结合能力。但是琼脂糖珠的可变多孔径会使抗体会落入孔内，导致结合受限，尤其是超大蛋白 （一般是蛋白复合物） 的结合，并且抗体可能会在洗涤步骤 （离心） 中流失。相反，绑定在磁珠表面的抗体均能与目的蛋白结合，并且抗体很少会在温和的洗涤步骤 （磁性分离） 中流失。　　另外，琼脂糖珠的非特异性结合能力大于磁珠。琼脂糖珠的非特异性结合不限于其表面抗体结合位点，抗体的任何表面或参加免疫沉淀反应的成分均可与样品中非目的蛋白成分结合，即使使用完全饱和的珠子，仍会发生非特异性结合。因此，进行免疫沉淀之前预处理样品极为重要。　　成本　　免疫沉淀中设计微珠的成本主要取决于免疫沉淀方法和每个免疫沉淀反应所需要的微珠量。　　琼脂糖珠：琼脂糖珠必须通过离心浓缩在管底部，并在每次孵育和洗涤除去上清液，通常需要肉眼识别管底部的琼脂糖珠，因此，每个免疫沉淀实验至少需要使用 25-50 μL 的琼脂糖珠。　　磁珠：采用磁性分离，无需设定最小体积的的磁珠使用量，用量仅取决于目的蛋白和免疫沉淀抗体。　　当然，在使用琼脂糖珠的过程中，可以使用过滤离心柱代替普通的微量离心管，该离心柱包含一个过滤器，允许通过短暂的离心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流过，因此可以显着减少每个反应所需的琼脂糖珠使用量。　　简单快速　　由于琼脂糖珠免疫沉淀需要较长的孵育时间，预处理步骤和多次离心，所以其需要大量的手动操作，总时间为 1-1.5 小时。相反，磁珠免疫沉淀反应不需要离心，配合使用磁性分离架磁性分离，在 30 分钟内即可完成实验，因此可以在较短时间内轻松处理并获得较多样本的分析数据。　　自动化　　磁珠操作简便，因此可以使用自动化免疫沉淀设备，不仅节省了工作量和时间，还可以应用于高通量。　　当样品体积　　当样品体积> 2 mL，建议使用琼脂糖珠。当抗体成本较低并且想要纯化大量目的蛋白用于多种下游分析时，琼脂糖珠是最佳选择。

培养细胞就像养育BABY一样，要精心照料，用心呵护。最hao每天都去看看它们，满足它们所需要的物质需求，防止出现培养箱缺水、二氧化碳不足、温度不够等各种小意外，还要注意很多小细节，以免开展重复的实验导致不必要的人力物力浪费。那培养细胞都要注意哪些小细节呢？就让我们一起来看看吧！1.细胞生长的营养来源不同的细胞的培养基是不相同的，对于大多数肿瘤细胞来说，营养配方一般为：90%合成培养基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；为了防止污染，可以适时加1%双抗，抗生素的使用应为短期。Q：细胞培养基配方如何选择？A: 一般购买细胞时，针对不同的细胞株，会有详细的介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基，在胎牛血清的选择上也可以选用大品牌、来源可靠的胎牛血清，能提供较好的营养成分，以满足细胞株生长的需要。Q：如果细胞生长缓慢，需要增加血清比例吗？A：可以。2.细胞生长的环境舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。需要合适的器皿，不同形状、规格、用途多样的培养皿、培养瓶及培养板等，最终进入合适的恒温箱培养，如肿瘤细胞就需37℃，5%CO2的恒温箱中生长。Q：细胞培养板及培养皿或培养瓶如何选择？A：根据不同的应用选择不同的培养皿或容量板，如MTS用96孔板，细胞爬片用24孔，流式分析用6空等，具体应用可参见下表：而选择培养皿还是选择培养瓶，就细胞培养状态来说差别不大，主要是培养瓶的安全系数更高一些，数量也会大一些，但是成本也相对较高，因此没有特殊要求时，一般用培养皿即可。Q：血清是否要灭活处理，保证环境无菌？A：这取决于您的应用。灭活过程中，会导致血清中某些成分被破坏，如氨基酸，维生素，生长因子等。所以只有在您的实验对血清有特殊要求时，才会考虑对血清进行灭活处理。如您的实验对血清中的某种组分敏感，需要去除该组分。最常见的情况是需要去除血清中的补体蛋白，因为补体在机体中参与细胞杀伤，巨噬细胞和淋巴细胞活化，肥大细胞和血小板组胺释放，平滑肌收缩等过程，所以一般在免疫学相关研究中及肌细胞和干细胞的培养过程中需要对血清进行灭活处理。3.细胞复苏与冻存细胞复苏是指将冻存的细胞解冻之后再重新培养，细胞从冷冻停止生长状态恢复生长的过程。复苏过程如下图所示：Q：细胞复苏后，为什么很多难以贴壁？A：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。细胞冻存则是将细胞放在低温（-70℃~196℃）环境，降低细胞内的代谢活动，最da限度的保存细胞活力，以便长期存储。Q：目前细胞冻存液多采用的什么配方？A：目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。4.细胞的传代培养细胞在培养过程中不断增殖，培养皿空间有限，细胞过密生长就会受到抑制，影响细胞的状态，因此我们要把细胞中的一部分分到别的培养皿里，这样细胞才能生长的好。Q：细胞传代培养为什么要选择对数期细胞？A: 细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。一般细胞长到70%~80%左右就可以传代了。除了上述几个环节的关节问题外，细胞培养还有很多小问题如下：Q：培养基多久换一次？A: 正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。Q：血清应如何融解？A：从冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化过程中不时旋转混匀。充分融解后分装或平衡到室温后使用。Q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理？A：可以考虑如下操作：首-先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。Q：血清中出现絮状沉淀是否需要去除？如何去除？A：多种原因可能导致絮状沉淀的形成，最常见的原因之一是融化过程中，脂蛋白聚集所致。该现象一般不会影响产品质量。可以400g离心5分钟，取上清，然后过滤。根据需要选择合适的滤膜孔径，一般最chang用的是0.22um PES材质的滤膜。为避免滤膜阻塞，建议离心后取上清加入培养基内一起过滤而不是直接过滤血清。总之，细胞培养是后续实验的基石，留心各种细节问题，严守灭菌处理的程序，保护好自己养的细胞，这样才能快乐地进行后续的实验。

人体细胞以亿计数，每种细胞都有自己的任务。其中的免疫细胞与干细胞被很多人熟知，这也是徐徐经常科普的生物，干细胞与免疫细胞，这两种细胞都有啥不同呢？下面将通过这篇文章跟大家好好聊聊它们的区别。它们出身不一样，两位都是人体中的细胞，这出生还有啥不一样吗？干细胞：四处为家，遍布身体各处干细胞的的来源可以说非常多，在人体的各个组织中都能见到它的身影，科学家一开始在骨髓中发现了它们，接着在更多的研究中，大家发现人体的脂肪、血液、牙髓等地都含有干细胞。除了这些地方，像孕妈妈的胎盘里面也有干细胞。胎盘干细胞，顾名思义，就是存在于胎盘中的干细胞，这是一种非常难得的干细胞，一生也只会拥有一次。免疫细胞：诞生于骨髓，居住在免疫器官中，在人体的血液中“巡逻”免疫细胞在骨髓中出生，随后在胸腺里面进行训练、闯关，最终成为一名合格的免疫细胞，日夜“巡逻”于血液中，帮助身体对抗外敌。它们功能不一样一个健全的城市，里面的建设者与警察是不可或缺的角色，如果把人体比作一个城市，那干细胞与免疫细胞分别充当什么角色呢？建设者：将城市构建的整整有条，设施齐全。干细胞是人体的建设者。它们是构筑人类形态的原始细胞，通过分化源源不断地提供新生细胞，根据需要发育成人体内各种类型的组织和器官。当框架搭建好之后，后期的添砖加瓦等维修工作也是靠干细胞来支持。警察：在健全的城市中肩负保卫安全的职责，赶走破坏城市安全的坏蛋。免疫细胞是人体中的警察。种类不一的免疫细胞们共同组成了人体中的安保系统——免疫系统，它们四处巡逻，各司其职，共同组成了一只实力强大的警察队伍，当人体中出现危害身体的生物时，它们会尽其所长，通力合作杀死“坏人”，击退外敌。它们治疗方式不一样干细胞与免疫细胞都来自人体，它们在人体中都发挥着自己的作用，共同维护生命的存在。除了在体内维持身体健康以外，干细胞与免疫细胞也被科学家用来治疗多种临床疾病，细胞治疗也让很多疾病的治愈成为可能。区别干细胞与免疫细胞疗法，很简单的说法就是给身体做加法跟减法。干细胞：为健康做加法干细胞在医学界称为“万用细胞”，具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。身体哪个部位受损了，就有希望利用干细胞进行修复。例如，当身体发生严重外伤时，或者发生糖尿病、冠心病、老年痴呆、肝硬化等慢性病时，本质上是那些器官的细胞受到了损伤，这时就可以补充干细胞进行治疗。干细胞除了分化为特定功能的细胞，还可以分泌细胞因子、微囊泡等等具有生物活性物质，对受损组织的修复起到重要的作用。免疫细胞：为健康做减法免疫细胞是人体中的警察，他们的主要责任就是帮助身体消灭那些坏蛋，减少病原体对人体的侵害。例如当人体不幸罹患癌症时，科学家可以将血液中的免疫细胞提取出来进行培养与改装，把它们变成能力更强的免疫细胞，然后输入人体来消灭那些癌细胞。例如当前热门的CAR-T治疗、CAR-NK疗法便是这种原理。该疗法帮助多位癌症患者战胜病魔，走向健康。总结：干细胞与免疫细胞，尽管它们的出身、作用以及治疗方式都有所不同，但是这两种细胞在人体中都发挥着不可替代的作用，干细胞+免疫细胞，它们一起维护生命，保护人体的健康。

　　1 真菌毒素标准的发展　　真菌毒素是产毒真菌在粮食（或果蔬）的种植、收获、运输、储存过程中侵染粮食（或果蔬），并在适宜的生长条件下产生的次生代谢产物。真菌毒素污染谷物、饲料、果蔬，通过食物链危害人类健康和畜禽生产安全。因此，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）把真菌毒素列为食源性疾病的三大根源之首。我国是真菌毒素污染最严重的国家之一。　　目前，人们发现的真菌毒素有400多种。我国重点关注黄曲霉毒素（主要是Aflatoxin B1，AFB1和Aflatoxin M1，AFM1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（Ochratoxin A，OTA）、展青毒素（Patulin，Pat）、T-2毒素（T-2 toxin，T2）和伏马毒素（Fumonisins，FBs）等，这些毒素具有强毒性和高污染频率等特点，每种毒素的化学结构、生物毒性及适宜生长的基质不同；有些毒素会在饲用动物体内发生结构转化，以结构类似物存在动物源性食品中，危害人类健康。包括我国在内的许多国家都制定了真菌毒素的限量标准，这些限量标准是非关税壁垒的重要组成部分，也是保障我国食品安全和畜牧业健康发展的需要。　　黄曲霉毒素M1结构式　　从“十五”到“十二五”，国家重点关注农、兽药等外源性有毒有害物质污染，对真菌毒素的重视较晚，相关检测技术的研究起步也晚。国家标准委员会曾提出在标准制定中采用国际标准和国外先进技术、积极与国际接轨的要求，促使我国真菌毒素检测标准的制修订得到了充分的发展。一些标准制定借鉴了国外先进的检测技术，这在一定程度上为我国国有品牌树立了标杆和发展方向。　　经过十多年的发展，我国制定了一系列的真菌毒素相关标准，但还需要在检测技术、作用毒理、公共危害等领域得到加强的基础上逐步改进和丰富。研究人员曾对我国真菌毒素的检测标准进行探讨，但那些被讨论过的标准很多已被废止，侧面反映了近些年来我国真菌毒素标准制定的活跃和国家的重视。　　真菌毒素标准包括限量标准和检测标准。按照检测方法，可分为大型仪器方法和快速检测方法；按照适用范围，可分为食品类、原粮类和饲料类。本文对我国现行真菌毒素检测标准进行了梳理、阐述和分析，根据笔者对真菌毒素检测技术的了解，对各类标准涉及的技术进行思考和探讨，并从应用和市场角度提出了一些建议和意见，希望能为我国真菌毒素标准的发展提供有益的参考。　　2 我国现行的食品中真菌毒素的标准　　现行的食品安全国家限量标准GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》，属国家强制执行的标准。GB 2761包括限定的毒素种类、限量、食品类型及检验方法的标准。最早的GB 2761是1981年颁布实施的，先后经过四次修订。1981年版只规定了AFB1的限量和食品种类；2005年版增加了AFM1、DON、Pat；2011版又增加了OTA、ZEN。2017版没有增加毒素种类，但对食品类型的划分更加细致。该标准没有做出受饲料行业监管、污染原粮的FBs、T-2的限定。GB 2761的修订，反映了国家对食品真菌毒素污染的重视。下边将对每种真菌毒素的现行检测标准逐一阐述和分析：　　2.1 黄曲霉毒素（AF）　　AF是产毒真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是毒性最强的化学致癌物质之一。目前分离鉴定出的AF包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等18种。1993年国际癌症研究所将AF确定为一级人类致癌物。热带和亚热带地区农作物易遭受AF污染，居民肝癌发病率较高。　　GB 276l-2017规定了食品中AFB1/M1的最大限量标准及其存在的食品类别：谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、特殊膳食用食品等6大类18小类，限量范围为0.5~20 μg/kg，其中特殊膳食用食品的限量最低。AFM1限量的食品类别分为乳及乳制品、特殊膳食用食品等2大类8小类，统一限量0.5 μg/kg。GB 276l-2017的限量明显比GB 13078-2017《饲料卫生标准》严格，但低于欧盟食品的限量要求。　　AF的检测标准(见表1)包括国家标准(GB)、粮油行业标准(LS)、农业行业标准(NY)、出入境检验检疫行业标准(SN)、地方标准(DB)及食药局快检标准(KJ)等，涵盖了真菌毒素检测的所有方法。涉及的检测方法有柱后光化学衍生高效液相色谱法、超高效液相色谱法、免疫亲和柱净化-高效液相色谱法、同位素内标-液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法等仪器分析方法和胶体金定量/定性检测技术、酶联免疫吸附筛查法、时间分辩荧光定量检测技术、双流向酶联免疫法、薄层色谱法、免疫亲和层析净化荧光光度法等快检方法。　　一种作物可能被多种真菌毒素污染，因此对多种真菌毒素同时检测的技术很有实际应用价值。刚刚实施的LS/T 6133-2018《主要谷物中16种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法》采用稳定同位素内标液相色谱-串联质谱法，对谷物中多种毒素同时检测，该技术除了检测我国日常监管的毒素外，还可以检测其衍生物或结构类似物。　　快检方法不仅仅是对实验室方法的有益补充，根据2015年颁布的《食品安全法》，国家认可的快检方法可以作为执法依据。农业部、国家粮食局和国家食药总局先后颁布了8个免疫检测技术的标准。粮食行业标准率先将胶体金定量检测技术纳入标准中，之前胶体金免疫层析技术只是作为定性筛查的手段。2017年国家食药局颁布了三个真菌毒素快检标准，其中两个是AF的标准。这些都为免疫层析技术在农业、粮油、食药行业的应用提供了技术保障和标准支撑，同时也有效保障了这些领域AF的监管和检测。唯1写入GB或GB/T的免疫方法是市场应用剧减的酶联免疫，目前应用广泛的免疫层析技术只出现在行业标准中。　　全球有100多个国家和地区制订了食品和饲料中AF限量标准。我国对食品中AFB1和AFM1的最高允许量有严格规定，而美国、加拿大等国家主要对AF总量（B1+B2+G1+G2）做出限定。为了满足进出口的需求，SN标准是针对黄曲霉毒素总量的检测。　　黄曲霉毒素的检测标准覆盖了AF污染的大多数食品，2020年《中国药典》2351真菌毒素测定法，更是增加了药材、饮片及中药制剂中真菌毒素的检测。但是，一些过时检测技术的行业标准依然有效：如NY/T 1664-2008《牛乳中黄曲霉毒素的快速检测 双流向酶联免疫法》，该技术操作繁琐，专业性要求高，且只能定性检测，市面上已很难买到相应的检测试剂。薄层色谱法是一种前处理复杂、当前应用很少的检测技术，依然作为第五法写入GB 5009.22-2016中。编者建议废止不能适应市场需要的一些标准。　　2.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）　　脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称为呕吐毒素，广泛存在玉米、小麦、大麦等谷物中，是污染食物的主要真菌毒素。DON破坏人和动物免疫系统，具有一定的胚胎毒性和致畸性。世界各国都对食品中DON做出了限量要求。GB 276l-2017规定谷物及其制品中DON的限量是1000 μg/kg，与美国对小麦的限量标准一致。而欧盟标准规定的非常细致：未加工的硬质小麦、谷物和玉米中DON的限量为1750 μg/kg，未加工的谷物（除前述之外的谷物）的DON限量是1250 μg/kg，终端销售的谷物面粉、麸皮和胚芽的DON限量为750 μg/kg，谷物为原料的婴儿食品中DON限量不得超过200 μg/kg；日本规定小麦和小麦制品的DON限定量为1100 μg/kg。　　DON的检测标准有9个(见表2)，包括4个LS，1个KJ，3个GB和1个SN，其中GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》是GB 2761-2017指定的检验方法，可以检测谷物及其制品、酒类、酱油、醋中的DON及其乙酰化衍生物。与AF相比，DON检测标准的数量和方法明显减少，但DON作为粮食行业重点关注的毒素，LS占比非常大。DON的结构类似物雪腐镰刀菌烯醇(NIV)对我国中东部作物的污染较常见，但目前只有DB32/T 3205-2017《饲料中雪腐镰刀菌烯醇(NIV)的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》提出了它的检测方法。

　　1、获取方法不同，原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞；细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物；细胞系是原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。　　2、原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40--50代，这种传代细胞叫做细胞株；　　细胞株的遗传物质没有发生改变。当细胞传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。　　3、原代培养物经首次传代成功即称为细胞系，因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系；　　大多数二倍体细胞为有限细胞系。通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株，也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

　　微生物长期受到外界的影响，遗传性状必然发生某些变异。正是由于变异的存在才使得生物向前进化。然而由于突变的存在，菌种在培养或保藏过程中，可能会出现某些优良生产性状的劣化、遗传标记丢失、典型特征改变等现象，称为菌种衰退。比如苏云金芽孢杆菌由于菌种衰退，导致其新生的菌体芽孢和伴孢晶体都比较小；保藏的沙门氏菌鞭毛抗原丢失，导致H多价血清不凝固等。　　1. 菌种衰退原因　　菌种衰退的根本原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6~10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。此外，菌种衰退还有以下几种原因：　　1）表型延迟造成菌种衰退　　表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。　　2）质粒脱落导致菌种衰退　　质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响(如高温)，致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。　　3）连续传代　　连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变(尤其是负突变)的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。　　4）不适宜的培养和保藏条件　　不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。　　2. 防止菌种衰退措施　　采用已衰退菌种进行生产会影响生产效率，而把已衰退菌种作为阳性菌株进行检验，则会影响检验正确率。既然变异是不可避免的，那么我们应该如果避免菌种衰退呢？　　1）控制传代次数　　尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代减少到最低的水平以减少突变几率。传代次数越多，产生突变的几率就越大，菌种发生衰退的机会就越高。在实验室检验或者是生产实际中，应严格控制传代次数。中国药典当中规定，培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，以防止菌株因传代次数过多引起衰退影响检验。　　2）利用不同类型细胞进行接种传代　　放线菌，霉菌用菌丝进行移种比分生孢子容易衰退，因菌丝是对核且有异核存在，所以移种霉菌适宜采用孢子。　　3）良好的培养条件　　不良的培养条件会衰退细胞的出现，因此采用适宜的培养基进行菌种培养，以减少衰退几率　　4）采用有效的菌种保藏方法　　根据保存时间的长短，选择适宜的保存方法。　　传代培养法：复苏后的第一代放于4℃冰箱或室温保存，定期传代培养。保藏时间依微生物种类而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6个月转一次，普通细菌1个月转一次，假单胞菌2周转一次　　甘油冻存法：将复活后经过性能确认的菌株新鲜培养物（一般是第二代菌株），用0.85%的灭菌生理盐水（约1-2ml）洗斜面菌苔成菌悬液；将上述菌悬液吸取适量于灭菌管（冻存管）中（如，灭菌管容量为5ml，则取1.5ml菌液），加入等体积的40%灭菌甘油，混匀，密封。保藏温度为—20℃，一般可保存1-2年。　　瓷珠保存管保存：菌株保藏管内含特制的小珠（20-25颗）和特殊溶液，只需将培养好的菌株接入溶液中，摇匀成菌悬液，细胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，将保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。

我们在做技术支持时常常接到用户来电：“老师，我的细胞状态很差，不知道怎么了，您能帮我分析下原因吗？”细胞状态很差，常常出现的现象是：细胞边缘不清晰、细胞不饱满、折光性差、背景比较脏、黑点很多、细胞碎片多（细胞凋亡后的细胞碎片）、单个细胞内有空泡（凋亡）且空泡比较多；如果细胞出现老化，也就是细胞比较扁平、增殖减缓、细胞核体积增大、细胞突触变多，此时观察到的细胞状态也是不正常的。究其根本，细胞状态变差主要是由于两种原因：1 细胞营养条件不够2 细胞被污染了今天我们将深入分析影响细胞状态的这些原因。营养条件不够细胞营养条件不够时，就需要从培养基方面考虑。1. 血清由于血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养（血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等），这奠定了血清是细胞培养实验中蕞普遍的试剂的基础。市面上的牛血清产品名称虽然五花八门，但根据其不同的特性，追其根本，大致可分为以下四种。根据牛的取血年龄可以区分：胎牛血清（Foetal Bovine Serum，简称FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心脏穿刺采血得来的血清。国产胎牛血清（并无明确定义，但通常用此命名）指的是出生4-6小时，且未进行哺乳（unsuckled）进食的新生牛，有时还称作国产新生牛血清。新生牛血清（Newborn Calf Serum，简称NBCS，或称小牛血清）指的是出生14天-3个月进行取血的牛血清。成年牛血清（Adult Bovine Serum，简称ABS）指的是取血时牛龄通常超过12个月的牛血清。以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响，因为牛血多为畜牧业副产业，并未有专门为取血而养的牛。这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。常规来说，牛龄越小的牛血清，细胞培养效果越好。但是也需要根据自己培养的细胞类型来选择最合适的血清。同一血清不同批号内的成分和营养组成比例会不同，因为血清来源于动物，其组成成分有1000种左右，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。每个批号的组分和百分比含量都是不固定的，所以批间差异是存在的。因此在实验过程中，需要经过测试来找寻合适的血清批次。当实验需要更换血清时，细胞需要有一段适应期。因此，要根据自己的细胞种类进行合适的选择。2. 基础培养基培养细胞时，除了血清还需要添加基础培养基，混合成为完全培养基，基础培养基是成分确定且知其确切含量的，可以补充血清中缺乏的营养元素，基础培养基一般含有氨基酸、无机盐、维生素、含碳物质，蛋白和其他营养元素，每种成分对于细胞存活、代谢等功能都有不同影响，不同细胞系需要的成分含量也不同，因此市面上会存在各类培养基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基础培养基也需要根据自己培养的细胞种类进行更合适的选择。自行配制基础培养基时，需要注意是否需另外添加营养物或必需物至培养基中（如：碳酸氢钠）并调整pH值。使用不适合的培养基培养细胞，细胞仍可生长但特性会改变。培养基中常用的酚红（pH指示剂）本身有微弱雌激素作用，会刺激具有雌激素受器的细胞生长。如果您都是按照操规范保存培养基和培养细胞，那么我们继续考虑污染情况。细胞被污染污染情况通常从以下几部分考虑。通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、细菌、支原体、黑胶虫、病毒、细胞交叉污染等。这些污染都是有其自有特征的噢~1. 真菌污染这类微生物外观类似棉絮状的漂浮物，在显微镜下可观察到菌丝体，污染早期不会使培养基变黄。2. 酵母菌污染显微镜下常见成串的珠状物形态呈卵形，大约比细胞小5~10倍，当其进行出芽生殖时，会聚集成连体结构；爆发污染严重时，会造成培养基pH值改变，不易除去。3. 细菌污染培养基在短时间内变成黄色或白色浑浊，细胞停止生长甚至死亡；有些状况下培养基颜色改变不明显但细胞形态会变异（出现多角，多核状况）、细胞不附着，显微镜观察背景有大量黑点。4. 支原体污染支原体种类较多，常以寄生或腐生营养方式生长，广泛存在于环境之中，是细胞培养过程常见污染，经常来源于实验人员（支原体常见于人体皮肤、呼吸道、生殖道和消化道）、动物源血清及胰酶、消毒不完全的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通过一般标准的细胞培养过滤方法，0.22μm过滤膜。支原体增长速度相较于细菌比较缓慢，污染初期（轻微）培养基可能依然清澈不会变黄，所以轻微污染时不容易用常规方法发现（细胞外观观察或是DNA染色法）确认。支原体污染不但会缓慢改变细胞形态、增殖、基因表达、蛋白合成及代谢反应，它携带的DNA/RNA与蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌体实验结果偏差。5. 黑胶虫污染目前科学界对黑胶虫并无定论，认为是不明沉淀现象或多种未知生物污染现象的通称。在高倍率显微镜头下，可观察到各式形状的小黑点（卵圆状、球状、杆状等）、活跃的布朗运动及明显游动现象，部分黑胶虫具有细胞毒性，可引起细胞生长迟缓或裂解凋亡。6. 病毒污染病毒感染可能来自宿主动物细胞或病人，病毒感染及传播具有细胞专一性，在细胞培养污染物中是相对较难检测的。然而一旦细胞遭受污染后显微镜下能明显观察到细胞碎片增多、肿大、圆缩、脱落等病态变形，严重时会在单层细胞上观察到局部破损空斑。7. 细胞交叉污染曾有文献报道统计，目前使用的细胞株大约有15~20%不是科学家们所认为的细胞，而在生物医药领域中，细胞来源和细胞株身份鉴定检测观念普遍缺乏。细胞株的交叉污染，常在不经意的实验疏失（不同细胞株分盘时，共享一瓶培养基、枪头、移液管忘记更换，而造成不同细胞株之间的混合污染，或是实验操作人员录入错误细胞株名称，继代时的培养皿，冷冻细胞时的冻存管）中发生，而造成错误后续数据搜集；目前大部分的科学期刊都已有“细胞相关实验论文发表前，均需附上细胞鉴定报告”的规定，以此保证数据来源的正确性。目前常用的细胞身份验证的方式包括：短串联重复序列（STR）、同功酶分析、染色体组分型、扩增片段长度多态性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前国际细胞库（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于细胞株身份鉴定方法。细胞老化了无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。老化细胞不会立即死亡，但其基因表达会发生变化，如果细胞老化现象严重，建议从种子库或工作库重新复苏细胞。

目前，针对分子生物学实验有多种技术方法，那么我们该如何判断选择哪种方法适合呢？我们需要去了解实验方法的特性。无非就是用某种特定的刺激物（如细胞活素）去刺激一些细胞或组织，让它们high起来，然后分析细胞对这些外源刺激物的反应，检测细胞内哪条信号通路被激活或失活，或者什么蛋白被分泌出来。每一种实验方法都有它的特性，下面就以下几种方法做介绍：什么时候用免疫印迹实验？免疫印迹实验（Western Blot，WB）可检测信号通路中某种蛋白质的特性、表达和分布，分析容量大、敏感度高、特异性强。建立蛋白质的个人档案但至于蛋白-蛋白相互作用则要用另一种更复杂的方法，即免疫共沉淀法（Co-immunoprecipitation，Co-IP），它接近细胞内的生理情况，是以成为经典方法。什么时候用表面等离子体共振？表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）除了研究蛋白-蛋白相互作用（例如受体-配体相互作用），还有可研究小分子-蛋白或细胞-蛋白的相互作用。这种方法不需要标记蛋白（荧光标记或同位素标记），还可以实时定量分析这些相互作用的亲和力、热力学、动力学特性。SPR是分析动力学和亲和力的金标准。什么时候用电泳迁移率实验？电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）最初用于检测DNA结合蛋白与相应的DNA序列结合的情况，可做定性和定量分析，包括细胞核中的转录因子（如NF-kB ）的活性等等，现在也常用于研究RNA结合蛋白和相应的RNA序列相互作用。这些分析用酶联免疫吸附实验（EenzymeLinked ImmunosorbentAssay，ELISA）也可以做，原理差不多。什么时候用聚合酶链式反应？PCR（Polymerase Chain Reaction）或Real Time PCR可以把特定的DNA序列大幅扩增，便于检测活性基因的表达情况。而且PCR用途很广。什么时候用酶联免疫吸附剂测定？酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）如果要看看细胞外如何，比如细胞培养上清液或体液中的某种蛋白质分泌情况，则通常选用ELISA，从而获知相应基因的活性。

1.提高胶回收量的技巧1）增加电泳时的上样量。2） 电泳缓冲液用新鲜配制的。3） 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。4） 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。5） 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。6） 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子 更好 的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。7） 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟)，以使乙醇充分挥发。8）最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在 膜上的DNA。9） 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。10）将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。2. PCR 产物回收的详细方法和步骤1）普通胶回收如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚/lv仿抽提干净，乙醇沉淀 即可。2）从低熔点凝胶回收DNA纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA )，置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚(TE饱和，TE封在上层，取下层酚)，轻轻混匀(不用混 匀)，12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将 纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用(可用于目的基因结构分析，探针 制备等)。3）扩增特异性好的PCR回收如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/lv仿抽提一次，lv仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。

　　总的来说，对于任何滴定分析，都要首先了解什么样的精度要求才是有意义的并且是必须的，之后如果发现一些结果还是超出了误差范围，你就要从以下几点去找原因：　　1.待测样品是否在整个样品中具有代表性?　　换句话说，你应该从取样时就开始寻找可能的错误。“分析结果仅代表实际被分析的样品的结果。”也许在实际测量前，样品可能来自于一个没有混合均匀的容器。亦或在取样后，样品暴露在不同的环境条件下。例如样品在滴定前放置不同的时间段，就会吸收不同量的空气中的二氧化碳。在样品转换器上用敞开式的滴定容器时，就应考虑到这一点。因此我们建议先将滴定容器密闭起来，再在滴定开始之前，用一种特殊装置将其打开(Cover- UpTM)，就像Rondo样品转换器上的那种。　　2. 用多少样品来做分析?对于极少量的样品的分析，天平的性能就至关重要。　　那么进行一次最小称样量的测试就可以了解天平是否符合要求。　　3. 如果是滴定仪自身的问题，可从以下几个方面来做检查：　　a) 液管的末端是否有虹吸滴定头，并且工作是否正常?该滴定头是为了防止滴定剂扩散到样品中去。如果失去滴定头，滴定剂就会流入到滴定池中，并和样品反应。但这部分的消耗量是不被计算在内的，因此就能导致比较大的标准偏差。　　b) 滴定管应检查是否漏气。如果接头没有拧紧或阀的工作不正常，就可能出现漏液。在这种情况下，并不是所有滴定仪馈送的滴定剂都加入到样品中去。由于这种影响不具有重复性，就会导致较大的标准偏差。　　c) 滴定管中存在有气泡。这通常是由滴定剂中所溶解的气体如CO2、SO2或O2造成的。因此滴定剂在使用前应有个脱气过程，如放置在超声波水浴中。滴定瓶托架作为滴定仪的一个附件可以将滴定瓶提升至与滴定管一样的高度，这就确保在充满滴定管时不会出现负压而造成脱气。卡尔菲休滴定所用试剂由于溶解有SO2，对此极为敏感，因此，在DL31/DL38卡尔菲休滴定仪中，可以适当降低其充液速度。

　　对照品规范有什么要求？对照品有什么要求？国家药品规范品、对照品系指国家药品规范中用于鉴别、检查、含量测定、杂质和有关物质检查等标准物质。用来检查药品质量的一种特殊的专用量具；丈量药品质量的基准；也是做为校正测试仪器与方法的物质规范；药品检验中，确定药品真伪优劣的对照，控制药品质量bi不可少的工具。　　对照品系指用于生物制品理化等方面测定的特定物质。稳定性较差的可加不含对测定有干扰物质的适宜的稳定剂。对照品由国家药品检定机构审查认可，对照品应尽可能与制品原液配方一致。其规范应不低于制品的质量规范。对照品：指用于鉴别、检查、含量测定的规范物质，由国务院药品监督管理部门zhi定的单位制备、标定和供应。规范品系指用于生物测定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的规范物质，一国际规范品进行标定；对照品出另有规定外，按干燥进行计算后使用。对照品系指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的规范物质.规范品系指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的规范物质，以效价单位(U表示。还是感觉不甚明了否规范品只用于生物方面？否化学方面只能称对照品？规范品有什么要求？对照品有什么要求？国家药品规范品、对照品系指国家药品规范中用于鉴别、检查、含量测定、杂质和有关物质检查等标准物质，国家药品规范不可分割的组成局部。国家药品规范物质是国家药品规范的物质基础，用来检查药品质量的一种特殊的专用量具；丈量药品质量的基准；也是做为校正测试仪器与方法的物质规范；药品检验中，确定药品真伪优劣的对照，控制药品质量bi不可少的工具。规范品、对照品：指用于鉴别、检查、含量测定的规范物质，均由国务院药品监督管理部门zhi定的单位制备、标定和供应。规范品系指用于生物测定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的规范物质，一国际规范品进行标定；对照品出另有规定外，按干燥进行计算后使用。规范品和对照品均附有使用说明书，质量要求，有效期和装量等。　　生物制品规范物质系指用于生物制品效价、活性或含量测定的或其特性鉴别、检查的生物规范品或生物参考物质。2规范物质的种类 生物制品规范物质分为二类。国家生物规范品 系指用国际规范品标定的或我国自行研制的尚无国际生物规范品者)用于定量测定某一制品效价或毒性的规范物质，其生物活性以国际单位（IU或以单位（U表示。国家生物参考品 系指用国际参考品标定的或我国自行研制的尚无国际参考品者)用于微生物(或其产物)定性鉴定或疾病诊断的生物试剂、生物资料或特异性抗血清；或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考物质，如用于麻疹活疫苗滴度或类毒素絮状单位测定的参考品，其效价以特定活性单位表示，不以（IU表示。　　其制备与标定应符合“生物制品国家规范物质制备和标定规程”要求，国家规范品及生物参考品系指用于鉴别、检查含量或效价测定的规范物质。并由国务院药品监督管理部门zhi定的机构分发。企业工作规范品或参考品必需经国家规范品或参考品标化后方能使用。对照品系指用于生物制品理化等方面测定的特定物质，由生产单位采用与制品生产工艺相同的方法制备。对照品应尽可能与制品原液配方一致，稳定性较差的可加不含对测定有干扰物质的适宜的稳定剂。对照品由国家药品检定机构审查认可，其规范应不低于制品的质量规范。规范品、对照品：指用于鉴别、检查、含量测定的规范物质，均由国务院药品监督管理部门zhi定的单位制备、标定和供应。规范品系指用于生物测定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的规范物质，一国际规范品进行标定；对照品出另有规定外，按干燥进行计算后使用。规范品和对照品均附有使用说明书，质量要求，有效期和装量等。1定义生物制品规范物质系指用于生物制品效价、活性或含量测定的或其特性鉴别、检查的生物规范品或生物参考物质。　　对照品系指用于生物制品理化等方面测定的特定物质，由生产单位采用与制品生产工艺相同的方法制备。对照品应尽可能与制品原液配方一致，稳定性较差的，可加不含对测定有干扰物质的适宜的稳定剂。对照品由国家药品检定机构审查认可，其标准应不低于制品的质量标准。　　对照品是国家药品标准不可分割的组成部分。国家 药品标准物质是国家药品标准的物质基础，它是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具；是测量药品质量的基准；也是做为校正测试仪器与方法的物质标准；在药品检验中，它是确定药品真伪优劣的对照，是控制药品质量bi不可少的工具。　　药典或者其它标准品、对照品的提供机构一般不会明确规定标准品的有效期，特别是对开封的标准品或配制的标准溶液使用期限，原则上来讲，不推荐重复使用标准溶液，如果需要重复使用同一份标准溶液，使用单位应对其稳定性和使用效期进行研究。在进行标准品溶液的稳定性研究之前，应起草该标准品溶液稳定性研究草案，并获得公司质量管理部门的批准。稳定性研究草案里应明确标准品溶液的配制程序、储存条件、稳定性研究方案、稳定性结果的记录和判断程序。　　对于标准品的有效性的判断，可以根据不同时间点的标准品检查结果，比如HPLC的峰面积、UV的吸收值或直TLC展开图中斑点大小和颜色深浅等。稳定性研究结束后，需要对实验结果进行总结、分析，根据评估给出溶液的内部推荐效期，同时征求质量管理部门的意见并获得其批准。批准后的标准品溶液效期可用于实验室内部对标准品溶液的使用。　　对照品系指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，而标准品系指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。文献中常将2种概念混淆，认为对照品就是标准品，是1种物质2种提法而已，造成错误的原因，可能是有的药品既有对照品，又有标准品。例如，当用微生物法测定头孢克罗效价时，用头孢克罗标准品，用HPLC或UV法测定时，则用对照品；非那西丁当用作熔点校准物质时，用熔点标准品，测定含量时，用对照品。即使是同一种物质的标准品和对照品，它们的规格、标定方法以及用途都可能是不同的。

1.  为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？ 答：可以从这几个方面一一考虑： （1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。 （2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。 （3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。 （4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。 （5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。 （6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。 2.  为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？ 答：可以从这几个方面考虑： （1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。 （2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。 （3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。 （4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。 （5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。 （6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。 （7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。 （8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。 （9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。 3.  为什么融合后得不到阳性克隆？ 答：可能的原因： （1）动物未免疫成功就进行了融合。具体解决方法参照本页面第1个问题。 （2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。具体解决方法，请参照本页面第2个问题。 （3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待商榷。 （4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简单的例子，如果需要制备抗BSA 的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。 （5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA实验的讲解与讨论。 4.  为什么我的细胞生长很慢？ 答：可能的原因： （1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用zhi名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。 （2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。 （3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面第二个问题。 （4）其它问题，可以参考本页面第二个问题。 5.  我的克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？ 答：首先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性的办法。一般可以从这几个方面加以注意： （1）永远保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了，除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。 （2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。 （3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。 （4）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。 （5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。 6.  为什么我做亚克隆后长不出克隆来？ 答：亚克隆失败的原因和克隆不长的原因类似，但是除此之外，也还有一些独特的原因。 （1）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。 （2)亚克隆时，没有按照正确的数量取出细胞，在本站有关亚克隆操作的页面上提到过，亚克隆的过程服从泊松分布，如果取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能出现长不出克隆的结果。 （3）未添加饲养层细胞。单个细胞在完全培养基中极难培养，如果不添加饲养层细胞，则它们很可能很快就死亡，最终就长不出克隆。 （4）使用的HAT中HT失效或A的浓度过高，或者未添加HT。 虽然HT对杂交瘤的生长并不是必须的，但是HT确实可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。 （5）使用无血清培养基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培养基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的实验的时候，可能会选用无血清培养基来培养杂交瘤，但是需要注意的是，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。最hao的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出后再把培养基彻底更换为无血清培养基。 7.  为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？ 答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。 对于冻存过程，需要注意： （1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目前认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培养基，不管是哪一种，冻存保护剂DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞最终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。如果使用第二个配方，注意一定要用养过杂交瘤的培养基，而尽量不要用一般的完全培养基，而且一定是配养需要冻存的那一株的培养基。文献中也有提到用甘油作为冻存保护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。如果新手确实对这个没把握，市场上也有商品化的冻存液，买回来按照说明书操作就OK了。 （2）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在DMSO存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。 （3）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1 ℃的速度下降冻存细胞是蕞理想的。如果条件简易，可以把细胞放在4 ℃半小时左右，然后再在-20 ℃放置1-2小时，最后转入-80 ℃放置过夜，最终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。现在市场上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80 ℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。 （4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很容易进入冻存管。这一点很多人都没有注意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，最终可能造成细胞污染。 （5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。 对于复苏过程，需要注意： （1）快速。为了防止升温中细胞内产生冰晶，强烈建议加快融化过程。一般都要用用足够体积的37 ℃热水复苏，并不断晃动冻存管。 （2）复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。 （3）有的人复苏细胞时，没有去掉冻存液，这样就把冻存液里的DMSO带到了新的培养体系里，容易对细胞造成毒害，因此强烈建议将融化的细胞离心后去掉冻存液，然后用新的完全培养基重悬，再接种到新的容器内培养。 8.  为什么我的细胞总是污染？如何可以救活污染的细胞？ 答：养细胞出现污染，几乎是每个细胞培养技术员容易出现的问题。要防止细胞污染，无非就是保证培养环境无污染，保证所用的所有试剂都无污染源，同时提高操作时的警惕性，这些基本的知识这里就不再废话了。下面讲一讲如何挽救一株已经被污染的细胞株。 （1）体外用抗生素消灭。一般来说，一旦发现细胞被微生物污染，应该马上进行处理，也许还有一线挽救的机会。 但是这种挽救不是盲目的，首先应该决断是哪一类生物造成的污染。细胞的污染大致可以分三类：细菌污染、真菌污染和支原体污染。 在显微镜下仔细观察，这三种微生物污染区别还是比较明显的：如果有大量运动的微生物，且形态较大，轮廓清晰可见，呈较大幅度运动，并且培养基在短时间内变酸，则很可能是细菌污染；如果在显微镜下观察有典型的斑状或丝状微生物（注意与塑料屑、棉花屑和琉璃纤维区别开），基本上看不到明显的运动，则很可能是真菌污染；如果看不到明显的微生物，并且培养基没有明显的颜色上的变化，而细胞状态很差，细胞边缘极其不光滑，而且细胞又莫名其妙地死亡或生长极其缓慢，则有可能为支原体污染，但不能下明确的结论，如果非常需要知道是否为支原体污染可以使用相关的试剂盒进行检测。 对于细菌或真菌的污染，可以先把细胞收集起来，用干净的培养基洗涤离心，交替进行几次，再把洗干净的细胞放在新的培养板或培养瓶等容器内，加高浓度的抗生素培养，同时强烈建议加入小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层，以辅助消除微生物。对于细菌污染，可以把青霉素的浓度提高至10倍左右，链霉素浓度提高至5-10 倍，也可以用10倍浓度的卡那霉素替代链霉素。 对于真菌污染，可以在培养基中加入约5 ug/ml的咪康唑（注射用达克宁）抑制。 对于这两种情况的污染，采用上述方法处理后，待细胞稍有好转，并且没有发现更大规模的污染时，需要尽快重复上面的处理步骤。需要注意的是，此时细胞生长受抗生素的影响比较大故而生长很慢。如果多次传代均未发现污染复发，可以慢慢降低抗生素浓度直至常规浓度，确定是否完全根除污染。最好进行一次有限稀释的亚克隆操作，以获得更加纯净的细胞株。 而对于支原体污染，则比较麻烦，一般的抗生素是很难解决的，对于轻度的污染，可以试试使用60 ug/ml的泰乐菌素和10 ug/ml左右的环丙沙星交替处理。如果得到明显的缓解，建议马上做亚克隆操作，看看是否得到污染根除的细胞株，如果此方法无效，则不能单纯利用抗生素来解决污染问题。 （2）体内法。这个办法很简单，原理就是动物体有强大的免疫系统，一般的微生物都可以被动物体消灭。具体操作和制备腹水的方法完全一样，即先用IFA或石蜡制敏小鼠，数天后腹腔注射污染的杂交瘤。如果情况紧急，致敏当天注射杂交瘤也行。一般十天后小鼠产生腹水，在超净台无菌采出腹水，其中即含有大量的杂交瘤细胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射杂交瘤，十几天后可以看到实体瘤形成，也可以在超净台上无菌采摘，然后放回培养板或培养瓶等容器内培养。如果被污染的细胞很少，比如说在96孔板上就被污染了，这时候不能进行腹腔注射，也不要进行皮下注射，否则细胞很容易被老鼠的免疫系统攻击而死亡的，蕞好的办法是采用脾内注射的方法进行，同时在腹腔内用IFA或石蜡油致敏，十几天后，同样可以形成腹水，其中即含有干净的杂交瘤细胞。 如果担心小鼠会受到微生物感染，可以在培养基中先加入高浓度的抗生素，然后连同抗生素一起注射到小鼠体内。 如果确定细胞污染极其严重，并且细胞已大面积死亡，建议放弃，迅速做好环境清洁工作，对细胞操作间作彻底消毒，重新做融合而获得新的细胞株，不可因小失大造成其它的细胞也被污染。 9.  为什么我的杂交瘤细胞不能制备腹水或者制备的腹水中没的抗体或腹水没有效价？ 答： 不能制备腹水的原因大部份是人为的原因： （1）致敏不正确，例如使用了不正确的致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久。 （2）杂交瘤的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。 （3）接种的杂交瘤细胞数量太少或者细胞状态不好。一般不应少于10万个细胞，建议在100万个细胞左右为宜。 （4）制备腹水小鼠的种系与参与融合的细胞来源的动物种系相差太远，以至制备腹水的小鼠对杂交瘤有强大的免疫反应将其杀死，建议更换小鼠品系重新接种。 对于腹水没有效价，可能的原因： （1）制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。 （2）致敏小鼠时采用了错误的致敏剂，如使用了弗氏完全佐剂，这时即使不打杂交瘤，小鼠也会产生腹水。 （3)极其罕见的情况，就是此杂交瘤生产的抗体可以与小鼠体内的分子相互作用，于是杂交瘤产生的抗体被小鼠的相关蛋白中和，这种情况下，小鼠的身体可能会出现明显的异常。 （4）检测腹水效价的实验方案有问题，或者腹水稀释比过大。10.  免疫失败的可能原因及应采取的措施答：有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。（2） 抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。（3） 制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。（4） 所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。（5） 免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。（6） 动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。11.  制备单克隆抗体影响因素、失败原因分析答：由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。 其主要失败原因和影响因素有：（1）污染： 包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。（2）融合后杂交瘤不生长， 在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：PEG有毒性或作用时间过长。牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了支原体。HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。 （3）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体： 融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而 抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要：不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。 （4）杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

微生物体积很小，测定个体生长很困难，也没有太大意义。通常微生物的生长是指群体的生长，微生物生长量是指在一定条件下微生物经过培养后群体的生长量。测定生长量的方法有许多种，可以直接测量培养物的体积或质量，也可以通过测量细胞组分含量或浊度等指标来间接获得微生物的量。(一)直接法1.测体积它是一种较为粗放的方法，通常用于初步的测定。操作方法如下：将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。2.称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%-20%,一个细菌一般重10-12~10-13g。离心法：将待测培养液离心，再用清水洗涤离心1~5次后干燥，可用105℃、100℃或红外线烘干，也可在较低的温度(-80℃或-40℃)下进行真空干燥，然后称干重。过滤法：如为丝状真菌可用滤纸过滤，如为细菌可用乙酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空干燥(-40℃以下),称干重。一般在液体培养基中，细菌的浓度的数量级大约为108CFU/mL, 100 mL培养物可获得10 mg ~300 mg干重的细菌。(二)间接法1.代谢指标法微生物生长过程中伴随着的物质合成与利用，因此很多代谢指标与细菌生长量相关，这些指标可用作生长测定的相对值。大多数细菌的含氮量约为干重的12.5% ,酵母菌约为7.5% ,霉菌约为6.0%.总氮在细胞粗蛋白中的含量也较为稳定。因此，培养物含氮量可以近似反应生长量。含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样品，操作过程较繁锁。微生物新陈代谢过程中离不开碳元素。测定培养物含碳量的方法如下：将培养物混入1ml水或无机缓冲液中，用2 mL2%重铬酸钾溶液在100 ℃下加热30 min,冷却后，加水稀释至5 mL,在580 nm波长下测定光密度值(用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线),即可推算出生长量。微生物细胞内的其他成分，如磷、DNA、RNA、ATP和N-乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产二氧化碳(用标记葡萄糖作基质)、耗氧、黏度和产热等指标，也都可以用于生长量的测定。2.比浊法微生物在液体培养基中生长，由于个体体积和细胞数量的增加，引起培养物混浊度的增高。通过测定培养物的浊度可以近似推断其生长量。比浊法通常采用McFarland比浊管，用不同浓度的氯化钡与稀硫酸配制成的10支试管，其中形成的硫酸钡有10个浓度梯度，分别对应10个相对的细菌浓度(预先用相应的细菌测定)。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。如要精确测定培养物的浊度，则需要用分光光度计进行。在可见光的450 nm -650 nm波长内均可测定。

金黄色葡萄球菌是一种球状细菌，在显微镜下看，它们聚集成簇，像葡萄一样。不管有没有氧气的存在，它们都可以生长。在良好的营养环境中，它们会长成黄色的“菌落”。这种细菌在自然界广泛存在，人和动物是它们的优良居所。在健康人中，鼻子、喉和手是最适合它们生长的地方。此外，如果有伤口，伤口处也容易大量滋生。有朋友问：“是否食物中一点都不能有金黄色葡萄球菌呀?金黄色葡萄球菌自身并不是那么可怕，因为它们对温度很敏感，在高温下相当脆弱。超过46℃，就有细菌hold不住了;在55℃下，它们中的90%“撑不过”3分钟;煮沸的水对它们的杀伤力堪称“秒杀”。虽然金黄色葡萄球菌很脆弱，但是它们的毒素极为顽强。它生前分泌的毒素，会引起恶心、呕吐、胃痉挛和腹泻等症状。这种中毒是急性的，一般在1~6小时之内发作，最快的甚至半小时就出现症状。大多数症状不会严重，在两三天内会恢复健康。因为细菌本身很容易杀灭，而真正的罪魁祸首毒素却能够经受酷热考验。所以，如果食品中金黄色葡萄球菌的检测结果高，可以“充分”判定食物受到了污染。但是，检测结果低却不能说明该食物就一定没有问题。比如说，如果一种食物曾经被该细菌大量污染，然后又经过加热，那么检测结果将是“细菌数合格”，但其中同样可能存在足以致病的毒素。最容易感染金黄色葡萄球菌的食物有：肉类、禽类、蛋类、水产类、奶制品等等。国家标准如何规定！消费者都希望食物“绝对安全”，对于“可能危害”的东西“零容忍”。但是这并不现实。《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》GB 29921-2013明确规定了预包装食品中金黄色葡萄球菌的限量。肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆类制品、巧克力类及可可制品、即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品这几种预包装食品中金黄色葡萄球菌的限量规定是：同一批次产品采集5个样品分别检测，最多可以允许1个样品超出每克或者每毫升100CFU，但不能超过1000CFU。即食调味品的范围则显得略宽容些——最多可以允许2个样品超出每克或者每毫升100 CFU，但不能超过10000 CFU。(CFU是菌落形成单位。菌落的个数，传统上叫“个”。但是，一个菌落一般由一簇细菌(并不是一个细菌)形成，所以更准确的叫法是菌落形成单位CFU。)对于其他食品中的规定不尽相同，不过也都允许一定量的存在。金黄色葡萄球菌本来在自然界、尤其是人体中广泛存在，要实现“零容忍”将会使生产成本大大提高。消费者觉得成本高低是厂家的事情，似乎跟自己无关。但生产成本的增加，最终还是要由消费者来买单。如何远离金黄色葡萄球菌的污染金黄色葡萄球菌的污染，不仅仅会发生在工业食品中，自己制备的食物同样有污染的风险，很可能只是因为感染症状并不严重，难以引起关注，感染的人一般也不会去查明原因。建议避免金黄色葡萄球菌感染：一是制备食物之前用肥皂和水充分洗手，尤其是指甲内;二是鼻子或者眼睛感染时不要去制备食物;三是手或者手腕有伤口时不要制备食物，也不要给其他人端送食物;四是保持厨房与就餐区域的清洁卫生;五是如果食物要保存2小时以上，要么在60℃以上保温，要么在4℃以下冷藏。六是做好的食物装在宽而浅的容器中尽快冷藏。

一、无菌操作要求1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。3、无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法1、灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。2、装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3、设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）.②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。4、灭菌温度与时间（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。（2）压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间（二）间歇灭菌方法1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性。4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。四、有毒有菌污物处理要求微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在zhi定地点，待统一进行高压灭菌。2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30min高压灭菌。4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、kou罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。五、培养基制备要求培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。2、PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。7、目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。六、样品采集及处理要求1、所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消du药物灭菌，更不能含有此类消du药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。（3）按规定采样数量不足者。对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。七、记录和报告的要求1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

样品取样的要求1）在取样之前应确认货、证是否相符。2）取样过程中应避免与水等环境的不良因素影响，防止样品被污染。3）取样用具（如注射器、采血管、试管、探子、铲子、匙、取样器、剪子、样品袋等）必须是经过灭菌的。4）对采集的样品一般要求随机取样。若怀疑最有可能受病原体污染或者带有病原体的样品，可以进行选择取样。5）根据样品种类（如盒装、袋装、瓶装和罐装），应取完整密封的样品。如果样品很大，则需用无菌取样器取样；若样品是粉末，应边取边混合；若样品是液体的，通过振摇即可混匀；若样品是冷冻的，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冷盒内或低温冰箱内保存），而非冷冻动物产品须保持在0℃~5℃中保存。6）取样前或取样后应在盛装样品的容器或样品袋上立即贴上标签，每件样品必须标记清除（包括品名、来源、数量、取样地点、取样人及取样日期）。7）获取有关取样产品的信息：如样品名称、批量大小、包装类型、包装容器体积、生产线、产品编号或控制号、批量号、标签内容、包装破损状况、产品存放地点或建筑物的基本情况等。8）当客户对所规定的取样程序有偏离、添加或删节的要求时，应详细记录这些要求和相关的取样资料，并记入包含检测结果的所有文件中，同时告知相关人员。9）当取样作为检测一部分时，实验室应有程序记录与取样有关的资料和操作。这些纪录应包括所用的取样程序、取样人的识别、环境条件（如果相关）、必要时有抽样地点的图示或其他等效方法，如果合适，还应包括取样程序所依据的统计方法。 食品微生物学的取样点食品微生物的取样计划中常包括以下取样点：原料、生产线（半成品、环境）、成品、库存样品、零售商店、或批发市场、进口或出口口岸。原料的取样包括食品生产所用的原始材料、添加剂、辅助材料及生产用水等。生产线样品是指食品生产过程中不同加工环节所取的样品，包括半成品、加工台面、与被加工食品接触的仪器面以及操作器具等。对生产线样品的采集能够确定细菌污染的来源，可用于食品加工企业对产品加工过程卫生状况的了解和控制，同时能够用于特定产品生产环节关键控制点的确定和HACCP的验证工作。另外还可以配合生产加工，在生产前后或生产过程中对环境样品（如地面、墙壁、天花板以及空气等）取样进行检验，以检测加工环境的卫生状况。库存样品的取样检验可以测定产品在保质期内微生物的变化情况，同时也可以间接对产品的保质期是否合理进行验证。零售商店或批发市场的样品的检测结果，能够反映产品在流通过程中微生物的变化情况，能够对改进产品的加工工艺起到反馈作用。 进口或出口样品通常是按照进出口商所签订的合同进行取样和检测的。但要特别注意的事，进出口食品的微生物指标除满足进出口合同或信用证条款的要求外，还必须符合进口国的相关法律规定，如世界上很多国家禁止含有致病菌的食品进口。 不同样品的取样方法 （1）包装食品① 直接食用的小包装食品： 尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。② 桶装或大容器包装的液体食品： 取样前应摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；取样时应将取样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品，装入灭菌容器的量不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样品摇匀；取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；如为非冷藏易腐食品，应迅速将所取样品冷却至0℃~4℃。③ 桶装或大容器包装的固体食品：每份样品应用灭菌取样器从几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内；注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。④ 桶装或大容器包装的冷冻食品：对于大块冷冻食品，应从几个不同部位用灭菌工具取样，使样品具有充分的代表性；在将样品送达实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。（2）生产过程中的取样划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性；如用固定在贮液桶或流水作业线上的取样龙头取样时，应事先将龙头消毒；当用自动取样器取不需要冷却的粉状或固定食品时，必须履行相应的管理办法，保证产品的代表性不被人为地破坏。（3）液体样品通常情况下，液态食品较容易获得代表性样品。液态食品（如牛奶、奶昔、糖浆）一般盛放在大罐中，取样时，可连续或间歇搅拌（可使用灭菌的长柄勺搅拌），对于较小的容器，可在取样前将液体上下颠倒，使其完全混匀。较大的样品（100ml~500ml）要放在已灭菌的容器中送往实验室。实验室在取样检测之前应将液体再彻底混匀一次。 对于牛奶、葡萄酒、植物油等，常采用虹吸法（或用长形吸管）按不同深度分层取样，并混匀。如样品粘稠或含有固体悬浮物或不均匀液体应充分搅匀后，方可取样。（4）固体样品依所取样品材料的不同，所使用的工具也不同。固态样品常用的取样工具有灭菌的解剖刀、勺子、软木钻、锯子和钳子等。面粉或奶粉等易于混匀的食品，其成品质量均匀、稳定，可以抽取小样品（如100g）检测。但散装样品必须从多个点取大样，且每个样品都要单独处理，在检测前要彻底混匀，并从中取一份样品进行检测。肉类、鱼类或类似的食品既要在表皮取样又要在深层取样。深层取样时要小心不要被表面污染。有些食品，如鲜肉或熟肉可用灭菌的解剖刀和钳子取样；冷冻食品可在未解冻的状态下可用锯子、木钻或电钻（一般斜角钻入）等获取深层样品；全蛋粉等粉末状样品取样时，可用灭菌的取样器斜角插入箱底，样品填满取样器后提出箱外，再用灭菌小勺从上、中、下部位取样。（5）表面取样通过惰性载体可以将表面样品上的微生物转移到合适的培养基中进行微生物的检验，这种惰性载体既不能引起微生物死亡，也不应使其增殖。这样的载体包括清水、拭子、胶带等。取样后，要使微生物长期保存在载体上，既不死亡又不增殖十分困难，所以应尽早的将微生物转接到适当的培养基中。转移前耽误的时间越长，品质评价的可靠性就越差。表面取样技术只能直接转移菌体，不能做系列稀释，只有在菌体数量较少时才适用。其最大优点是检测时不破坏食品样品。几种较常见的表面取样技术 ：①拭子法进行定量检测时，必须先用灭菌取样框（塑料或不锈钢等）确定被测试的区域。棉花-羊毛拭子：用干燥的棉花-羊毛缠在长4cm，直径1cm~1.5cm的木棒或不锈钢丝上做成棉花-羊毛拭子。然后将拭子放在试管中，盖上盖子后灭菌。取样时先将拭子在稀释液中浸湿，然后在待测样品的表面缓慢旋转拭子平行用力涂抹两次。涂抹的过程中应保证拭子在取样框内。取样后拭子重新放回装有10ml取样溶液的试管中。藻酸盐棉拭子：由海藻酸钙羊毛制成。将海造酸盐羊毛缠在直径为1.5mm的木棒上做成长1cm~1.5cm、直径7mm的拭子头，灭菌后放入试管中。取样步骤同①。取样后放入装有10ml的1+4Ringer氏溶液（含1%偏磷酸六纳）的试管中。② 淋洗法用10倍于样品的灭菌稀释液（质量比）对样品进行淋洗，得到10-1的样品原液，这种取样方法可适用于全禽、干果、蔬菜等食品。报告结果时，应注明该结果仅代表样品表面的细菌总数。③胶带法 这种取样方法要用到不干胶带或不干胶标签。不干胶标签的优点是能把取样的详细情况写在标签的背面，取样后贴在粘贴架上。不干胶胶带取样后同样需转接到一个无菌粘贴架上。这种方法可用于检测食品表面和仪器、设备表面的微生物。胶带和标签制成后，可用易挥发溶液进行短时间的灭菌。必须确保灭菌后的胶带无菌或残留的微生物失去活性。胶带或标签的一端要向内弯回大约1cm左右以方便使用。取样时，把胶带从粘贴架上取下压在待测物质表面，迅速取样后，重新粘回到模板上。送到实验室后，将胶带（或标签）从粘贴架上取下，压在所需培养基表面。④琼脂肠法琼脂肠有无菌圆塑料袋（或塑料筒）和加入其中的无菌琼脂培养基制成。可在实验室制作，一些国家也有成品出售。使用时，在琼脂的末端无菌切开，将暴露的琼脂面压在样品表面，用无菌解剖刀切下一薄片，放在培养皿上培养。 ⑤影印盘 影印盘是一种无菌的塑料盘，也可称为“触盘”，可以从许多生产厂商处买到。制作时按要求在容器中央填满足够的琼脂培养基，并形成凸状面，需要时，将琼脂表面压在待测物表面。取样后再放入适当的温度培养。⑥触片法用一个无菌玻片触压食品表面，带回实验室。固定染色（如革兰氏法）后在显微镜下检测，也可以将取样的玻片压在倒有培养基的平板上，将细菌转接到琼脂表面，（用无菌镊子）移去玻片后，培养平板。这种方法不能用于菌体计数，但能快速判断优势菌落的类型，这对生肉、禽肉和软奶酪等食品更为适用。⑦表层切片法用灭菌解剖刀或镊子切取一薄层表层样品。这种方法最适用于家禽皮肤的取样。将样品放入装有适当稀释液和适当稀释度的容器中，均质后得到初始浓度为10-1的样品原液。（6）厌氧微生物检验用样品的采取取样检测厌氧微生物时，很重要的一点是食品样品中不能含有游离氧。例如在肉的深层取少量样品后，要避免使之暴露在空气当中。如只能抽取小样品，或需使用棉拭子取样时，就要用一种合适的转接培养基（如Stuart运送培养基）来降低氧的浓度。例如，如使用藻酸盐羊毛拭子取样后，就不能再放入原来的试管，而应放在盛有Stuart运送培养基的瓶中。棉拭子使用前要先用强化的梭菌培养基浸湿。（7）水样的采取采集水样应注意无菌操作，以防止杂菌混入。取水样时，最好选用带有防尘磨口瓶塞的广口瓶。对于用氯气处理过的水，取样前在每500ml的水样中加入2ml的1.5%的硫代硫酸钠溶液。在取自来水时，水龙头嘴的里外都应擦干净。再用酒精灯灼烧水龙头灭菌，然后把水龙头完全打开，放水5min~10min后再将水龙头关小，采集水样。这样的取样方法能确保供水系统的细菌学分析的质量，但是如果检测的目的是用于追踪微生物的污染源，建议还应在龙头灭菌之前去水样或在龙头的里边和外边用棉拭子涂抹取样，以检测龙头自身污染的可能性。从水库、池塘、井、河流等处取水样时，用无菌的器械或工具拿取瓶子和打开瓶塞。应先将无菌取样器浸入水下1cm~15cm处（井水则在水下50cm深处采样），然后掀起瓶塞采集水样。流动水区应分别采取靠岸边及水流中心的水。如果不具备适当的取样仪器或临时取样工具，只能用手操作，但取样时应特别小心，防止用手接触水样或取样瓶内部。（8）空气样品的采取 空气的取样方法，有直接沉降法和过滤法。 在检验空气中细菌含量的各种沉降法中，平皿法是最早的方法之一，到目前为止，这种方法在判断空气中浮游微生物分次自沉现象方面仍具有一定的意义。平皿法就是将琼脂平板或血液琼脂平板放在空气中暴露一定时间，然后37℃培养48h，计算所生长的菌落数。二级与三级取样方案二级取样方案：只设定合格判定标准m值，超过m值的为不合格品。通过检查在检样中是否有超过m值的，来判定该批产品是否合格。例如：生食海产品鱼的副溶血弧菌标准为n=5、c=0、m=102 ，其中n=5即取样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌落数超过m值的检样，此批货物为合格品。三级取样方案：设有微生物标准值m及M值，如同二级法，菌落数超过m值的检样，即算为该检样不合格。所有检样均小于m值，即为合格；在m值到M值范围内的检验数，在c值范围内，即为附加条件合格，否则为不合格；有检样超过M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌总数标准n=5、c=3、m=101、M=102，其意义是从一批产品中，取样5个检样，检样结果允许≤3个检样的菌落数在m和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或一个检样菌落数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。

为了规范微生物的日常工作，达到日常工作实事求是、及时准确、优质服务、质量至上的目标，保证日常工作的顺利进行，做如下规定：一、微生物检测意识树立正确的无菌观念和检测人员的素质，是每一个微生物检测人员应具备的素质，好的修养素质和积极的工作态度是保证结果准确的基础，下面的规定规范都是为检测服务的，如果检测人员没有好的素质，这些规定都是虚设，摆设；希望下面的规范是每位检测人员想要做得，而不是强加在自己身上的紧箍zhou。①增强自己得生物安全意识，如何保护自己，如何保护样品，如何无菌操作，有责任心。②实验原理，实验原理是实验的精髓，掌握它，就能够对整个实验更好的了解深入，学习研究。③实验条件的把握，对实验的每个条件是否掌握清楚，实验的关键控制点是否清楚。④实验结果的把握，一个实验结果的出现，首先应该自我分析，并且具备这种分析能力，对异常如何处理或是进一步验证。⑤具备研究好学心态，检测工作是一个相对只是含量较高的职业，高科技飞速发展的今天，许多当时的先进技术不久就陈旧落后，检测工作也一样，优秀的化验员总是虚心好学，善于研究，总是处在科技的前沿。⑥人员素质，积极向上，乐于助人，对工作负责，工作第一等，努力提高自己的工作质量。二、微生物检测1.实验前的准备1.1无菌间无菌间是微生物实验的重要环节，关系到实验结果的准确性，无菌间的使用规范要严格要求，保证实验环境影响因素降到蕞低。使用要求：1、无菌间在使用前，必须先进行清理、臭氧杀菌时间50min或紫外灯杀菌30min。2、检测使用的器皿、样品等物品的进出，通过缓冲窗进行传递，使用完毕后紫外灯杀菌30min，开传递窗时禁止两边同时打开。3、检测人员进入缓冲间后，先更换拖鞋、佩带无菌帽和一次性kou罩，更换衣服，并将其摆放整齐，方可进入无菌间。4、进入无菌室过程中，依次打开和关闭各缓冲间的门，以避免空气流通带入外界的杂菌。5、无菌操作前必须使用75%酒精对手部进行消du，接种有害菌种时必须戴手套。6、进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经严格消du灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼后使用，剪刀、镊子至少每周进行一次高压灭菌。7、从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。8、接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消du。9、接种环或针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。10、吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。11、检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快清理出无菌间灭菌洗刷。12、检验结束后，人员离开无菌间前，须将无菌间的卫生彻底清理、并用紫外灯进行杀菌。13、无菌间所用工器具（剪刀、镊子、胶头、涂抹棒、托盘盒等）使用完毕后，摆放整齐。14、灭菌后的无菌间悬挂“已灭菌”标识，正在使用的无菌间要悬挂“使用中”标识。防止检测人员在未经过灭菌的无菌间中进行微生物检测。其它注意事项：1.  禁止在无菌间内打手机，由于业务需要可在缓冲间内打手机。2.  实验过程中穿着整齐，不要出现露头发、鼻孔等现象，禁止在无菌间打闹、喧哗。3.  实验过程中，物品要摆放整齐，实验产生的垃圾要单独存放不要乱放，防止污染实验样品。4.  紫外灯每周五打扫卫生时要用酒精棉球擦拭，防止灰尘阻挡影响杀菌效果。1.2实验器具实验器具是微生物实验的一个关键控制点，实验器具的无菌是保证实验结果准确的重要因素。①培养皿，首先应确认是否经过消du，确认后进行外观检查，观察是否有破损，有破损处废弃。灭过菌的平皿最多保存一周时间。打开的平皿整齐的摆放到实验台上备用，发现有破裂的平皿应废弃；使用时看是否有平皿内部存有杂质、培养基等异物也应立即废弃。②玻璃器皿，新购置玻璃器具因含有游离碱，应在清洁液或2%盐酸内浸泡24小时，再用蒸馏水清洗。检验沾染的油迹、污浊物等器具可用10%NaOH浸泡1小时后，用清水冲洗干净。每周洗刷盛生理盐水的三角瓶子，防止水垢太厚影响灭菌和微生物生长。③实验完毕后，使用的实验器具应立即清洗消du，防止微生物增长污染或者伤害到人员。所有卫生用具如拖把、扫帚、抹布、垃圾桶等都要根据污染区、清洁区、无菌区要求严格区分开、并专用，不得相互混淆，卫生用具每周定量用1：20次氯酸钠液消du浸泡、清洗、凉干，以免污染。④在进行各种检验时，应避免污染；遇有场地、工作服等污染时，应立即处理，防止细菌扩散以免造成污染。凡吸过菌液的吸管或滴管或染菌的培养皿，应立即放入盛有消du液的容器内或高压灭菌处理。工作人员必须每天坚持做好环境卫生工作，防止灰尘飞扬，定期对整个操作环境进行消du。1.3药品的使用微生物药品是微生物实验的一个关键控制点，培养基质量的关系到检测结果准确的重要因素。①药品的采购，实验药品缺少时，由药品管理员上计划。微生物药品常规药品按“箱”进行计算，不常用药品按“瓶”进行计算，生化鉴定管按“支”进行计算，每种保留至少1个单位库存量。②药品取用，药品取用时到药品管理员取钥匙，取用后将药品柜锁死，并将钥匙归还给药品管理员。取用人员发现药品低于1个单位库量时，及时通知药品管理员。③将近过期药品（2个月），生化鉴定管可以退货，其他药品抓紧时间使用，过期药品废除。④新药品使用时，应注意检查包装是否有破损？粉末状药品是否有结块？有无杂质？有无变色等异常。⑤药品称量按照使用要求配制，并填写药品配制记录。⑥配制好的药品按照灭菌要求进行，含糖的培养基灭菌总时间不超过45min，灭菌后观察培养基的颜色、容量等，并摇匀培养基，放置琼脂沉淀到底部。⑦培养基使用前，按要求进行溶解，在溶解过程中要防止二次污染和溶解不充分；溶解后放到45~50度，放置备用时间不超过4h。⑧使用时，进行冷却温度控制到45度左右，过高容易杀死微生物，过低培养基凝固。⑨倾倒培养基时应注意无菌操作，并摇匀培养基。倾倒过多，培养基过厚需氧环境不好，过薄培养基容易干裂影响检测结果，配制培养基尽可能按照样品量进行配制，使用后的培养基根据情况废弃或保存。1.4灭菌锅的使用灭菌锅属于高压灭菌容器，安全性和灭菌效果是控制的重点，使用规范如下：安全事项：由于灭菌锅属高压容器，压力表要及时计量，操作过程中人员不得离开现场，如有异常问题及时通知相关人员，机修，管道。①检查高压灭菌锅的外观是否正常，压力表、温度计是否归零，各管路阀门是否为关闭状态。②排放物品，注意不要过满；关锅并将标示牌转到已灭菌，调节阀打到排气状态。③打开总阀门，打开排水法，进行管道排水，约1-2min当听到无水声时，关闭排水法。④打开进气阀和出气阀，进行排气，此过程是对锅内空气进行排气，防止空气存在影响灭菌效果。⑤排气等夹层压力达到0.5Mpa，将调节阀调到灭菌状态进行灭菌，培养基121℃15min；其他特殊培养基安灭菌要求进行灭菌。注意事项由于温度为手控，所以灭菌过程中要注意温度的变化。⑥灭菌完毕后，填写灭菌记录，并关闭进气阀，排气阀不用关闭，并等温度降低60度左右，压力降到0；如果压力过大时开锅有可能打不开，另一个容易造成液体倒吸使瓶塞蹦出。⑦开锅后，及时将培养基取出摇匀后冷却，物品取出后负责人要及时清锅，防止其他物品污染灭菌物品。⑧灭菌结束后，将排水阀打开，防止管道积水。其他注意事项：①温度计无变化：1.温度计损坏，2.电源未打开，3.探针堵塞，4.调节阀损坏不进气。②锅门打不开：1.压力过大，2.调节阀损坏，内部负压。③管道漏气：找管道维修。④灭菌锅的每周清洁污物及凝结水同时清洗；灭菌锅要保持干净并无残留物（尤其滤器）以防止生锈保证最大热传递和橡胶用具以蒸沸15min灭菌为宜，高温高压处理易失去弹性。⑤容积控制：采取称中法测定蒸发量，体积100vml稀释起重量为101vg，高压够体积偏差不超过1%。1.5培养箱的使用培养箱的温度、湿度控制是微生物控制的关键点。使用规范如下：①外观检查，有无噪音，是否放平稳，有无故障。②检查温度设置是否为检测要求温度？显示温度与设定温度是否在允许波动范围内。③为了保持培养箱内部湿度，可在培养箱内放一个盛水的小烧杯，防止培养基干燥。④培养箱内物品摆放整齐，但不要过紧密，防止温度，空气等环境之间的差异对检测结果的影响，并关好箱门（轻开轻关）。⑤每天对培养箱内温度计和显示温度进行比较，填写仪器设备使用记录，对较大差异的查找原因进行处理。⑥保持好培养箱内卫生，对有异味的培养箱进行通气，并每周对培养箱进行消du杀菌,培养后的平皿及时清理，防止霉菌或其他微生物累积。⑦冰箱每周进行除霜清理，存放的物品做好记录，对不用的物品及时清理。三、样品接收2.1送检样品的处理微生物接受样品，就是检验工作开始之时，样品接收、交接环节是检验工作的第一环节，关系到检验工作质量和效率。为了真实的反应车间加工产品的质量情况，正确的指导车间生产。具体措施如下：化验员到车间自取样品，保证每个车间每周1个样品，并在化验结果后备注“自取”。另外有特殊情况可增加取样量，微生物考核时按正常样品计算，在自取样品栏里填写。2.2样品运输个人车间样品由自己取，便于与车间交流沟通，掌握产品信息和工艺，对微生物检测判断有帮助。微生物样品运输过程中必须采用保温袋，防止温度变化；另外运输过程中样品不要落地，防止袋子破损污染样品。2.3样品保存冷冻品按要求进行解冻，干燥食品可放在常温冷暗处，易腐和冷却样品应放入10℃环境。冷冻样品来不及检验应放入-15℃以下冰箱内。原则上冷冻样品取出后，按包装原样在室温下自然解冻；也可在0-4℃环境解冻，时间不超过18小时；也可在温度不超过45℃环境中解冻，时间不超过15min。2.4样品制备根据样品不同性状、类型的食品，进行适当处理，尽可能的保证均匀取样。或按照检测方法进行样品处理。四、日常工作1。文件资料及物品的规定为了规范微生物资料管理，起到工作有秩序的目的，防止重要资料丢失。特对资料整理规定如下，希望大家严格执行，为我们创造一个良好的工作环境。2.个人桌面1.原始记录夹子要有对应车间的标签，没有的可向组长索要打印一张，不要出现标签与内容不符的现象。2.个人资料必须放到夹子里面，不要在桌面出现装订纸张。3.原始记录、抽取单不要随意乱放，防止客户参观时随意翻看，泄漏客户机密，记录完毕后，要整齐放到办公室夹子座里面。4. 其它资料包括书籍等要放到小柜里，借阅、归还时要到资料管理员签字，借阅的书籍也不要乱放，看完后要整齐放在办公室桌子，禁止放到实验区（可在实验区阅读）。5. 有单页报告单或者其他资料时，可放到插页夹子里，每组一个，桌面不要出现单页纸。

根据目前掌握的新-型冠-状病-毒生物学特点、流行病学特征、致病性、临床表现等信息，该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理。一、实验活动生物安全要求（一）病毒培养：指病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的重组实验等操作。上述操作应当在生物安全三级实验室内进行。使用病毒培养物提取核酸，裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行，裂解剂或灭活剂加入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。（二）动物感染实验：指以活病毒感染动物、感染动物取样、感染性样本处理和检测、感染动物特殊检查、感染动物排泄物处理等实验操作，应当在生物安全三级实验室操作。实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。（三）未经培养的感染性材料的操作：指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸提取、生化分析，以及临床样本的灭活等操作，应当在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。（四）灭活材料的操作：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测、抗原检测、血清学检测、生化分析等操作应当在生物安全二级实验室进行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一级实验室进行。二、病原体及样本运输和管理（一）国内运输：新-型冠-状病-毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装符合国际min航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求；环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373，包装符合国际min航组织文件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求；通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。新-型冠-状病-毒毒株或其他潜在感染性材料运输应当按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部令第45号）办理《准运证书》。（二）国际运输：新-型冠-状病-毒毒株或样本在国际间运输的，应当规范包装，按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续，并满足相关国家和国际相关要求。（三）毒株和样本管理：新-型冠-状病-毒毒株和相关样本应当由专人管理，准确记录毒株和样本的来源、种类、数量、编号登记，采取有效措施确保毒株和样本的安全，严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。三、废弃物管理（一）开展新-型冠-状病-毒相关实验活动的实验室应当制定废弃物处置程序文件及污物、污水处理操作程序。（二）所有的危险性废弃物必须依照统一规格化的容器和标示方式，完整并且合规地标示废弃物内容。（三）应当由经过适当培训的人员使用适当的个人防护装备和设备处理危险废弃物。（四）废弃物的处理措施：废弃物的处理是控制实验室生物安全的关键环节，切实安全地处理感染性废弃物，必须充分掌握生物安全废弃物的分类，并严格执行相应的处理程序。1.废液的处理：实验室产生的废液可分为普通污水和感染性废液。（1）普通污水产生于洗手池等设备，对此类污水应当单独收集，排入实验室水处理系统，经处理达标后方可排放。（2）感染性废液即在实验操作过程中产生的废水，采用化学消毒或物理消毒方式处理，并对消毒效果进行验证，确保彻底灭活。（3）工作人员应当及时处理废弃物，不得将废弃物带出实验区。2.固体废物的处理：（1）固体废物分类收集，固体废物的收集容器应当具有不易破裂、防渗漏、耐湿耐热、可密封等特性。实验室内的感染性垃圾不允许堆积存放，应当及时压力蒸汽灭菌处理。废物处置之前，应当存放在实验室内zhi定的安全地方。（2）小型固体废物如组织标本、耗材、个人防护装备等均需经过压力蒸汽灭菌处理，再沿废弃物通道移出实验室。（3）体积较大的固体废物如HEPA过滤器，应当由专业人士进行原位消毒后，装入安全容器内进行消毒灭菌。不能进行压力蒸汽灭菌的物品如电子设备可以采用环氧乙烷熏蒸消毒处理。（4）经消毒灭菌处理后移出实验室的固体废物，集中交由固体废物处理单位处置。（5）实验过程如使用锐器（包括针头、小刀、金属和玻璃等）要直接弃置于锐器盒内，高压灭菌后，再做统一处理。（五）建立废弃物处理记录：定期对实验室排风HEPA过滤器进行检漏和更换，定期对处理后的污水进行监测，采用生物指示剂监测压力蒸汽灭菌效果。四、实验室生物安全操作失误或意外的处理（一）新-型冠-状病-毒毒株或其他潜在感染性材料污染生物安全柜的操作台造成局限污染：使用有效氯含量为0.55%消毒液，消毒液需要现用现配，24小时内使用。此后内容中有效氯含量参照此浓度。（二）含病毒培养器皿碎裂或倾覆造成实验室污染：保持实验室空间密闭，避免污染物扩散，使用0.55%有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区。必要时(大量溢撒时)可用过氧乙酸加热熏蒸实验室，剂量为2g/m3，熏蒸过夜；或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m3，作用1～2小时；必要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸：高锰酸钾8g/m3，放入耐热耐腐蚀容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m3，熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。（三）清理污染物严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

从事检测行业的实验室人员经常都要用到标准物质GBW和标准样品GSB，但是很少人知道标准物质和标准样品有什么区别，今就对标准物质和标准样品的区别详细跟广大做检测和或校准的同行说一下，希望对那些对标准物质和标准样品不知道如何区分的人有帮助：管理机构的区别标准物质GBW和标准样品GSB都是由国际技术监督局标准司批准，国家技术监督局发布，但是标准物质是由全国标准物质管理委员会组织和审查，而标准样品则由全国标准样品技术委员会组织和审查。代号不同标准物质的代号是GBW，标准样品的代号则是GSB。定义不同标准物质是具有一种或多种足够均匀并已经很好地确定其特征量值的物质或材料。用于校准仪器、评价测量方法或确定物料的量值；标准样品是具有足够均匀的一种或多种化学的、物理的、生物学的、工程技术的或感官的等性能特征，经过技术鉴定，并附有有关性能数据证书的一批样品。制备过程的区别标准样品制备要经过制备物料，对成品物料进行均匀性检验、定值，稳定性检验，包装，审查，批准，发布等步骤；标准物质的制备过程与标准样品基本相同，只是要求要高很多。用途不同标准样品是为实施和制定标准的需要而制定，一般只在标准所涉及的范围使用，它在实物标准（相对文字标准而言）不能用作计量的传递；标准物质是计量标准，可以作计量的传递，用于校正仪器、评价测量方法、确定物料的量值，只要适宜可以代替标准样品在制定、实施标准中使用。以上是标准物质和标准样品的五点区别，此外，标准物质分为一级标准物质GBW和二级标准物质GBW(E)。在国外，标准物质和标准样品是没有区别的。标准物质是作为量值的传递的工具和手段。标准样品则是为了保证国家标准或行业标准的实施制定的国家实物标准。如一些产品的技术性能指标，难以用文字叙述清楚，需要用实物作为文字标准的补充，例酒、颜料的外观、颜色色光等。GBW和GSB区别：