⑴工业浓盐酸：可洗去水垢或某些无机盐沉淀。⑵酸性草酸或酸性羟胺洗涤液：称取10g草酸或1g盐酸羟胺，溶于10ml盐酸（1+4）中，该洗液洗涤氧化性物质。对沾污在器皿上的氧化剂，酸性草酸作用较慢，羟胺作用快且易洗净。⑶5％～10％磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）溶液：可洗涤油污物。⑷硝酸洗涤液：常用浓度（1+9）或（1+4），主要用于浸泡清洗测定金属离子时的器皿。一般浸泡过夜，取出用自来水冲洗，再用去离子水或亚沸水冲洗。⑸5％～10％乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪器内壁的白色沉淀物。⑹尿素洗涤液：为蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤盛过蛋白质制剂及血样的容器。⑺ 有机溶剂：如丙-酮、乙mi、乙醇等可用于洗脱油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脱油漆的污垢。⑻ 氢氧化钾的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液：这是两种强碱性的洗涤液，对玻璃仪器的侵蚀性很强，可清除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。前者配法：取100 g氢氧化钾，用50ml水溶解后，加工业乙醇至1L，它适用洗涤油垢、树脂等。

实际工作中，一般做液相要用到对照品，标准品可以从试剂公司买，但有的物质是没有标准品的，大家就常说那是对照品，纯度都可以达到98%，但是到底对照品和标准品有没有一个严格的界定呢?还有，做内标法，说用的是内标物，这个内标物和对照品和标准品又有什么不同呢?将一个已知质量，样品中不含有杂质的纯物质，加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。内标物需满足下列要求：能完全溶解于样品中，且不与待测组分发生化学作用;峰位尽可能与待测组分的峰位靠近，但能与待测组分完全分开(分离度R≥1.5)的纯物质。若得不到纯品，必须预先测定其准确含量，且杂质峰不得干扰待测组分峰。内标物有时不易寻找是内标法的缺点。此外，还应满足以下条件：内标物应是该试样中不存在的纯物质;2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;3.加入内标物的量应接近于被测组分;4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。对照品是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，采用化学方法来测定，即是一般仪器的都叫做对照品。对照品分为标准品和工作对照品，试剂公司买的不能作为正常的对照品使用，必须经过标定之后才可使用。举个例子，药典规定若是血液制品，用来对照的叫标准品，若是药材，用作对照的叫对照品。内标物一般是在用内标法测挥发性成分时加入的物质。这样会不会好理解一点?对于内标法定量分析来说，内标物的选择是极其重要的。它必须满足如下的条件：⑴内标物与被分析物质的物理化学性质要相似(如：沸点、极性、化学结构等);⑵内标物应能完全溶解于被测样品(或溶剂)中，且不与被测样品起化学反应;⑶内标物的出峰位置应该与被分析物质的出峰位置相近，且又不共溢出，目的是为了避免GC的不稳定性所造成的灵敏度的差异;⑷选择合适的内标物加入量，使得内标物和被分析物质二者峰面积的匹配性大于75%，以免由于它们处在不同响应值区域而导致的灵敏度偏差。标准品、对照品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质。标准品与对照品(不包括色谱用的内标物质)均由国wu院药品监督管理部门指定的单位制备、标定和供应。标准品系指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位(或μg)计, 以国际标准品进行标定;对照品除另有规定外,均按干燥品(或无水物)进行计算后使用。标准品与对照品的建立或变更其原有活性成分和含量，应与原标准品、对照品或国际标准品进行对比，并经过协作标定和一定的工作程序进行技术审定。标准品与对照品均应附有使用说明书，标明批号、用途、使用方法、贮藏条件和装量等。

标准品的标定主要有两个流程，一是初步标定，二是正式标定，下面我们一起来看，处理标准品的标定结果请遵循这四个步骤：                      第一：如该药物没有可进行等当量换算并符合要求的容量法时，可采用反复纯化的原料，色谱法确定纯度后扣除有关物质、炽灼残渣、水分和挥发溶剂等后的理论含量确定为标准品含量，以此为基准进行对照品(标准品)的换代和量值传递。第二：用于抗生素微生物检定法的代基准标准品可参照上述方法标定，如为多组份抗生素，其组份比例应与拟上市产品组份比例一致或接近，或以其中某一组份纯品为基准标准品，但要注意标准品换代时量值传递的恒定。第三：仅用于鉴别定性的化学对照品，注重其结构确证的研究资料，纯度和含量的要求一般可适当降低。第四：杂质对照品，用作限度要求时，应提供其来源(合成路线)、结构确证的研究资料，应具备较高的纯度和含量，并提供纯度和含量的的测定结果，提供质量控制标准。标准品与对照品的区别1.标准品，即是标准物品，作为一种衡量标准，如果用在药物方面，则为含量测定中的标准含量。标准品包括化学计量标准品、冶金标准品和药检标准品。采用生化方法来测定，目前国家规定的标准品共有15种，林可酶素、新霉素、大观酶素、太乐菌素、链霉素、卡那霉素、绒促性素、盐酶素、杆菌肽锌、吉他酶素、安普酶素、红霉素、合成缩宫素、庆大霉素、渡毛化苷G。2.对照品，是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。采用化学方法来测定，即是一般仪器的都叫做对照品，国家规定的有107种，包括地塞米松、土霉素、阿莫西林等等。

化学试剂在贮存过程中是否会发生变质，取决于内外两个方面的因素，内因是试剂本身化学结构所决定的理化性质；外因则是试剂所处的环境条件。实验室化学试剂没有保质期，那怎么办？实验室试剂的有效期如何确定？实验室溶液、溶剂的有效期到底是多少？要做到合理保管，一要了解试剂结构与性质间关系，二要创造适应试剂贮存的外部环境。下面来深刻了解一下！化学试剂变质的原因环境主要是指贮存的温度、光照和介质。介质一般是指空气和混有的杂质。贮存室里除空气中含有的氧、二氧化碳和水蒸气以外，还往往含有存放的各种挥发性试剂扩散到空气中的蒸气，常见的有氯化氢、硝-酸、硫化氢、2氧化硫、溴、碘、yi烯、甲醛等蒸气；另外还有飘混在空气中的尘埃，其中有无机物也有有机物及各种微生物。化学试剂在一定的温度、光照、介质条件下会逐渐变化以致变质，该过程有物理变化，亦有化学变化。前者使化学试剂产生损耗，后者则能使试剂完全变质失效。引发和促使化学试剂发生变化的原因，大致可归纳如下。a. 挥发挥发是挥发性试剂造成试剂损耗、浓度改变、规格下降的最常见的原因。挥发性试剂的一般特点是：分子量较小、沸点较低。常见的无机试剂有：浓盐酸、浓硝酸、发烟硫酸等，有机试剂则有碳原子数较少的液态物质，如：甲醇、乙醇、石油醚、汽油等。b. 升华具有升华性质的一类试剂一般是升华热较少的分子晶体。实验室里一般有室温下升华的试剂(如碘萘等)和受热条件下升华的试剂(如硫与lv化汞)两种。这类试剂的升华主要造成损耗和污染空气。c. 潮解和稀释能发生潮解的化学试剂为数不多，它们大部分是易溶性化合物，一般阴离子半径远小于阳离子半径，也有阴阳离子半径相近而阳离子所带电荷较多。此类试剂吸收水分在表面形成饱和溶液后，若产生的水蒸气气压小于空气中的水蒸气分压，潮解将继续进行，直至全部形成溶液。如：氢氧化钠、碱石灰等，有机物中易潮的有醋酸钠、醋酸铵等。稀释是指试剂溶液吸收空气中的水分导致浓度下降变稀的现象。发生原因与潮解一样，是外界水蒸气分压大于试剂的水蒸气分压所致。易发生稀释现象的常见试剂有浓硫酸、正磷酸、乙二醇等。d.风化风化的原因和潮解相反，是结晶水合物的水蒸气分压高于空气中水蒸气分压的缘故。空气越干燥，风化速度越快。实验室中常见的易风化剂 有：Na2CO3?10H2O、Na2SO4?7H2O、CuSO4?5H2O、MgSO4?7H2O、ZnSO4?7H2O等。发生风化虽未波及试剂的化学性质，但使试剂外观改变，质量减少。e. 浓缩和析晶浓缩和析晶产生的原因是在环境干燥的条件下，试剂溶液的水蒸气压高于外界空气中水蒸气压，造成溶液水分的蒸发而浓缩、析晶，各种固体溶质的试剂一般均有此类现象，特别是一些浓度较大的溶液，浓缩和析晶虽对瓶中试剂性质影响不大，但也会改变其浓度、规格和外观。对某些溶点较低的有机物，在外界温度下降较大的情况下，也会发生析晶现象，比较明显的例子是冰醋酸。f. 水解容易水解的盐类试剂大都具有共价键，凡是强酸和弱碱和弱酸和弱碱所生成的盐，遇水都会发生不同程度的水解。实验室中一些金属元素的卤化物很容易水解，如：TiCl4、AlCl3、FeCl3、SnCl2, 等，它们是带电荷高、半径小的阳离子化合物或是非惰气型的阳离子化合物。此类试剂可因易吸水水解而变质，易水解的有机物是含有酰基的化合物，如：酯、酰卤等物质。g. 分解分解反应也是引发和促进试剂损耗和变质的原因。试剂的分解速度通常和环境温度密切相关。温度高分解速度加快，通常易分解的二元化合物其化学键键能较低。键能越低，越易分解，例如：碘化合物就比溴化物更易分解。有的分解反应还和试剂的含水量有关，如：硫酸氢铵，含水量越大，温度越高分解速度也越快。而含氧酸盐，如：硝酸盐、高锰酸盐则要在受热时才发生分解。h. 氧化和还原通常易被氧化的是标准电极电位低，具有还原性的试剂，它的名称中常常带有“低”或“亚”字。还有部分活泼金属和非金属单质，过氧化物及某些有机试剂，常见的有硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、亚硫酸、无水亚硫酸钠、钠、钾、钙、锌粉、还原铁粉、乙醛等。还原性越强的试剂越易因氧化而变质。使其氧化的原因是空气中的氧和具有氧化性的杂质所为。标准电极电位较高的试剂，在以固态形式存在时，通常在空气中比较稳定，如：高锰-酸钾、重铬-酸钾等。但以溶液存在时就易和空气中的一些还原性杂质，如H2S，SO2等作用而变质，如：KMnO4，Na2S2SO4，K3Fe(CN)6等溶液。i. 非氧化——还原反应有些试剂的变质并非一定要引起元素价态的变化，即发生非氧化——还原反应也能使其失效。实验室中最常见的实例，如：生石灰因吸收水分变成熟石灰，进一步吸收二氧化碳而失效；氢氧化钠和氢氧化钾固体也因吸收二氧化碳而带有杂质，若长期暴露在空气中则完全转化成碳酸盐；此外氧化镁、氧化钡、氢氧化钡也应防止它们和空气中二氧化碳反应。J. 聚合和缩合分子结构中含有不饱和双键或叁键的有机物质容易发生聚合，如：甲醛溶液常会聚合生成白色的三聚甲醛，qing化钾试剂也易聚合。有电荷高、半径小的中心离子形成的含氧酸盐溶液则能因缩合而析出多酸盐沉淀，如：钼酸铵溶液  能缩合析出四钼酸铵沉淀，三聚甲醛经加热处理  尚可重新释放出甲醛气体，但有些试剂，一旦发生聚合或缩合反应，往往是不可逆的，从而造成变质失效。k. 光化学反应光作为一种能量也能使某些试剂反应而变质。光能引发分解反应导致银盐分解就是实例。光也能引发氧化反应，如：ben甲醛在光照下，易被空气氧化成苯甲酸，苯胺则能从无色变成棕色。此外，碘hua汞、邻苯3酚、lv仿，硫酸汞、亚铁qing化钾等也易发生光化学反应。霉变所谓霉变则指在化学试剂中霉菌滋生繁殖的现象。在空气中尘埃里含有无数菌类微生物，在一定温度条件下就能繁衍。实验室中的碳水化合物，酯类、蛋白质类试剂，含有氮、硫、磷的有机试剂正是菌类繁衍的良好营养物质和温床。上述试剂只要密闭不严与空气有所接触皆可发生霉变。

一、菌株的采集实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买商业派生菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须附带有供应商的合格证或检测报告或说明书，来证明所采购的标准菌株是合格的。二、标准菌株和验收 实验室收到标准菌株，首先应进行符合性感官检查，记录菌株号和标准菌株来源途径信息，确保溯源性清楚。同时还应记录标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等情况。三、冻干标准菌株的复活1.开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，再打开使用。2.复活：选择合适的培养基和培养条件进行复活。菌种的shou次活化最hao是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第0代。四、工作菌株确认方法及依据用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板（营养琼脂、大豆胰蛋白胨琼脂）上或相应的细菌鉴别平板（如伊红美蓝、麦康凯、BP等上划线分离单个菌落，置适宜条件下培养（若该类微生物为厌氧菌，则培养条件应为厌氧条件）。以同样方法取真菌和酵母菌至SDA（萨布罗培养基）平板上或玫瑰红钠培养基平板上，23～28℃下培养7d；培养后观察是否具有典型的菌落状态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌体形态以确定菌种。五、 污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯。要将该污染培养物做灭菌处理，寻找原因，重新分离挑选纯菌落。六、菌种保存所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见菌种质量报告鉴定证书上的方法）；具体菌种保存方法一般为：将复苏后肉汤与灭菌甘油按15%甘油比例（肉汤8.5mL+甘油1.5mL）混合，-30 ℃冻存，（可用2mL冻存管冻存多管），作为保藏储备菌株F1代，也可使用商品化的菌种保存管。七、菌种的传代1.标准菌株的复苏① 菌种操作应在无菌条件下进行，防止杂菌污染。② 每次使用和复苏时只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。2.标准储备菌株每转接一次须进行确认。（确认方法一般为他们各自du有的形态，在鉴别培养基上的形态）3.工作菌株转接的方法①配制营养琼脂培养基（溶血性弧菌加3%氯化钠 ），121℃高压灭菌15分钟后分装在试管内，冷却后备用。②在无菌条件下，用接种环挑取菌苔至新鲜试管上作“米”字形划线接种，放置在36℃的培养箱内培养24小时。4.工作菌株的使用①内部质量控制：一个月一次阳性对照、培养基每批验收；②外部质量控制：能力验证、实验室比对；③工作菌株的期间核查期间核查的频率：每半年对使用标准菌株进行一次期间核查。工作菌株期间核查的方法及依据：同工作菌株的确认一样。建立标准菌株期间核查记录。八、菌种的标识菌种代数的计算为干粉菌种为第0代，转接一次加一代。具体标识为：例单增李斯特氏菌第0代，标识为DZ-0，第一代标识为DZ-01第一代有12支，则DZ-01-01、……、DZ-01-12；并标明日期：如2021.08.27这样填写。九、菌种的保藏①将试管内菌种放入冰箱中2～8℃冷藏保存。②将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中2～8℃保存。每支保存菌种需标明菌名、标准编号、传次、传代日期。十、菌种的销毁①菌种使用后或超过贮存期的应进行销毁。②需销毁的菌种，应用高压蒸汽（121℃）灭菌30分钟。③灭菌后，再进行清洗和处理。④销毁的菌种应做好记录。销毁时由化验负责人监督销毁，保管人员负责销毁。

实验室为了进行检验质量控制、检验方法的验证、确认灭菌效果、培养基或其他生物试剂性能确认等方面的工作，都需要用到一定量的标准菌株。按照中国实验室国家认可委员会zhi定的检测和校准实验室认可准则(CNAL/AC01)中关于标准物质的规定，微生物标准物质应严格其保存、使用、管理及确认程序。微生物标准菌株的保存、使用和管理是微生物实验室的一项重要工作。获取实验室标准菌株可以通过购买、交换、接受赠送等途径获得。实验室自行分离的菌株对图标准菌株经过鉴定后，可以做为参考菌株(参考培养物， reference cultures)在实验室内使用。标准菌株的源头是专门的菌种保藏机构的菌株，如ATCC (American Type Culture Collection美国典型培养物保藏中心)的菌株、其他国外quan威菌种保藏机构或我国国家菌种库储存的各级标准菌株等。需要注意，商业来源的菌株是演化菌株(派生菌株),并不是原代菌株，例如：商业ATCC菌株都是派生菌株。保藏中心提供的菌都有固定的编号（菌株号)。通常菌株编号由两部分组成：前面是几个字母的缩写代表菌种保藏机构，后面紧跟一串数字表明其编号。活化从菌种保藏中心购买的菌种一般是安瓿瓶装的冻干粉剂，近来又出现了几种新的菌种保藏方式，如： MAST CRYOBANK菌种保藏管、LyfoCults Plus菌种保藏系统、Culti -Loops菌种保藏系统等。参照随附的菌种使用活化方法进行活化。商品化的保藏菌株须按照厂商的说明进行，对于有特殊条件要求的菌株尤其要按照推荐的方法执行。根据GB 19489 《实验室生物安全通用要求规定》，病原微生物分为I级~N级危害等级。实验室在符合相应生物安全水平的条件下，进行菌种活化，一定要做好防护。食品微生物实验室一般只需储存危害等级I、II级的微生物，高危害等级的微生物不应在食品微生物实验室保存。(一)外包装的开启从保藏中心购买的菌株通常有三层包装。内层(如安瓿瓶)是用于盛放微生物，完全密闭，外面用吸水材料包裹，泄漏时起吸附作用。中间层是用塑料罐、泡沫塑料等制成的，对内层起支撑保护作用，该层可以装数个内层容器，两者之间有填充填料。外层是硬纸板箱、木箱、塑料箱等制成的，用于保护内包装。包装开启先要根据菌种所需的防护水平，穿防护服，带好手套、kou罩、帽子，然后检查菌种包装外观，仔细看有无渗漏、破损等异常现象。检查无异常后将外包装除去，依次检查中间层、内层，直至完全打开。若发现内外层包装都有破损渗漏现象，并且安瓿瓶等微生物容器已经破损，要立刻通知有关部门和菌种发放单位，对包装、运输工具等微生物污染物进行消毒。若外包装有破损等异常情况，但安瓿瓶等微生物容器无破损，或安瓿瓶等微生物容器已破损，但外包装无破损、渗漏情况，则无需溯源。对安瓿瓶等微生物容器无破损，按要求开启；对安瓿瓶等微生物容器已破损，可按照生物安全操作原则，对微生物污染物进行消毒灭菌处理。(二)安瓶瓶的开启及菌种复活检查完好无损的安瓶瓶可以开启，一般按下面方法打开内层包装，取菌种。单瓶安瓶瓶，先用75%酒精棉擦拭安瓶瓶上部，再用砂轮在安瓿瓶上部横向锉一道痕迹，然后将划痕处向外，用无菌脱脂棉包住安瓿瓶(保护双手),手持安瓿瓶从锉痕处稍向外用力打开安瓶瓶。还可采用将安瓿管顶部烧热，滴上几滴无菌冷水或用无菌棉签沾冷水在顶部擦一擦，顶部出现裂纹，用消毒镊子轻叩一下，敲下安瓿管的顶端。双瓶安剖瓶先把外瓶的顶端烧热，再在顶端滴几滴冷水，使顶端玻璃出现裂纹，用镊子等敲掉顶端，最后用消毒镊子取出绝缘层和闪瓶。选择合适的培养基和培养条件(根据生产商说明)进行复活。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从菌种保藏中心购买的冻干菌种为第0代。细菌的复活方法：用无菌吸管(或移液器)吸0.5 mL液体培养基加到冻干菌块上，吹打制成菌悬液。将全部菌悬液移入5ml合适的肉汤培养基中。将管中残留的几滴悬液移种到斜面上。在合适的条件下培养，细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出，但是少数菌会表现出延滞期延长的现象，需要将正常培养时间加倍。霉菌和酵母菌的复活方法：用无菌吸管(或移液器)吸0.5 ml-1 ml无菌水到冻干菌块上，将全部内容物移入装有5mL无菌水的试管中进行复水，2h (或过夜)后接种到肉汤或固体琼脂上，在合适的温度下培养，真菌培养温度通常是25℃。少数培养物会表现出延滞期延长的现象，需要将正常培养时间加倍。如菌株在推荐的条件下培养不生长，须灭菌处理之后方可丢弃。(三) MAST CRYOBANK菌种保藏管的使用MAST CRYOBANK菌种保藏管是由冰冻小管组成的多功能保藏系统，每支小管中包含20-25粒覆有特殊低温防腐溶液且经过化学处理的珠子。菌种保藏时，只需将经纯化培养培养生长旺盛的菌株接入保藏管溶液中，通常需要4~7环，苛养菌要多接一些，拧紧盖子充分震荡，细菌即吸附在小珠子上，再用无菌吸管吸走溶液，放入冰箱保藏， -70℃可保存10年，-15 ℃~-10℃可保存1年~3年。菌种的活化只需将小珠放在合适的琼脂平板上滚动或置于肉汤中培养即可。(四) LyfoCcults Plus菌种保藏系统LyfoCcults Plus菌种保藏系统是一个集储存、复溶和接种于一体的系统。形状像钢笔，使用方便。使用时只需撕开铝箔袋，取出LyfoCults Plus装置，旋开一端，取出接种棒，用力挤捏另一端的塑料安剖瓶的液体，混匀后流入带干粉状菌小管中，用接种棒在小管中搅动，使菌复溶形成菌悬液，用接种棒蘸两滴菌液接种到培养基上，涂抹均匀后进行培养复苏。菌种保藏系统的使用见。(1)从箔片包装上揭下预先打印好的标签，贴在要接种的培养基上。(3)撕开安全密封条。(4)旋开小管上的敷抹器，打开系统。(5)用力挤压安瓿瓶，使所有的液体化合物倒进小管中。(6)混匀。(7)把小管的顶部作为移液管，在培养基上滴两滴菌悬液。(8)用小管的jian端在培养基上划线。(五) Culti-Loops菌种保藏系统Culti-Loops菌种保藏系统是一种接种环形式的菌种保藏系统，接种环上有少量的菌，无需制备，可直接在平板上划线进行活化，每个接种环可接5块平板。此保藏系统除弯曲菌需冷冻保存（-18℃）外，其他只需2℃~8℃保存。(六)实验室其他方法保藏菌株的复活实验室内采用其他方法保藏的菌种复活时可按不同的方法。如在超低温冰箱中的菌种，复活时，只需取出冷冻菌种的小管，在室温下融化后接种在适宜的培养基中培养即可。液体石蜡法、沙土管保藏法、半固体穿刺保藏法保藏的，用接种环挑取即可。确认菌种确认可从菌落形态，细胞形态，芽孢大小、位置、形状，生化鉴定等方面进行。(一)菌落形态取复活后的菌，在相应的鉴别平板或普通非选择性平板上划线分离，培养出单菌落，观察菌落形态是否符合，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于出现两种或以上形态的菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。(二)细胞形态对数生长期的培养物革兰氏等染色反应应呈现一致性，细胞形状、大小、鞭毛、荚膜等特征应相似。(三)芽孢形成芽孢的菌种，其芽孢大小、位置、形状应相似。(四)生化鉴定必要时进行生化鉴定等实验，进一步确认。在菌种确认过程中，如发现菌种有污染，则要分离挑选目标菌株，培养成功后将污染培养物高压灭菌处理。

说起实验室基础操作，可能你会觉着这有什么难，整天做实验谁不会呢？但是天天进行的操作是正确的吗？有没有我们以为是正确的但是实际上是错误呢？跟小编一起看看这些基础的不能再基础的实验室知识吧！实验室常用的基本操作玻璃仪器的基本操作1、玻璃仪器的洗涤（1）震荡水洗（2）内壁附有不易洗掉的物质，可用毛刷刷洗倒废液——注入一半水——选好毛刷，确定手拿部位刷洗——如是反复（3）刷洗后，再用水连续振荡数次，必要时还应用蒸馏水淋洗三次洗净状态下，水均匀分布不挂水珠（如左图所示）；未洗净状态下，器壁挂着水珠（如右图所示）。玻璃仪器里如附有不溶于水的碱、碳酸盐、碱性氧化物等可先加盐酸溶解，再用水冲洗；附有油脂等污物可先用热的纯碱液洗，然后用毛刷刷洗，也可用毛刷蘸少量洗衣粉刷洗；对于口小、管细的仪器，不便用刷子洗，可用少量王水或重铬酸盐洗液涮洗；用以上方法清洗不掉的污物可用较多王水或洗液浸泡，然后用水涮洗。(1)不要未倒废液就注水(2)不要几支试管一起刷）2、仪器的干燥（1）晾干与烤干（2）吹干与烘干（3）气流烘干与快干3、常见玻璃仪器的使用（1）量筒与量杯（2）移液管移液管使用注意事项：应根据不同的需要选用大小合适的移液管，如取1.5mL的溶液，显然选用2mL移液管要比选用5mL移液管误差小；吸取溶液时要把移液管插入溶液，避免吸入空气而将溶液从上端溢出；移液管从液体中移出后必须用滤纸将管的外壁擦干，再行放液；不可用移液管直接从瓶中移取溶剂或溶液，剩余溶剂或溶液不可倒回贮液瓶，应作废弃物处理。（3）滴定管操作步骤：洗涤——涂凡士林——检漏——装入操作液——滴定管排气——滴定操作（4）容量瓶容量瓶使用前应检查容量瓶的瓶塞是否漏水，合格的瓶塞应系在瓶颈上，不得任意更换。容量瓶刻度以上的内壁挂有水珠会影响准确度，所以应该洗得很干净。称量的任何固体物质必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后才能转移到容量瓶中。容量瓶绝不应加热或烘干。容量瓶定容完再翻转摇匀，若翻转摇匀后定容，会因加的水或溶剂过多，导致溶液浓度偏小。天平的基本操作1、天平室规章制度（1）操作者工作时穿好工作服，班前班后整理好岗位卫生，保持天平、操作台、地面及门窗洁净。（2）操作者应熟悉分析天平的原理、构造和正确的使用方法，避免因使用不当和保管不妥而影响称量准确度或损伤天平某些部件。（3）所用分析天平，每年由市计量部门定期校正计量一次。任何人不得随意拆装其部件或改变其灵敏度。 （4）与本室无关人员不得随便入内，更不得随意操作使用天平。2、托盘天平用于精密度要求不高的称量。所附砝码是天平上称量时衡定物质质量的标准。使用注意事项：（1）称量前天平要放平稳，游码放在刻度尺的零处，调节天平左右的平衡螺母，使天平平衡。（2）称量时把称量物放在左盘，砝码放在右盘。砝码要用镊子夹取，先加质量大的砝码，再加质量小的砝码。（3）称量干燥的固体药品应放在纸上称量。（4）易潮解、有腐蚀性的药品（如氢氧化钠），必须放在玻璃器皿里称量。称量完毕后，应把砝码放回砝码盒中，把游码移回零处。3、电子分析天平用于精密度要求高的称量使用电子分析天平。被称物重量不得超过天平最最大载荷。若被称物较重，应先在粗天平上试称。使用注意事项：（1）每次称量前检查天平位置是否水平，零点偏差多少。（2）天平机构有任何损坏或不正常情况时，在未消除故障以前应停止使用。（3）被称物的温度必须和天平室的室温一致。（4）被称物须盛在干净的容器中称量，具有腐蚀性的蒸气或吸湿性的物质必须放在密闭的容器内称量。（5）被称物要放在天平盘的中央。（6）天平的前门不得随意打开。称量过程中只能打开左右两个边门。（7）使用完毕后清洁天平，断开电源，再用罩把天平罩好，必须登记使用情况后方可离开天平室。药品的取用和溶液的配制1、固体试剂的取用规则（1）要用干净的药勺取用。用过的药勺必须洗净和擦干后才能再使用，以免沾污试剂。（2）取用试剂后立即盖紧瓶盖。（3）称量固体试剂时，必须注意不要取多，取多的药品，不能倒回原瓶。2、液体试剂的取用规则（1）从滴瓶中取液体试剂时，要用滴瓶中的滴管，滴管绝不能伸入所用的容器中，以免接触器壁而沾污药品。从试剂瓶中取少量液体试剂时，则需要专用滴管。装有药品的滴管不得横置或滴管口向上斜放，以免液体滴入滴管的胶皮帽中。（2）使用胶头滴管“四不能”：不能伸入和接触容器内壁，不能平放和倒拿，不能随意放置，未清洗的滴管不能吸取别的试剂。（3）配制一定物质的量溶液时，溶解或稀释后溶液应冷却再移入容量瓶。 （4）配制一定物质的量浓度溶液，要引流时，玻璃棒的上面不能靠在容量瓶口，而下端则应靠在容量瓶刻度线下的内壁上（即下靠上不靠，下端靠线下）。（5）容量瓶不能长期存放溶液，更不能作为反应容器，也不能互用。（一般用于配制标准溶液的容量瓶最好专用）3、溶液的配制（1）配制溶质质量分数一定的溶液计算：算出所需溶质和水的质量。把水的质量换算成体积。如溶质是液体时，要算出液体的体积。称量：用天平称取固体溶质的质量；用量筒量取所需液体、水的体积。溶解：将固体或液体溶质倒入烧杯里,加入所需的水,用玻璃棒搅拌使溶质完全溶解。（2）配制一定物质的量浓度的溶液 计算：算出固体溶质的质量或液体溶质的体积。称量：用托盘天平称取固体溶质质量，用量筒量取所需液体溶质的体积。溶解：将固体或液体溶质倒入烧杯中，加入适量的蒸馏水用玻璃棒搅拌使之溶解，冷却到室温后，将溶液引流注入容量瓶里。转移：用适量蒸馏水将烧杯及玻璃棒洗涤2－3次，将洗涤液注入容量瓶，振荡，使溶液混合均匀。定容：继续往容量瓶中小心地加水，直到液面接近刻度2－3cm处，改用胶头滴管加水，使溶液凹面最di处恰好与刻 度相切。把容量瓶盖紧，再振荡摇匀。 4、溶液配制的注意事项（1）分析实验所用的溶液应用GB6682中规定的三级水配制，容器应用纯化水洗涤三次。特殊要求的溶液应事先作空白值检验。（2）溶液要用带塞的试剂瓶盛装，见光易分解的溶液要装于棕色瓶中，挥发性试剂瓶塞要严密，见空气易变质及放出腐蚀性气体的溶液也要盖紧，必要时用蜡封住。浓碱液应用塑料瓶盛装。（3）每瓶试剂必须有标明名称、规格、浓度和配制日期的标签。（4）配制硫酸、磷酸、硝酸、盐酸等溶液，都必须将酸倒入水中。配制时不可在试剂瓶中进行配制。（5）用有机溶剂配制溶液时，有时有机物溶解较慢，应不时搅拌，可以在热水浴中温热搅拌，不可直接加热，必须避免火源。（6）不可用手接触带腐蚀性或剧毒的溶液。剧毒废液必须经解毒处理，不可直接倒入下水道（7）一般溶液保存时间不可超过6个月，如果试剂发生浑浊变质，就必须废弃不得使用。5、溶液储存时可能的变质原因（1）玻璃与水和试剂作用后多少会被侵蚀（特别是碱性溶液），使溶液中含有钠、钙、硅酸盐等杂质。某些离子容易被吸附于玻璃表面，这对于低浓度的离子标准液更不可忽视。故低1mg/ml的离子溶液不适合长期保存。（2）由于试剂瓶密封不好，空气中的二氧化碳、氧气、氨或酸雾侵入使溶液发生变质。（3）某些溶液见光分解（硝酸银、汞盐），有些溶液放置时间长了会水解（铋盐、锑盐），有些溶液会受微生物的分解。（4）含有易挥发的组分，使其浓度降低。实验室常用基本操作技术1、重量分析操作技术（1）过滤过滤是利用滤纸、滤膜或滤器将溶液中的固态物质（悬浮物和沉淀等）进行有效分离的分析操作。常用的仪器：漏斗、滤纸和滤膜等。滤纸的选择：定量滤纸（无灰滤纸，≤0.08mg）漏斗的选择：颈长为15～20cm；锥体角度应为60°；颈的直径一般应为3～5mm；颈口处磨成45°角；滤纸的上缘应低于漏斗上沿0.5～1cm滤纸的折叠：四折法 ，三层一边外层撕下一角备用滤纸的安放：三层的一边放在漏斗出口短的一边，做水柱（2）干燥干燥是指除去样品，沉淀或试剂中所含水分或溶剂过程，常用烘烤，冷冻，化学和吸附等方法。必须根据被干燥物质的物理性质，热稳定性以及与水结合的形式选择干燥方法。常用的干燥剂和干燥设备干燥剂：无水氯化钙、无水硫酸钠、无水硫酸钙、浓硫酸、硅胶、活性炭干燥设备：电烘箱、红外干燥箱、热浴温度：一般都100℃~120℃之间称量称量是重量法的关键，在确定了天平精度的条件下，提高分析准确的关键是选择合格的称样量和使用正确的称量方法。称样量的选择：选择适宜的称样量是保证重量分析的重要条件之一，例如一般分析天平的称量误差为0.2mg（万分之一天平），或者0.02mg（十万分之一天平），为使称量相对误差小于0.1%，必须有适当的称样量。实验室常用安全操作一切劳动工作以人为本。保证化验人员的安全与健康、防止污染环境、保证化验室工作安全而有效的进行是化验室管理工作的重要内容。化验室安全包括防火、防爆、防毒、防腐蚀、电气安全和防止污染环境等方面。1、防止中毒、化学灼伤与割伤一切药品和试剂要有与其内容物相符的标签。严禁试剂入口以及用鼻子直接接近瓶口进行鉴别。鉴别时应将试剂瓶远离鼻子，用手轻轻煽动，稍闻即止。取用带腐蚀性的药品，如强酸、强碱、浓氨水、冰乙酸等，建议戴上防护手套。拿比较重的瓶子时，应一手托住底部，一手拿住瓶口。处理有毒有害的气体、有挥发性的药品及有毒有机试剂时（如氮氧化物、溴、氯、硫化物、汞、砷化物等），应在通风橱内进行。溶解氢氧化钠、氢氧化钾等药品时，因其会大量放热，故必须用耐热容器处理。浓酸浓碱必须在各自稀释后再中和。2、防火、防爆操作易燃物时必须远离火源，瓶塞打不开时，切忌用火加热或用力敲打。倾倒易燃液体时还必须谨防静电。加热可燃易燃物时，必须在水浴或者严密的电热板上缓慢进行，严禁用明火或电炉加热。蒸馏液体时，如果需要补充液体时，应先等其冷却后再补充。蒸馏易燃物时应先通水再通电加热。烘箱、电炉周围严禁放有易燃物或带挥发性的易燃液体。3、灭火发生火灾时不得大呼小叫、到处乱跑，应及时灭火。发生大规模火灾时，首先应快速从安全通道离开失火场所，安全后拨打119，不可单独冲入火灾现场灭火。发生局部火灾时，应立即切断电源，选择使用合适的灭火器灭火。身上的衣物着火时不可跑动。应迅速脱去衣物，或在地上打滚扑灭。灭火器不可对人脸。4、常用有毒有害化学物质的处理无机酸类：将废酸慢慢倒入过量的含碳酸钠或氢氧化钙的水溶液中或用废碱相互中和。中和后用大量水冲洗。氢氧化钠、氨水：用盐酸水溶液中和后，再用大量水冲洗。含氰废液：加入氢氧化钠使pH大于10，加入过量的3%的高锰酸钾溶液，使CN-氧化分解。含氟废液：加入石灰使生成氟化钙沉淀。5、常见化学试剂中毒应急处理二硫化碳中毒的应急处理方法：吞食时，给患者洗胃或用催吐剂催吐。将患者躺下并加保暖，保持通风良好。 有机磷中毒的应急处理方法：使患者确保呼吸道畅通，并进行人工呼吸。万一吞食时，用催吐剂催吐，或用自来水洗胃等方法将其除去。沾在皮肤、头发或指甲等地方的有机磷，要彻底把它洗去。三硝ji甲苯中毒的应急处理方法：沾到皮肤时，用肥皂和水，尽量把它彻底洗去。若吞食时，可进行洗胃或用催吐剂吐，将其大部份排除之后，才服泻药。苯胺中毒的应急处理方法：如果苯胺沾到皮肤时，用肥皂和水把其洗擦除净。若吞食时，用催吐剂、洗胃及服泻药等方法把它除去。氯代烃中毒的应急处理方法：把患者转移，远离药品处，并使其躺下保暖。若吞食时，用自来水充分洗胃，然后饮服于200毫升水中溶解30克硫酸钠制成的溶液。不要喝咖啡之类兴奋ji。吸入氯仿时，把患者的头降低，使其伸出舌头，以确保呼吸道畅通。 草酸中毒的应急处理方法：立刻饮服下列溶液，使其生成草酸钙沉淀：1.在200毫升水中，溶解30克丁酸钙或其它钙盐制成的溶液。2.大量牛奶，可饮食用牛奶打溶的蛋白作镇痛剂。乙醛、丙酮中毒的应急处理方法：用洗胃或服催吐剂等方法，除去吞食的药品。随后服下泻药。呼吸困难时要输氧。丙酮不会引起严重中毒。强酸（致命剂量1毫升）吞服时立刻饮服200毫升氧化镁悬浮液，或者氢氧化铝凝胶、牛奶及水等东西，迅速把毒物稀释。然后至少再食10多个打溶的蛋作缓和剂。因碳酸钠或碳酸氢钠会产生二氧化碳气体，故不要使用。进入眼睛时撑开眼睑，用水洗涤15分钟。沾着皮肤时用大量水冲洗15分钟。如果立刻进行中和，因会产生中和热，而有进一步扩大伤害的危险。因此，经充分水洗后再用碳酸氢钠之类稀碱液或肥皂液进行洗涤。但是当沾着草酸时，若用碳酸氢钠中和，因为由碱而产生很强的刺激物，故不宜使用。也可以用镁盐和钙盐中和。甲醛中毒的应急处理方法：吞食时，立刻饮食大量牛奶，接着用洗胃或催吐等方法，使吞食的甲醛排出体外，然后服下泻药。有可能的话，可服用1％的碳酸铵水溶液。

药品的取用和保存试剂试药的取用固体试药的取用液体试剂的取用试剂试药的存放试剂试药的取用试剂试药的取用在满足鉴别的前提下，从经济和环保上考虑，取用量应越少越好。如果没有说明用量，一般应按最少量取用:液体1 -2mL，固体只需要盖满试管底部。实验剩余的试剂试药既不能放回原瓶，也不要随意丢弃，要放入指定的容器内。固体试药的取用取用固体试药一般用药匙。往试管里装入固体粉末时，为避免药品沾在管口和管壁上，先使试管倾斜，把盛有试药的药匙(或用小纸条折叠成的纸槽)小心地送入试管底部，然后使试管直立起来，让药品全部落到底部。有些块状的药品可用镊子夹取。液体试剂的取用取用少量液体时可用胶头滴管吸取。取用较多量液体时可用直接倾注法:取用细口瓶里的试液时，先拿下瓶塞，倒放在桌上，然后拿起瓶子(标签应对着手心)、瓶口要紧挨着试管口，使液体缓缓地倒入试管。为防止残留在瓶口的药液流下来，腐蚀标签。一般往大口容器或容量瓶、漏斗里倾注液体时，最好用玻璃棒引流。注意：取用硫酸、硝酸浓氢氧化钠等腐蚀性较强的液体时，千万不能溅在手上或身上。另外，硝酸易挥发，应在通风处或室外使用。试剂试药的存放碘易升华且具有强烈刺激性气味，盛放在磨口的广口瓶里。浓硝酸、硝酸银见光易分解，应保存在棕色瓶中，贮放在黑暗而且温度低的地方。氢氧化钠固体易潮解，应盛放在易于密封的干燥大口瓶中保存;其溶液盛放在无色细口瓶里，瓶口用橡皮塞塞紧，不能用玻璃塞。

一、定义及范围化学试剂:在化学试验、分析、研究及其它试验中使用的各种纯度等级的化合物或单质统称为化学试剂。包括试验方法中用到的一般溶液、缓冲液、指示液以及标准溶液等等。相关标准：GB/T 601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》GB/T 602-2002《化学试剂杂质测定用标准溶液的制备》GB/T 603-2002《化学试剂试验方法中所有制剂及制品的制备》一、试剂纯度一般按用途可以分为通用试剂、高纯试剂、分析试剂、仪器分析试剂、临床诊断试剂、生化试剂、无机离子显色剂试剂等。有四种常用规格：1.优级纯或一级品(GR 精密分析和科学研究工作)；2.分析纯或二级品(AR 重要分析和一般研究工作)；3.化学纯或三级品(CP 工矿及学校一般化学实验)；4.实验试剂(L.P.)。大多数的试剂具有一定的毒性及危险性。对科研试剂的加强管理，不仅是保证分析结果质量的需要，也是确保人民生命财产安全的需要。试剂应根据毒性、易燃性、腐蚀性和潮解性等不同的特点，以不同的方式妥善管理。此外，还有基准试剂、色谱纯试剂、光谱纯试剂等。基准试剂:主要成分含量在99.5%-100%，杂质含量低于一级品或与一级品相当，是用于标定容量分析标准溶液的标准参考物质，可作为容量分析中基准物使用，也可精确称量直接配制标液。1、要求:组成与其化学式严格相符。纯度高，级别一般在优级纯以上。状态稳定，可以长期保存。参加反应时，按反应式定量地进行，不发生副反应。有较大的分子量，在配制标准溶液时可以减少称量误差。2、有些高纯试剂和光谱试剂虽然纯度很高，但只能说明其中杂质含量很低，其主要成分含量可能达不到99.9%及以上，这时就不能用作基准试剂。色谱纯:进行色谱分析时使用的试剂，在色谱条件下只出现指定化合物的峰，不出现杂质峰。二、化学试剂安全存放和使用分类1. 易燃易爆化学试剂:乙mi、苯、丙酮等；2. 有du化学试剂:氰化钾、三氧化2砷等；3. 腐蚀性化学试剂:硫酸、溴、苯酚等；4.强氧化性化学试剂:硝-酸钾、高氯酸、五氧化2磷等。安全存放1.存放在通风、干燥、冷暗的环境。2.按照液体、固体分开存放。强酸、强碱试剂分开存放；氧化性还原性分开存放并做好标记。3.剧毒和易制毒试剂应专人保管，使用后记录用量。4.易燃易挥发试剂除应盖好内塞外，还应用胶带密封。5.生物制品、酶类制剂应该避光，冰箱低温保存。安全使用1.配制过程中要在通风橱内进行，佩戴好防护用具。易燃易爆品要远离火源，远离高温环境，易爆品轻拿轻放，避免震动;强腐蚀性试剂配制好后，如温度较高应降温处理，避免用手直接接触;配制易挥发性试剂决不可对准脸部，尤其是眼睛。2.配制试剂过程中，操作人员不能随便离开现场，直至配制完毕。3.操作过程中严格执行操作规范，熟知各类试剂的化学性质，避免发生反应，产生危险。四、常用试剂分类1.通用试剂：-般试剂、缓冲溶液、指示剂、其他2.标准试剂3.制品常用试剂分类-缓冲溶液缓冲溶液指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。常见的缓冲体系有:1、弱酸和它的盐(如乙酸-乙酸钠)。2、弱碱和它的盐(an水-氯化铵)。3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐(如NaH,P04-Na2HPO4)的水溶液组成。常用试剂分类指示剂容量分析中用来指示达到滴定终点的物质。1. 酸碱指示剂：指示溶液中H+浓度的变化，是一种有机弱酸或有机弱碱，其酸性: 和碱性具有不同的颜色；2.金属指示剂：络合滴定法所用的指示剂，指示终点的原理是在一定pH值下，指示剂与金属离子络合，生成与指示剂游离态颜色不同的络离子。等当点时，滴定剂置换出指示剂，当观察到从络离子的颜色转变为指示剂游离态的颜色时即达终点；3.氧化还原指示剂：为氧化剂或还原剂，它的氧化态与还原态具有不同的颜色，在滴定中被氧化(或还原)时变色，指示出溶液电位的变化;4.沉淀滴定指示剂。主要是Ag+与卤素离子的滴定。常用试剂分类其他试剂及制品1.实验室洗液:铬-酸洗液、氢氧-化钾-乙醇洗液、硝酸洗液等。2.无二氧化碳的水、无氧的水等。3.饱和溶液:碘化钾饱和溶液。4.乙酸铅棉花5.百里草酚蓝试纸、甲基紫试纸等。

关于添加胎牛血清（FBS）用于生产细胞衍生药物产品的安全问题引发了人们对替代胎牛血清的呼吁。在此，有人对FBS的四个新上市替代品进行了比较：一种为Cell-Ess®，一种是以GroPro®出售的人血小板裂解物，以及两种含有不同比例的新生牛血清生长因子的成体牛血清，称为Liporo®和FetalGro®。研究人员先用含有10％FBS的培养基中培养内皮细胞系（C2BBe1）和神经元细胞系（SHSY5Y），在细胞接近汇合时，在接下来的25天内逐步将FBS替换为上述替代品。然后细胞被染色，计数并比较细胞活力、细胞迁移和以及立体生长情况。结果与含10％FBS相比，C2BBe1和HRA-19细胞系无法在10％Cell-Ess®中增殖，但在10％GroPro®或10％FetalGro®中却生长良好。使用SH-SY5Y细胞，只有FetalGro®才能达到FBS的功效。它们均低于11种不同品牌的FBS（阳性对照），但仅用FBS培养5天就转换为血清替代物后，在内皮细胞HRA-19中，11种血清中有4种支持的细胞增殖率低于参考FBS。由于血小板衍生的GroPro®在非FBS生长补剂中脱颖而出，似乎是hao的，但也仅是使细胞增殖，而不能诱导细胞生长为立体的球状。与FBS相比，细胞的生长也仍然较慢。因此，该研究可看出，FBS目前还没有找到完美的替代品。当然，胎牛血清也需要选择品质较好的品牌。内毒素、促细胞生长能力、病毒检查、总蛋白等都是可以观察的指标。当然，最好还是先试用一下，保证满意后再长期试用。远慕生物长期供应各种动物血清：①动物血清系列：胎牛血清，特级新生牛血清，优级新生牛血清，标准新生牛血清，标准马血清，特级马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，鸡血清，猪血清，大牛血清，小牛血清，狗血清，驴血清，大鼠血清，小鼠血清，豚鼠血清，巴比西鼠血清。②血浆系列：胎牛血浆，新生牛血浆，大牛血浆，小牛血浆，兔血浆，马血浆，山羊血浆，绵羊血浆，鸡血浆，猪血浆，狗血浆，驴血浆，大鼠血浆，小鼠血浆，豚鼠血浆。③脱纤维全血系列（玻璃瓶和Pet塑料瓶）：新生牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血，兔血，兔红细胞（20%），绵羊红细胞（20%），鸡红细胞（20%），兔红细胞（4%），绵羊红细胞4%，鸡红细胞（4%）。④抗凝全血系列：新生牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血⑤裂解全血（脱纤维裂解，抗凝裂解）脱纤维裂解血：小牛血，大牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血抗凝裂解血：小牛血，大牛血，山羊血，绵羊血，马血，驴血

　　1、容量瓶的校正　　将被校正的容量瓶洗净干燥，取烧杯盛放校正用水，水及容量瓶同放于天平室中20分钟，记下水温，先称空容量瓶重，然后加水至刻度，注意不可有水珠留在刻度线以上，否则应用滤纸条吸干，塞上瓶塞，再称定重量。然后用实验温度时1mL水的重量除水重，即得容量瓶容积的毫升数。各容量瓶的实际体积可用氢氟酸直接刻于适当位置，也可将容量瓶编号后，记录于专用的记录本上备用。　　2、移液管的校正　　取一干燥锥形瓶，精称，然后取内壁已洗净的移液管，按移液管的使用方法，吸取水至刻度，将水入已称定重量之锥形瓶中，精称，记下水温，以用实验温度时1mL水的重量除水重，即得该移液管的容积。各容量瓶的实际体积可用氢氟酸直接刻于适当位置，也可将容量瓶编号后，记录于专用的记录本上备用。　　3、注射器、量筒、滴定管、刻度吸管的校正　　取干燥的50ml锥形瓶，称定重量，然后将被校正的注射器、量筒、滴定管、刻度吸管装入水至刻度零处，记下水的温度，从注射器、量筒、滴定管、刻度吸管中放下一定体积的水至锥形瓶中（根据滴定管大小及管径均匀情况，每次可放1、2、3、5或10mL），精密读取读数至小数第二位，称定锥形瓶中水的重量，然后再放一定体积再称重，如此一段一段的校正，然后用水在试验温度时的重量除放出水的重量，即得到真实容积。结果可以列成表已备后用。　　较正实验每段必须重复两次，每次校正值的误差应小于0.02g。校正时必须控制滴定管的流速，使每秒钟流下3～4滴（30秒钟5mL），读数必须准确。　　4、校正容器时注意事项　　4.1所用水至少须在室内放置一小时以上。　　4.2待校正的仪器，应仔细洗净（常用清洁液洗涤），洗至内壁应完全不挂水珠。滴定管和移液管不必干燥，容量瓶必须干燥后才能校正。　　4.3校正时所用小锥形瓶，必须干净，瓶外须干燥。　　4.4在开始放水前，滴定管或移液管jian端与外面的水必须除去。　　4.5如温室有变化，须在每次放下水时，记录水的温度。　　4.6一般每个仪器应校正二次，即做平行试验。　　4.7称量水重所用天平的精密度应达到所称水重有五位有效数字的程度。例如校正500mL的容量瓶，可用能称准至10mg的天平。校正50mL的滴定管，则应用称准至1mg的分析天平。

　　无菌室实验操作过程中要注意什么？有哪些必须遵守的条件？今天就来跟大家详细解答下！　　一、无菌室的级别：　　根据空气洁净度的不同，无菌室可分为哪几个级别一般情况下，无菌室的等级有百级，千级，万级，十万级，百万级等等。　　净化等级一般分为100级、1000级、10000级、100000级，现在2010年版的GMP 净化车间已经不用这个叫法了，分为ABCD级别，分别相对应于98版的几个级别，通过检测区域内的尘埃粒子数、浮游菌数、沉降均数评价净化级别，各个级别 有不同的要求，净化等级分静态、动态两种。　　无菌室设计建设要点：　　无菌室内的地面、墙壁必须平整，不易藏污纳垢，便于清洗。工作台的台面应该处于水平状态。无菌室和缓冲间都装有紫外线灯，无菌室的紫外线灯距离工作台面 1 米。工作人员进入无菌室应穿灭过菌的服装，戴帽子。　　当前无菌室多存在于微生物工厂，一般实验室则使用超净台。超净台其主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃。通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流动的气帘防止外部带菌空气进入。　　在条件较困难的地方，也可以用木制无菌箱代替超净台。　　无菌箱结构简单，便于移动，箱正面开有两个洞，不操作时用推拉式小门挡住，操作时可以将双臂伸进去。正面上部装有玻璃，便于在内部操作，箱内部装有紫外线灯，从侧面小门可以放进去器具和菌种等。　　二、无菌室操作规范　　1.无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。　　2.严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染者应停止使用。　　3.无菌室应备有工作浓度的消毒液，如5%的甲酚溶液，70%的酒精，0.1%的新洁尔灭溶液，等等。　　4.无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求。　　5.需要带入无菌室使用的仪器，器械，平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。　　6.无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风。操作完毕，应及时清理无菌室，再用紫外灯辐照灭菌20分钟。　　7.无菌室应每月检查菌落数。在超净工作台开启的状态下，取内径90mm的无菌培养皿若干，无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15mL，放至凝固后，倒置于30-35℃培养箱培养48小时，证明无菌后，取平板3-5个，分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露30分钟后，倒置于30-35℃培养箱培养48小时，取出检查。100级洁净区平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级洁净室平均不得超过3个菌落。如超过限度，应对无菌室进行彻底消毒，直至重复检查合乎要求为止。

分离时选择了合适的蛋白柱，有时往往不能成功地完成蛋白的分离，同一根蛋白分离柱在不同的使用者手中可能会有不同的柱寿命及分离效果，正确的使用蛋白柱和正确的日常维护是保证成功分离蛋白及延长柱寿命的关键。不论使用什么类型的蛋白柱，首先必须对其填料的性能有基本了解。如该柱适用什么样的溶剂，什么类型的样品，流速及耐压范围等，GAT提供的各种类型的蛋白柱，在柱箱内均有详细的说明书，使用柱子前，务必要仔细阅读，以保证正确使用这些柱子。下面就蛋白分离中常出现的问题进行讨论。①样品不保留：在用离子交换柱分离蛋白时，流动相的pH值对保留值影响很大，当选用阴离子型蛋白分析柱时，如#####若流动相的pH值小于蛋白的pI值时，蛋白分子阳离子状态，则在柱上没有保留，只有当流动相的pH值大于蛋白的pI值时，蛋白分子呈阴离子，才能在阴离子交换柱上得到保留。另外，当流动相或样品中的离子强度过大时，也会造成蛋白在离子交换柱上不保留。此外，上样量过大，亦会使蛋白样品保留变弱，一般样品的上样量不应超过该填料结合蛋白量的20%，在选用GPC柱时，应特别注意填料的孔径及相应的可分离蛋白的分子量范围，若蛋白的分子量超过填料的孔径极限则蛋白样品也不保留。在用反相色谱分离蛋白时，流动相中有机溶剂的比例会影响蛋白的保留值。有机溶剂比例过高，会使蛋白的样品与填料的作用变弱而过早地洗脱。流动相中的三氟乙酸可作为离子对试剂和 pH调节剂，有利于蛋白的保留。②回收率（质量回收率）低蛋白质量回收率低往往发生在使用凝胶过滤柱时，特别是以硅胶为基质的凝胶蛋白分析柱时，尽管硅醇基已经过双醇封口，但残留的硅醇基仍会与蛋白的碱性基团发生非GFC效应，造成回收率低，分离度差等现象,解决这一现象的方法是在流动相（通常是水）中加入0M-0.3M盐作为改性剂以减少这种非GFC效应。③柱压过高柱压过高的原因在于柱入口的堵塞及填料间的缝隙的减小或堵死，这些原因有：非硅胶填料的颗粒膨胀（主要是由于使用过高比例有机溶剂引起）；来自样品，流动相的颗粒堵塞、细菌生长，流速过高等，为防止柱压过高，应使用符合要求的流动相组成。样品，流动相使用前严格过滤。为了保存时防止细菌生长。以硅胶为基质的柱子可使用20%有机水溶液保存。其它柱子在保存液中加入0。02%的叠氨钠。④性能改变蛋白柱在使用一段时间后，其性能会有所改变（保留值变化，柱效下降等）。原因之一是被分离样品中细胞碎片，类脂，酸等的污染，对聚合物基质的柱子可用0.1-1.0N NaOH溶液清洗，注意以硅胶为基质的柱子（如Protein Pak凝胶柱）不能用NaOH清洗。

1，透析袋浓缩法利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6000－12000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%－40%浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。主要用于更换蛋白质的缓冲液，有透析袋即可，不需要特殊的仪器。2，冷冻干燥浓缩法这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。在冷冻状态下让扬品种的液体升华3，吹干浓缩法将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。4，超滤膜浓缩法此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法更不易引起变性，不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的。5，凝胶浓缩法选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。6，浓缩胶浓缩法浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80%～90%。比凝胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。7，丙酮沉淀法：试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。8，免疫沉淀法：通过免疫沉淀法，用蛋白质特异性能够定量能够分离目的蛋白。有三个步骤组成：首先将特异性抗体加入细胞提取物，第二步加入经化学固定的金黄色葡萄球菌，以确保形成大量沉淀。这些细菌通过蛋白质A和抗体形成复合物，蛋白质A与免疫球蛋白的Fc部分有高度的亲和性。或者说，纯化的蛋白A结合 Sephrarose树脂，为从细胞提取物中分离出抗原抗体复合物，提供一个固体基质。最后通过洗脱，除去尚未沉淀的杂质。为了除去已破碎的或固定差的细胞，在用于免疫沉淀（作用）之前可以与纤细地金黄色葡萄球菌细胞，如果要用蛋白质ASephrarose树脂,参考厂家说明书。9，硫酸铵沉淀法：利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析），选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济。10，(低温)有机溶剂沉淀法：强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮等。注意：Mg2++离子，pH值。11，聚乙二醇（PEG）沉淀法：PEG是一个水溶性非离子多聚体，使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀。

1.生物大分子的纯化凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。2.分子量测定外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：Vt＝Vo＋Vi设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。Kav＝－b lg MW＋cVe＝－b’ lg MW＋c’由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶过滤测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶过滤不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶过滤测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶过滤的线性范围之内。3.脱盐及去除小分子杂质利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。4.去热源物质热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶过滤的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶过滤是一种简单而有效的方法。5.溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。6.蛋白质的复性为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。两个重要的因素影响凝胶过滤层析复性蛋白质的收率：第一个是变性条件下蛋白质的上样，第二个是复性缓冲液中蛋白质结构的变化。另外，蛋白质上样量也会影响蛋白质复性收率，因为在层析柱的顶端会因为上样量的增加而发生结构的聚集。为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。线性梯度在凝胶过滤层析中可能经常会遇到，但是有时有些蛋白质可能在某些变性剂浓度下不稳定，在梯度过程中需要尽快跨越这些浓度过程；有时蛋白质折叠的限速在某些变性剂浓度，此时需要增加此段的时间，所以在凝胶过滤层析中可以设计不同类型的梯度形式，以满足不同的蛋白质的复性需要。

一、目的要求1、学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。2、学习噬菌体效价测定的基本方法。二、基本原理因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现奇特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易的分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以，（a）在液体培养基内可使混浊菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体；（b）在宿主细菌生长的固体琼脂  平板上，噬菌体可裂解细菌而形成透明的空斑，称噬菌体斑（图1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌  噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再进一步纯化。噬菌体的效价就是1 毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌  的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌体斑，因此，能进行噬菌体的计数。二、器材37℃培养18 小时的大肠杆菌斜面，阴沟污水；本实验均用普通肉膏蛋白胨培养基500 毫升三角瓶内装三倍浓缩的液体培养基100 毫升，试管液体培养基，琼脂平板，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，没管4 毫升），底层琼脂平板（含培养基10 毫升，琼脂2%）大肠杆菌 18 小时培养液，大肠杆菌噬菌体 10-2 稀释液（用肉膏蛋白胨液体培养基稀释）含 0.9 毫升液体培养基的小试管 4 支，肉膏蛋白胨琼脂平板（ 10 毫升培养基， 2 ％琼脂，作底层平板用），含 4 毫升琼脂培养基的试管（ 0.7％琼脂，作上层培养基用）5 管，灭菌小试管 5 支，灭菌 1 毫升吸管10 支，48 ℃ 水浴箱等。灭菌吸管，灭菌玻璃途布器，灭菌蔡氏细菌滤器，灭菌抽滤器，恒温水浴箱，真空泵等。

食品中霉菌检测标准是GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，它可以定量测定食品中霉菌数量，用相应的产品标准判定食品中霉菌是否超标。检测中的注意事项：1、 取样的代表性2、 取样工具的无菌空气中霉菌的孢子含量很高，所以，取样的工具、容器等要经过严格的高压灭菌。3、 检样的方法(1)由于霉菌易被携带，所以，检样时操作人员应尽量避免自身携带的可能。(2)样品的均质及充分振摇。因为有些孢子是连成串的，故均质和振摇能使其充分散开，同时，在各梯度连续稀释时，也要用灭菌吸管反复吹吸几次，使孢子充分散开。4、培养温度和时间培养温度 25-28℃培养，5 天后观察。霉菌检验中常用的培养基：孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂等。5、检样中常见的问题(1) 不同稀释度计数结果不相同；(2) 不生长或生长很好连成片无法计数；原因：①稀释时未经反复振摇，吹吸，导致孢子未充分散开，影响了计数的结果。②由于培养基不适宜，PH 值低等，致使生长较慢。③观察时间的掌握。真菌生长较慢，故需 5d 后才能观察出结果。微生物操作中常见问题的讨论与分析1、 划线获得单个菌落的方法划不出单个菌落的原因：(1) 平板上有过多的水分；(2) 划线时接种环未经反复灼烧；(3) 多区划线，三区或四区划线。2、 涂布和倾注的区别：涂布利于观察，但由于涂布棒上会带有少量的菌液，可能影响计数的准确性；倾注更为准确，但不利于观察菌落的状态。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现，对霉菌计数来说，涂抹法有以下几方面优越于倾注法：①培养出的霉菌菌落数较多；②培养所需的时间较短；③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就受影响，而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。3、培养基的选择培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO)，其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长，而CAO则适合于高渗性霉菌生长，酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现，有些常见的耐高渗性霉菌，如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长，而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方：蔗糖400g，麦芽提取汁20g，酵母提取汁5g，琼脂20g，氯霉素50mg，蒸馏水1000mL；DG18琼脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝ji苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，PH6.5)上则正常生长。孢子、形态特征发育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长，因此，若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌，将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等，更有必要同时采用M40Y或DG18。由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素，危害较小，而有的菌株即使污染数量不多，但其产生的霉菌毒素却危害较大，因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此，国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝ji苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。4、 培养基配制时应注意的问题：(1)灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量；(2)琼脂培养基不能反复溶化。反复溶化会破坏培养基中的营养成分；(3)培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏；(4)含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。5、 平板的保存：大多数平板如 VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。6、 产品的保存：(1) 干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。(2) 亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，避免水浴加热。(3) 抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度的下降。(4) 兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。7、 观察时间的掌握：按SN、GB 等标准或培养基的使用说明所述时间进行观察，时间过短或时间过长，单菌落的特征都不会很明显。如单增李斯特氏菌显色培养基，时间短单菌落看不到卵磷脂环，时间长绵羊李氏菌也会产生沉淀环。OXA、PALCAM的观察也如此，时间过长，李氏菌使整个平板成黑色，不利于观察单个菌落。8、 添加剂的添加：(1)温度的掌握。卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。(2)定量。过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。8、 培养温度的掌握：(1)真菌类。25-28℃培养(2)细菌类。李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在 30℃左右。(3)其他一般在 36℃左右。9、 接种方法：常用的方法主要有划线、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。10、革兰氏染色方法：染色时间的掌握、冲洗的方法。11、生化实验：(1)接种的方法(2)氧化型和发酵型实验操作(3)阳性菌种的对照(4)接种前的纯化。挑取单个菌落进行一系列的生化。12、最适计数范围霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。我们对这方面作了一些观察研究，首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/mL的孢子悬液，并用血球计数器在显微镜下准确计数，然后将孢子悬液作10-1~10-6倍稀释，吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA，25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示，大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果蕞接近；有近一半的菌株，每个平板含50~100个菌落已较难计数，而大部分菌株，超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别，因此，应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围，可在培养基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，庆大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。13、关于杀菌的几个概念：(1)抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。(2)死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。(3)防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物fu败或防止食物霉变。(4)消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有bing原微生物的一种措施，它可以起到防止感染和传播的作用。(5)灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有bing原微生物的一种措施。

一、培养基的制备正确制备培养基时微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分，尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时,应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置。记录所有相关数据，如质量/体积、pH、制备日期、灭菌条件和制备人员等。使用各别成分制备培养基时,应按照配方准确配制,记录所有细节信息,如；培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等,以便潮源。1.水除特定要求,实验室用水的电导率在25℃下应不高于25uS/cm(相当于电阻率≥0.4MΩcm)。微生物污染应不超过103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。应根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期检验微生物的污染。2.称量和复水称量所需量的脱水培养基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物质的培养基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培养基结块)后再加水至所需的量。3.溶解和分装脱水培养基加水后适当加热,并不搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热溶解前应浸泡几分钟。4.pH的测定和调整用pH计测定pH,必要时在灭菌前调节pH，除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25℃时,要求pH的变化不超过0.2pH单位.通常使用浓度约为40g/L(约1mol/L)的氢氧hua钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L)的盐酸溶液调节pH。如果灭菌后调节pH，溶液需灭菌。注:商品化培养基在高压灭菌前后pH可能发生明显变化,但使用蒸馏水或去离子水时,灭菌前无需调节pH。5.分装将配置好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积至少为体积的1.2倍。6.灭菌①概述培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。有些培养基无需高压灭菌,可煮灭菌。如，含亮绿的肠道菌培养基对光和热特别敏感，应在煮沸后快速冷却，避光保存。同样，一些试剂则不需要灭菌，直接使用(参见相关标准或生产厂商的使用说明）。②湿热灭菌湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行。高压霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培养基的体积超过1000mL，要对灭菌条件进行适当的调整。所有操作均要按照标准和使用说明的规定进行。注：大容量培养基（＞1000mL）灭菌时可能会造成过度加热。加热后应采取适当的方式冷却，防止沸溢。这对大容量培养基和敏感性培养基（如含亮绿的培养基）是非常重要的。③过滤灭菌过滤灭菌可以在真空负压或正压条件下进行。使用无菌设备和0.2um孔径的滤膜。将过滤装置的各个部分消毒灭菌,或使用预消毒设备。一些滤膜上附着蛋白质或其他物质(如抗生素)。为达到有效过滤,应事先将滤膜用无菌水润湿。④监测应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。7.添加剂的制备制备含有有毒物质(特别是抗生素）时应小心操作，避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。采用适当的预防措施并小心按照产品使用说明操作。不要使用过期的试剂；抗生素工作溶液现配现用；批量配置的抗生素溶液分装后向冷冻保存，但解冻后的贮存溶液不可再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的相关资料，也可由使用者自行测定。二、培养基配置中常见的问题1.培养基的pH什么时候测？用什么测？怎么测？答：对于培养基应该灭菌前测定和调整，灭菌后在测定，如果范围超出正负0.2则培养基品质不良。2.灭菌后的培养基是否都要测pH值？如何测定pH值？答：每个制备批次的培养基都应测定pH，可采用pH试纸或pH计测量。3.稀释液灭菌后pH值是否有变化？有何影响？（如pH7.0氯hua钠-蛋白胨缓冲液，pH6.8无菌磷酸盐缓冲液）答：一般pH有下降现象，约0.2左右，不同培养基pH变化可能不同。4. 孟加拉培养基是否可以取代玫瑰红钠琼脂进行培养霉菌和酵母菌？答：根据中国药典，采用玫瑰红钠琼脂。5. 配制PH值7.0氯hua钠-蛋白胨缓冲液时有时因为高压灭菌器灭菌过程温度过高而导致培养基混浊了，这种情况缓冲液还能用吗？答：建议按正常温度灭菌，混浊培养基建议不要使用。6.含琼脂培养基在冷藏中形成冰晶怎么处理？销毁还是加热再用？答：建议不要使用。7.融化的培养基为什么不能再冷水中冷却？答：防止受热不均引起结块。8.灭菌后，灭菌锅需自然冷却降压才可以打开，这段时间是否会造成过度灭菌。答：自然冷却过程已经计算在正常灭菌时间内了，不会造成过度灭菌。9.培养基所用器具若使用湿热灭菌，是否必须待干燥后才可以使用？若烘干或其它方法，中间过程怎样防止微生物污染？答：如果是马上使用且不是用于非水溶性供试液的制备及实验，不一定要烘干；否则，应干燥后使用，灭菌及干燥尽量在同一锅里进行，或用纱布和牛皮纸包扎紧密。10.培养基的避光储存，是否配置好的培养基其全部放避光储存？答：最好都避光保存。无条件时，光敏感的培养基一定要。11.商品培养基干粉说是加蒸馏水溶解，实际操作是否可以用纯化水或注射用水？答：只要不含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质的水均可。12.培养基及器具灭菌可否同一设备同灭菌时间进行灭菌？答：蕞好分开灭菌，条件不允许时可同炉灭菌，前提是都是洁净无污染的。13.培养基的保温能否用60℃的培养箱，它与45℃—55℃水浴锅保温方法有何不同？答：可以用恒温培养箱保温，但保温温度一般是50℃左右，且时间不能过长，一般是不超过4小时。14.培养基的贮存是否需要放置于2—10℃冰箱内？答：需冷藏保存的培养基外包装上会写明。15.培养基灭菌后成份会有所蒸发减少，如何处理这个问题？答：正常情况下蒸发量较少，可忽略不计。16.培养基融化后出现浑浊是有哪些方面的原因引起的？应如何避免？答：可能的情况有1.培养基配置用水不符合规定；2.灭菌过程温度升温慢或降温慢；3.培养基储存不当；4.融化时沸腾时间较长等。17.准备好的培养基有效期如何验证？答：定期取出培养基验证其无菌性，促生长能力等方面。18.培养基配制好灭菌后，在高压容器中保温降至50℃左右，可不可行？答：建议最好不要，避免过度受热。19.脱水培养基对湿度是否有要求？多少适宜？答：按要求室温干燥环境储存即可。20.培养基pH值测定温度在25℃，这个温度应怎么控制？比如固体培养基，固体培养基使用过程中还能调节pH值吗？答：可水浴控制培养基温度。21.配制培养基过程中，按说明书称定量，加规定的纯化水，煮沸溶解，为了避免煮沸过程总减少水分，是否要在配制过程适当增加水?比如陪硫乙醇酸盐流体培养基。答：可适量增加，自己掌握。22.商品培养基一定要当天配当天用吗？可否在一周内用完？答：不是即配即用的培养基的话，储存得当，可以使用。23.称量培养基时，注意不要吸入粉末，这粉末是指何物？答：就是你所称量的干粉培养基 ，因为培养基的粉末对呼吸道有刺激作用，而且培养基中的某些成分，如亚shai酸盐、叠氮hua钠、乙酰胺等，长期吸入并在体内累积到一定量会对人体健康有危害。所以培养基配制称量需做好个人防护，且最好选择少粉尘环保型颗粒培养基。24.煮培养基，用不锈钢锅在电磁炉上煮可行？硫乙醇培养基是否要煮沸？如何煮沸？用不锈钢锅在电磁炉上煮沸可行吗？可不可以水浴煮沸呢？答：硫乙醇应煮沸，量大时，我实验室用不锈钢锅在电磁炉上煮沸。不建议水浴煮沸，因为水浴煮沸琼脂粉很难溶，导致琼脂分装不均匀，前段分装的琼脂含量少，后段分装的琼脂含量高，导致有的管或瓶中的凝固。25.如培养基在高压灭菌器中温度需自然下降20度才开盖吗？答：高温灭菌器有安全阀，温度下降到安全阀可打开时将培养基取出室温冷却，各型号灭菌器安全开盖温度不尽相同。

由于elisa试剂盒有着准确性高、灵敏度高、特异性强的诸多优点，深受广大师生朋友的喜爱。而现试剂盒种类颇多，产品的选择成为了实验前的重点事项。那么如何选择合适的elisa试剂盒呢？下面远慕生物带大家了解 一下！一、检测方式如今检测Elisa试剂盒有许多途径，我们可以根据自己的偏好进行选择。一般Elisa检测的是酶促反应的可溶性产物，抗体上结合有相应的酶，而反应体系中添加有相应的底物。这种酶促反应生成具有特征性的颜色，可以通过分光光度计进行检测，碱性磷酸酶ap也是一种常用酶。酶可以结合在一抗上，也可以结合在二抗上，还可以使用链霉亲和素标记的酶与亲和素标记的一抗结合。此外Elisa结果检测还包括放射性检测、荧光检测、化学发光或显色法检测等。二、实验类型虽然有多种类型，不过它们都有一个共同特点，就是进行抗原捕获。一般捕获形式包括将抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗体进行捕获。in-cell Elisa和酶联免疫斑点elispot是两种特殊的类型，in-cell Elisa需要将微孔板中培养的细胞进行固定和通透化，然后再用抗体原位检测。elispot有点像蛋白印迹western blot，先在带膜的微孔板中培养细胞，然后在膜上检测细胞分泌的抗原形成斑点。此外，我们还需要根据自身需要选择96孔板或是384孔板进行Elisa实验。三、抗体类型单克隆抗体和多克隆抗体都能够用于Elisa检测，实际上有时候二者结合效果更好。例如，对于双抗夹心法而言，用多抗进行捕获而单抗进行检测有时更有帮助。多抗能够确保捕获所有抗原，随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。四、交叉反应如果抗体间发生冲突或交叉反应就会影响整个实验的特异性。其中抗体来源所带来的兼容性就是交叉反应的一个因素。尽管现在购买源自指定动物的抗体越来越容易，我们仍有必要确认一下是否会产生交叉反应的问题。在用双抗夹心法进行Elisa检测时，检测用的二抗必须特异性针对检测一抗，而不能与捕获抗体起反应。如果检测用二抗与捕获抗体结合，实验特异性就会大打折扣。通常我们选用源自不同宿主的捕获抗体和检测一抗，来避免上述问题。

生化检验中的各种空白的概念：对所谓“试剂空白”“样本空白”“水空白”“杯空白”等“空白”名词，有些同行可能感到困惑。特此汇集了一下各种言论并结合自己的理解，总结如下，希望大家指正和补充：1、试剂空白：由于生化测试测量的吸光度为相对吸光度，所以从理论上说，所有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光度扣除。试剂本身的吸光度就是试剂空白。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量，把样本换成蒸馏水来测量。在传统手工方法中，每次测定都要做至少三个管：测定管、标准管、空白管。其中空白管是试剂加蒸馏水，测出来也就是试剂空白。因为操作环境、仪器状态、试剂稳定性等变异，所以要求每次都要测定试剂空白，称为实时试剂空白。在全自动分析仪上，大体上是模拟手工操作。但许多全自动分析仪为追求速度，在设计上采用一些折中方法来测定试剂空白。以日立全系列生化仪为例。该系列分析仪是做不了实时试剂空白，因为它们全是先加入样本后加试剂，为了折中，只好在定标时做一个试剂空白，保存起来，需要扣除试剂空白时再减这个预先保存的值。这种做法，对于比较稳定的试剂来讲，对结果影响不大。通俗的讲，日立的仪器工作流程中首先是将标本加入到比色杯中，然后依次加入R1试剂、R2试剂，所以试剂空白在每个测定项目曲线中是无法看到的。但是7170从CALIBRATION中是可以看到的，S1ABS就是代表试剂空白吸光度，在CALIBRATION画面里的下方找到ReactionMonitor（反应监察），其中STD（1）就是代表试剂空白反应曲线。为了减小误差，日立仪器会连续做两次测定，所以你看到FIRST和SECOND两条，计算时是取他们的平均值。做试剂空白目的之一就是观察试剂是否稳定，积极采取措施纠正。对于日立的这种试剂空白测定很多仪器都采用这种方法，也叫做试剂空白校准。总的说来，自动生化仪上的试剂空白一般表现为零点吸光度，该吸光度是通过校准确立的。2、样本空白：由于溶血、脂血、黄疸等情况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可以去除这方面的影响。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐水来进行测量。自动生化仪上，很难界定样本空白。与消除样本空白有关的大约有如下几点：a）在双试剂测定时，加入试剂1和样品后的吸光度可一定程度上扣除样本空白，所以有单试剂不能扣除样本空白的说法。b）现在优质的试剂的抗干扰能力都比较强，比如有些双试剂，R1加入后先和样本孵育一段时间，将血红蛋白、脂肪、胆红素等反应掉，再加入R2开始测定反应。在一定范围内都可以消除样本空白。c）现代全自动生化仪大多采用双波长测定。双波长测定的原则是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征，选择两个波长和，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光系数有显着差别。以两波长分别测定分析溶液的吸光度，以两个吸光度值之差（△A）计算。这也可以扣除一部分样本空白。d）有些仪器，例如日立系列，有专门的“血清信息”功能的设置。做法都是单独占用一个空白通道来计算，这也叫做样品空白校准。3、水空白：比色杯在加入水以后的吸光度。水空白的意义主要是对光路系统进行检查和校正，如光源，比色杯等，同时在计算中起到消除“杯差”的作用。日立7060中的CellBlank（杯空白）测定的就是水空白。

绝大多数ELISA试剂盒试验人员最头疼的疑问，莫过于试验成果不抱负。本来做科研试验，即是这么在不断探究中寻求真理。很难有人能够的试验成功。可是，咱们在做试验过程中能够尽量防止哪些常犯的过错呢？今天让咱们一同来看一下，影响ELISA试验成果不抱负的原因有哪些？操作前应对试验的物理参数有充沛的了解，如环境温度(保持在18 c～25℃)、反响孵育温度和孵育时刻、洗刷的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。2. ELISA试剂盒准确运用加样器加样器应笔直参加标本或试剂，防止刮擦包被板底部。加样过程中防止液体外溅，血清残留在反响孔壁上，加样器吸头要清洁洁净，防止污染，加样次第要与说明书共同，否则可致使成果过错，试验重复性差。3. 手艺洗板加洗液时冲击力不要太大，洗刷次数不要超越说明书引荐的洗刷次数，洗液在反响孑l内停留的时刻不宜太长。不要使洗液在孑l间窜流，形成孔问污染，致使假阴性或假阳性。4. 要确保加液量共同 咱们在运用时感受滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量禁绝，形成显色不一致，判别过错。5. ELISA试剂盒显色液量不行过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反响，显色液量不能过多，避免显色过强。elisa试剂盒的影响因素应选用有国家批准文号，质量靠得住的商品，不能图廉价，忽略质量确保。试剂应妥善保留于4℃冰箱内，在运用时先平衡至室温，不一样批号的试剂组分不宜交叉运用。试剂敞开后要在一周内用完，剩下的试剂下次用时应先查看是否蜕变，显色剂如被污染变色将形成悉数显色，致使过错成果。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度类型及步骤ELISA的主要常用类型及步骤1. 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。2)加稀释的样本，保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。4)加底物显色。2. 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2)加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量相关。4)加底物显色。3. 双抗原夹心法测抗体反应原理和模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体4.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

PCR实验室指的是基因扩增实验室，而P2实验室是指生物安全实验室中的一个分类，是生物安全防护达到二级的实验室。那么PCR实验室和P2实验室的装修标准是什么？一、PCR实验室装修标准 （PCR实验室建设所需资料）基因扩增实验室装修设计是一个考验专业性的设计装修项目（PCR实验室规划设计）。基因扩增实验室的设计通常有四大分区：试剂储存和准备区、标本制备区、核算扩增区、产物分析区。这四个分区原本就不需要连接在一起，且在物理空间上必须是完全独立的，各区域无论在空间上还是在使用中，应处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。基因扩增实验室功能区的压力控制：1.压力梯度最好在10Pa及以上2.两种控制方式：系统控制和排风功率变化。二、P2实验室装修标准 （实验室装修设计）P2实验室是指生物安全防护达到二级的实验室。对于生物二级实验室装修设计，要把实验室分为3大区域，即：洁净区、操作区、无菌区。洁净区P2实验室的洁净区通常由4部分组成，即：办公室、休息室、培养基配制室、试剂储藏室。注意，在洁净区内禁止带入细菌检验标本。

一、无菌操作要求1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。3、无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，也可以用雾化过氧化氢设备，法国欧菲姆设备实用，便捷。4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法1、灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。2、装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3、设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）。②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。4、灭菌温度与时间（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。（2）压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间（二）间歇灭菌方法1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性。4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。四、有毒有菌污物处理要求微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在zhi定地点，待统一进行高压灭菌。2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30min高压灭菌。4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、kou罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。五、培养基制备要求培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。2、PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。7、目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。六、样品采集及处理要求1、所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消du药物灭菌，更不能含有此类消du药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。（3）按规定采样数量不足者。对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。七、记录和报告的要求1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

PCR仪器不是一种计量仪器，其主要作用原理与基本计量要素密切相关，要求较高，一旦失控，仪器将不能正常工作，所以PCR仪器也需要定期检测和维护，这对依赖自然风降温的PCR仪器尤为重要。下面介绍一些具体的保养维护方法：1．样品池的清洗先打开盖子，然后用95%乙醇或10%清洗液浸泡样品池5min，然后清洗被污染的孔；用微量移液器吸取液体，用棉签吸干剩余液体；打开PCR仪，设定保持温度为50℃的PCR程序并使之运行，让残余液体挥发去除。一般5～10min即可。2．热盖的清洗对于荧光定量PCR仪，当有荧光污染出现，而且这一污染并非来自样品池时，或当有污染或残迹物影响到热盖的松紧时，需要用压缩空气或纯水清洗垫盖底面，确保样品池的孔干净，无污物阻挡光路。3．仪器外表面的清洗清洗仪器的外表面可以除去灰尘和油脂，但达不到消毒的效果。选择没有腐蚀性的清洗剂对PCR仪的外表面进行清洗。4．更换保险丝先将PCR仪关机，拔去插头，打开电源插口旁边的保险盒，换上备用的保险丝，观察是否恢复正常。在仪器的维护保养中，需要注意以下问题：1）PCR仪器需要定期检测，视制冷方式而定一般半年至少一次。2）PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的，当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1～2℃时，可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。3）PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当PCR仪的降温过程超过60s，就应该检查仪器的制冷系统，对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘；对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。4）一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时，不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件，必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。

　　细菌内毒素检查法是判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。 内毒素(Endotoxin)即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A。菌体死亡崩解后释放出来。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。　　热原主要是细菌释放的一种内毒素，热原进入机体血液循环系统会引起发热等一系列不良反应，因此，注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射剂安全性的重要质量指标。　　异常结果：临床上在进行静脉滴注大量输液时，由于药液中含有热原，病人在0.5-1h内出现冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，高热时体温可达40℃，严重者甚至可休克。　　在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：　　(1)临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40-80mg，婴儿(三个月以上)静脉滴注给药每次10-20mg。按成人(体重60kg)剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。　　(2)有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。　　(3)有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。　　(4)错误的计算日给药剂量(一日内多次给药)。　　(5)在品种规格(浓度)发生变化时，计算MVD没有进行调整。　　(6)建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。

用好的血清，细胞一定状态良好？养细胞细心、体贴像照顾小孩纸，细胞一定「平平安安」？但 MTT 等一些细胞实验结果却异常。因为你的细胞已悄悄被支原体污染了。支原体是一种生命力顽强的细菌，它和其他细菌的区别在于，支原体没有细胞壁，只有柔软的细胞膜。娇小的身材（0.15-0.3μm）让它可以轻松穿过滤器。由于身形小，培养物不会表现出浑浊或其他明显可见的特征，因此支原体很容易被忽视。但支原体其实已经随着操作者的操作「偷偷地」潜入超净工作台，并附着在血球计数器、移液器、废液缸等物体表面。常见的支原体污染来源有：1. 受污染的培养基、血清、或试剂2. 不彻底的灭菌3. 培养箱：目前常见的培养箱都带有通气扇和 CO2 瓶，在开、关内门的过程中，被支原体污染的颗粒会被扰动，可能造成细胞污染。其他实验设备的使用也可能造成污染颗粒的扰动，如移液器、离心机等。4. 液氮液氮也可以成为传播支原体的媒介。支原体具有顽强的生命力，即使没有经过低温冷藏过程，支原体也可以在液氮里存活。在液氮中，支原体虽然不会增殖，但是仍可以污染保存在其中的细胞，因此建议将冻存管保存在液氮罐的气相层中。5. 空气悬浮物在培养过程中产生的悬浮颗粒是微生物污染的最主要来源，一些常见的仪器或普通的实验操作都会产生这些颗粒，例如移液器、真空泵、离心机、冰箱等。携带微生物的颗粒直径多在 4-28μm 之间，在静止空气中，它们以 30 cm/min 的速率移动，因此在密闭、不通风的房间或实验室内，基本不会造成生物污染。但是，当实验者进入房间时，沉积的颗粒会被扰动，悬浮起来的颗粒则有可能污染细胞。因此严格的无菌操作意识很重要。此外，实验动物也会带来一些被污染的悬浮颗粒。除上述的情况外，滥用抗生素、密封不严、受污染细胞等也都可能是支原体污染的来源。支原体污染的危害：1. 支原体导致细胞密度的减少，并引发细胞不可逆的退化。2. 支原体吸收、破坏培养基中的精氨酸，抑制细胞生长、引发细胞凋亡，造成细胞活性降低、细胞脱落等现象 。更有甚者，也可能导致染色体畸变，因为精氨酸是细胞核内组蛋白的重要成分。3. 支原体对 MTT 有还原作用，因此常规的细胞毒性实验 MTT 实验的结果会受到支原体的严重干扰；某些支原体也可以直接诱导树突状细胞的成熟，这对于人体免疫细胞的肿瘤治疗来说，无疑是一个灾难；除此之外，支原体的存在可以显着改变数百个基因的表达水平。由此可见，支原体不仅影响细胞的健康，也会影响细胞实验的结果。因此，有必要定期检测支原体。建议在引进新细胞、冻存细胞前或发生细胞房污染等情况时，及时对细胞进行支原体检测，平时对正常培养的细胞也有定期检测的必要，以做到及时发现，及时处理，避免更大的损失。防止污染的方法1. 改进无菌技术、严格无菌操作对新进实验室的人员，要由有经验的人员帮带，严格监督其实验操作；此外建议记录每一次的污染事件，以便分析解决污染问题。2. 检测外来细胞因为外来的细胞携带污染很常见，因此，选择可靠的细胞来源非常重要。在没有独立细胞培养箱的情况下，可疑的细胞培养物应培养在带盖的培养瓶中，不要使用培养板或没有密封的培养皿。此外，处理这类细胞应在一天工作都结束后进行，并且使用独立的培养基和试剂，最后还要对超净工作台进行彻底除菌。其他方面，如减少悬浮物产生、正确使用抗生素、定期进行支原体检测等，对于防止污染也尤为重要。

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染原因(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.对照试验1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.3.重复性试验4.选择不同区域的引物进行PCR扩增防止污染的方法一． 污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最da程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。（一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：1． PCR用水应为高压的双蒸水；2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；8. 重复实验，验证结果，慎下结论。二． 追踪污染源如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有：1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 紫外分析仪；5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离心机；7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。三．污染处理（一）环境污染1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。（二）反应液污染可采用下列方法之一处理：1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。

上个世纪初，世界上三分之一人死于肺炎、结核、肠炎及腹泻。今天心脏病和癌症成为人类的主要杀手，因肺炎和流感死亡的人数则不到4.5%。 这是人类应用抗生素在公共卫生领域取得的重要成果。而现在人类却又走到了事情的另一个极端：滥用抗生素导致耐药菌的出现及广泛传播。一项世界规模的宏基因组研究显示含耐药基因的微生物在自然界中无处不在。这意味着人类即将回到没有抗生素的时代，医疗体系中的很大一部分可能会退回到一百年前的境地，轻微的细菌感染都可能引起致命的后果。世界卫生组织在2011年世界卫生日提出了“抵御耐药性——今天不采取行动，明天就无药可用”的口号，呼吁制止耐药性的传播，并于2014年4月公布了首份基于全球114个国家数据的全球抗生素耐药性报告。美国也认为抗生素的耐药性是 2014年面临的重大公共卫生挑战。抗生素耐药性，到底是什么？日常生活中人们会听到很多种“药物耐受”，有些耐受是发生在人身上——比如糖尿病患者反复使用胰岛素，其效率就会降低；慢性疼痛患者反复使用止疼药物，效果也会越来越差。但抗生素的耐药性则不同，并不是人体对抗生素产生耐受，而是人体内的病原体产生耐受；而病原体会传播。这就是为什么抗药性是一个全球性问题，哪怕你不吃抗生素也会和你有关系。按照定义，耐药性指“细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物发生改变，使原有针对性的治疗药物变得无效。”致病菌产生耐药性之后，抗生素在体内无法识别病菌或对其发起攻击。假设耐药致病菌在世界范围传播，那么所有感染这类病菌的患者都无法使用传统的治疗方法控制病情。通俗地说，抗生素的耐药性，其实是在体内产生了耐抗生素的一种新型病菌，而这种新生物的出现可对全人类的健康形成威胁。耐药性有多可怕？曾经几十单位的青霉素就可以救命，而如今可能几百万单位也无法产生任何效果。上世纪60年代抗生素的全盛时期，全世界每年约700万人死于感染性疾病，在本世纪这个数字却上升到2000万。即使个体没有滥用抗生素，也可能受到滥用抗生素而培养出的耐药菌的感染。2012 年出现了约45万新发耐多药结核病例，目前广泛耐药的结核病已经出现在92个国家及地区，这些出现耐药菌株的患者不得不面对着更长的疗程和较差的治疗效果 。而广泛耐药结核菌、耐青蒿素疟疾和耐三代头孢菌素的淋病，如瘟疫般在世界范围内的传播，则意味着这些我们曾经攻克了的疾病可能再次成为全人类的不治之症。我们将来要面对的病菌会是一百年前的加强版，亟需研发基于全新作用靶点的新药来应对。而新药开发毕竟是个浩繁的工程，难以赶上细菌变异的速度。如不能对耐药菌加以控制，这将不再是个人治疗成本的问题，而是整个社会的经济负担。为什么会有抗生素耐药性？了解耐药性，首先要从抗生素的“抗菌”机制谈起。好比程咬金的三板斧，抗生素战胜细菌也无非就靠那么几招：1）抑制细胞壁的合成；2）抑制蛋白质的合成；3）抑制 DNA 的合成；4）感染细菌生长繁殖。细菌的祖先可以追溯到30亿年前，它们对环境具有奇强的适应能力，这主要得益于亿万年不间断的进化。耐药菌种的进化是一种优胜劣汰的自然现象。随着抗生素的出现，对药物敏感的菌株陆续被杀灭。然而随着微生物自身代代繁衍，偶然的基因错配可形成少量对药物不敏感的突变菌株。基因错配是自然界无时不刻不在发生的事情。就在这一秒，可能你的肠道里的大肠杆菌里就冒出一个突变菌体。可是要让一个“偶然的错误”变得有意义，而且可以很有影响力，就需要强大的繁殖力。当然，对于细菌这种简单生物来说，也不算太难。这些被祖辈视为“歪瓜裂枣”的细菌幸运儿身上到底有哪里变得不一样呢？有的改变了抗生素与之作用的靶点，让抗生素摸不到门路；有的则身披铁布衫，让抗生素无法进入细菌内；还有的主动出击产生钝化酶，让抗生素失活。总体来说，他们都是通过自身主动发生结构性改变，而让“呆板守旧”的抗生素无功而返。抗生素的种类和战斗模式是有限的，而细菌却可以万千变化躲避打击。就这样，那些抗生素打击不到的落网之鱼可凭借其顽强的生存力不断壮大，它们不仅可自身繁衍，还可以把“抗性”通过基因传染给其他细菌。抗生素滥用是耐药性泛滥的最大推手基因突变是产生耐药细菌的根本原因，但如果没有抗生素滥用，耐药性不会以如此快的速度蔓延开来。突变是偶然事件，大部分的突变其实没有效果，剩下的那些突变里绝大部分又是有害的，只有极少数在有害之余还能附送微弱的耐药效果，有利无害的突变简直微乎其微。一次突变就让细菌获得完美耐药性几乎不可能；现实中的耐药性几乎都是逐步积累突变、逐步提升的。在抗生素大规模医用之前，耐药效果对细菌几乎没有意义，突变自身的有害效果更加重要，所以耐药性基本不可能传播开来。正常使用抗生素能杀死几乎所有的目标细菌，个别漏网之鱼通常也会被人体免疫系统消灭殆尽。其中一些细菌个体虽然已经带有耐药性的萌芽，但这些萌芽不足以抵御正常剂量抗生素，也会随着个体死去而消失。因此，耐药性即便能够传播也是非常缓慢的。然而，如果机体出现感染时，未能一次性使用大剂量抗生素把细菌彻底杀死，就会让这些不那么敏感的萌芽菌株留存下来建立新的种群；新种群会在此基础上继续突变。剂量使用不足，没有完成疗程，更换过于频繁，这些因素都会大大降低杀菌效果，让急性感染转为慢性感染，迁延不愈，给耐药菌可乘之机。滥用抗生素的危害还不仅仅是促生抗药性。不合理使用抗生素可造成肝肾损伤，影响儿童牙齿和骨骼发育。此外长期使用某种抗生素，还可能打破体内菌群平衡，引起某种细菌不受制约的条件下大量繁殖，造成二重感染。据跟踪调查研究显示，长期食用抗生素可降低人体免疫力，提高患癌症的风险。院内感染是耐药菌滋生的温床因医院内住院患者大多病情较重，感染者较多，使得医院成为耐药菌交叉感染的温床。根据2013年的数据，美国多种院内耐药菌感染较2008年翻了2-4倍 。具有“多重抗药性”的顽固分子，被人们冠以“超级细菌”的名号。传统的超级细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和抗万古霉素肠球菌（VRE）等。最近发现的产新德里金属蛋白酶-1（NDM-1）耐药细菌则具有“泛耐药性”，让绝大多数抗生素都束手无策。欧洲临床微生物和感染疾病学会预计一旦感染此类细菌，至少10年内无药可治。尽管叫做“超级”，它们在致病力上却不具有任何超能力，仍然是相同的感染症状，只不过任何抗生素都拿它没有办法。一旦感染“超级细菌”，患者可出现严重的炎症反应，甚至死亡。因无药可治，医生也对此束手无策。目前这种水火不进的“超级病菌”正在全球范围内蔓延。中国疾控中心和和中国军事医学科学院实验室2010年对既往保存的菌株进行检测时，已检出三株 NDM-1 阳性菌株。农业中抗生素应用同样值得关注与农产品中抗生素使用量相比，人用抗生素量相形见拙。全球90%以上的抗生素作为饲料添加剂用于食用动物身上。据美国疾病防控中心的数据，2013年美国市场上出售的抗生素中73%由兽医购买。中国2010年畜牧业抗生素消耗量则是9.7万吨，占年总产量的46.1%。畜牧业大量使用青霉素、四环素和氯四环素的主要是为了提高牲畜产量，而非治疗疾病。美国 FDA 早在上世纪70年代就曾想禁止以上抗生素添加，却迫于国内畜牧业压力未能施行。如今这一禁令又被 FDA 提上议案。研究显示由于饲料中大量抗生素添加，美国农场养殖牛的四环素和红霉素的耐药率分别为42.9%和12.7%，远高于北美野牛（分别为8%和4 %，尽管如此该数据也超过了研究人员的期待值）。抗生素在土壤和水体中是自然存在。随着农业对环境的改变，无论是否直接经废水灌溉，土壤中获得的细菌的耐药性都非常高。提示细菌耐药性已经传播，抗生素的使用对环境的改变不可小觑。在不知不觉中低剂量长期摄入抗生素，可加速病原菌耐药性的产生。国外已有对环丙沙星不敏感的个案报道，推测与环丙沙星在鸡饲料中添加造成食物残留有关。食物（如养殖鱼类）的抗生素残留，也可引起过敏症状。抗生素过敏也普遍存在，但和耐药性不是一回事国家食药监局发布的国家药物不良反应监测报告显示，2013年度药物不良反应事件/报告共131.7万例，其中抗感染药物引起的占39.3%；而其中的一个重要原因，就是我们熟知的抗生素过敏。虽然都是抗生素带来的负面影响，但耐药性和过敏是两件不同的事，前者是细菌与药物之间的恩怨，而后者则是药物和个体间的纠缠。几乎所有抗生素都可以引起过敏反应，但青霉素类及头孢菌素类最为常见。以青霉素过敏为例，青霉素生产储存过程中产生或在体内代谢过程中可生成青霉噻唑类物质，这类物质可在人体内合成青霉噻唑蛋白，刺激机体产生免疫反应，也就是过敏症状。小时候打青霉素针都需要做“皮试”，就是为了检查是否有过敏。青霉素过敏因人而异，却十分常见，平均十个人里面就有一个。具体表现包括皮疹、发热、血管神经性水肿，严重时可诱发过敏性休克。过敏的作用机制与抗生素成分本身有关，口服抗生素也会引起过敏。但因口服制剂的首过效应，体内吸收利用度远低于静脉注射，引起的过敏症状较轻。目前临床使用口服抗生素一般不做皮试，如果患者无过敏史可直接服用。虽然从理论上讲，摄入环境抗生素也可能引起过敏反应，但在自然界中抗生素的剂量很小，几乎不足以引起过敏反应，公众没有必要为此担忧。但是这种情况也有个例，比如最近美国报道的一个因食用蓝莓派而出现重度过敏症状的病例，是因为蓝莓中含有的链霉素导致的，但值得注意的是这个病例本身既往有哮喘病史，因此对于既往有过敏性疾病的人来说，确实谨慎为好。耐药性泛滥，应该怎么做？shou先在社会各个层面应进行合理使用抗生素的宣传。个人和医生应合理使用抗生素，做到“对症下药”，并严格控制用法、剂量和疗程。临床用药时应开发快速细菌检定方法，尽早获得细菌耐药信息，避免盲目用药。治疗时可采用多药联用，减少耐药的可能。医院应组织传染病学科及相关专家，对院内抗菌药物使用加强监管并对相关科室人员进行定期培训。此外因耐药菌出现的速度要远高于新抗菌药物研发的速度，一些具有研发能力的公司为了利润，会转而将注意力转向治疗慢性病的药物，从而进入恶性循环。因此政fu应对新型抗生素药物研发加以鼓励和扶持。

说到细胞，我想大家应该都不陌生。我们最初了解细胞这个名词应该是在初中高中的生物课本上。我们也都知道，我们的生命体都是由细胞这个微小的单位组成（病毒除外）。作为一个科研狗，拿到一管细胞后我们想到更多的是：这是什么细胞（动物的？植物的？）？原代细胞？还是细胞系？或者说，这细胞是贴壁生长的？还是悬浮生长的？那么我们今天就来聊聊什么是原代细胞。原代细胞(primary cell)：是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在我们的科学研究过程中，每个涉及到细胞研究的研究者都会根据自己的实验需求采用不同的细胞。根据自己的课题采用原代细胞或者细胞系，我们都知道，细胞系的培养相对于原代细胞来说更为的简单和易操作，也不会担心细胞在正常条件下会发生分化、衰老等现象从而影响我们实验的可信性和重复性。而原代细胞从获取到培养整个过程要考虑的问题则非常多，接下来我们就具体聊聊吧。一、原代细胞的获取原代细胞的获取，就是从活体上将组织分解成单个细胞再进行培养的过程，且整个过程要求无菌操作。具体要考虑的问题有：组织分解的方式，培养的时间，换液时间，细胞状态判断和冻存。组织分解方式将组织分解成单个细胞的方式目前主要有两种：酶消化法和组织块法（针对贴壁细胞）。【1】酶消化法：所用试剂：胶原酶和胰酶。胶原酶的选择：（根据自己的组织样本选择合适的胶原酶是实验成功的大前提。）类型适用组织胶原酶Ⅰ上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离.胶原酶Ⅱ软骨，肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织细胞的分离。胶原酶Ⅲ消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动物组织细胞解离胶原酶Ⅳ多种组织。胶原酶Ⅴ胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。胶原酶的配制：建议看相关的文献进行胶原酶的配制。小编常用的是DMEM进行配制，配制好的胶原酶消化液放置在37℃水浴锅内预热（注意现用现配）。胰酶（酶联合法获取原代细胞中会加入胰酶）胶原酶消化时间：根据组织特性，消化时间会有差异。以小鼠肾细胞为例，加入胶原酶Ⅰ进行消化后，放入37℃培养箱中消化45min~1h左右，期间每隔10min中震荡一次，知道组织块几乎完全消失为止（若是组织块剪得非常细小，时间可以短一些，30min左右即可）。培养过程：注意原代细胞在培养2天后可能会出现细胞液变黄（橘黄色）的现象，且无漂浮物，这是正常现象哦，不是污染。这是由于细胞在贴壁生长过程中释放了CO2和其他物质导致培养液PH发生了改变，所以变黄。【2】组织块法取材：取组织中间部位，剪成大小均匀的小方块（1~4mm2），清洗干净后转移至培养皿中，在培养皿中各组织块要排列均匀。加液：培养液不能浸没组织块，避免组织漂浮。然后培养4h左右加培养液，培养48h后换液。培养时间无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以上的时间，期间可换液或者传代。换液时间无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。细胞状态判断正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。下图均为比较健康的原代细胞图（左：小鼠成纤维细胞；右：鸡胚成纤维细胞；下：人成纤维细胞）这些细胞的状态比较好，生长至80%~90%融合就可以传代啦，传代一次后的细胞会更干净漂亮。冻存传一代后的细胞（也可以不传代直接冻存）培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。冻存液配制：不同的细胞可能会有不同的冻存液配制方案，各实验室也有自己的冻存方案，常见的方案有：A: 10%DMSO+90%的FBSB: 10%DMSO+40%FBS+50DMEMC: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS (小编常用小鼠的，鹿的都尝试过，细胞状态OK)二、原代细胞的培养原代细胞的培养其实与细胞系的培养无多大差别，针对不同的细胞会选择不同的细胞培养液。1.培养液选择：（根据不同的细胞类型和实验要求进行培养液的选择）最chang用的L/H DMEM，F12 DMEM，RPMI 1640。2.细胞培养过程无菌操作。正常的复苏，换液和传代操作，最后将培养好的细胞进行相应的实验即可3.细胞鉴定。有时候我们获取的原代细胞可能会有不是自己期望的细胞在里面，或者获取的不是我们的目标细胞。这个时候我们需要进行细胞的鉴定。细胞鉴定需要购买特定细胞的表面标志物抗体或者染色试剂进行鉴定。三、原代细胞试用的实验类型前面我们了解了原代细胞获取和培养过程中应该注意的一些细节，这有助于我们培养我们的原代细胞。那么原代细胞培养好后，它可适用哪些研究呢？原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。在这些应用中几乎都涉及了几个最常见的且最基础的细胞实验，如下：细胞增殖检测：常见检测方法：CCK8检测法 ，MTT检测法，Brdu检测法，Edu检测法，平板克隆形成细胞周期检测常见检测方法：流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法细胞凋亡检测常见检测方法：流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色，电镜，TUNEL细胞转移能力检测常见检测方法：细胞划痕实验，Transwell实验，Invasion实验