预装管法(Test’N Tube)● 精确制备的试剂-以比色瓶或密封袋分装成一次实验的用量。● 最小的处理量和最短的准备时间。● 更少依靠个人技术，减少人工配制试剂的误差，以提供精确和重现性好的结果。● 减少和避免使用危险化学试剂，例如 酸盐测定不需镉，氨氮测定不需汞等。● 在加盖的试剂瓶中对反应后的样品进行处理，更加简单、易行。● 减少实验室产生的废液及由此带来的废液处理费用问题。Test’N Tube使用方法只需简单地将水样和加入预置试剂的Test’N Tube比色管中，并拧紧瓶盖，经过一段时间的反应(部分水样需要预处理)，在HACH的分光光度计上就可直接读出结果。安培瓶法(Amplus，AccuVer)● 高质量的玻璃质安培瓶。25毫升的玻璃质安培瓶包含了精确计量的试剂，为了单参数测试，而且可被当作小量瓶使用。● 真空包装使内含试剂的保质期延长。安培瓶在真空条件下，密封保证了试剂的稳定性，并且zui大限度的使试剂与湿气、空气和其他污染物隔绝。● 被认证的预处理方法。在安培瓶中的试剂，迅速溶解有很高的稳定性。● 单独使用的试剂适配器。安培瓶法避免了样品瓶的清洗和交叉污染。安培瓶的使用方法1．把安培瓶放入安培瓶起瓶器中，然后一同放入水样中，用拇指按下安培瓶底，折断安培瓶的瓶颈，由于安培瓶中为真空包装，水样虹吸进入瓶体，然后混匀水样与试剂，等待反应完成或试剂显色。2．真空包装的安培瓶与HACH的分光光度计和比色计匹配使用，能在显色后放入仪器中直接读数。安培瓶本身就可是HACH分光光度计的比色皿。放入仪器后．直接读出以mg /L计的测定数值。(注：AccuVer表明该参数可使用安培瓶结合仪器法测定。)基本试剂法(Reagent Set)● 易得到的精确结果。HACH通过严格的质量管理和的生产工艺，保证每个批次的试剂都具有良好的重现性。● zui小的残液处理。由于预制试剂为每种特定反应提供确切数量的试剂，所以没有过量的试剂需要处理，您可以降低这方面的费用，减少与有毒化学品接触的机会。● 一次性包装技术延长了试剂的使用寿命，避免环境和操作过程对试剂的影响；每次测量只需一个包装，特定的反应试剂代替过去纷繁复杂过程配制出的反应液，简化了试验的操作过程。试剂的一般使用方法：只需按照随机附送的操作手册，选取正确的操作程序，按步骤进行。1．分别向样品瓶中加入水样(有时要进行预处理)和去离子水，贴上水样和空白的标签。2．分别向样品瓶中加入铝箔袋装试剂或粉枕，反应一段时间后，即可在分光光度计或比色计读数。(有些参数需加入二次粉枕或试剂，进行反应。)3．将标记空白的样品瓶放入仪器进行零点的校正，再放入标记水样的样品瓶放入仪器测出结果。

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要是：血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；第二 血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；第三 不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因。鉴别方法：血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血*收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆zui大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。　　血浆是血液的液体成分，血细胞悬浊于其中。人体含有2750-3300毫升血浆，约占血液总体积的55%。血浆的绝大部分是水（体积的90%），其中溶解的物质主要是血浆蛋白，还包括葡萄糖、无机盐离子、激素以及二氧化碳。血浆的主要功能是运载血细胞，同时也是运输分泌产物的主要媒介。将新鲜血液离心，使血细胞沉降，上层淡黄色清液即是血浆。血浆与血清的区别是血清中不含纤维蛋白原等凝血因子。

试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标，但不能反映试剂质量的全部。试剂成份、纯度、用量及稳定性，才是保证试剂质量的关键所在。目前市售的一些试剂具有抗干扰作用，主要是通过加入抗干扰物质或使用新的色素原以避免内源性物质的干扰。但值得注意的是：一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。1 试剂空白试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应，在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限；相反，吸光度下降的反应，其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此，试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂。需要指出的是，还原型辅酶I（或II）等投料量不足或劣质的原料，往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，凑合过试剂空白核对的“关”，其后果为如下情况：1线性范围变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量不足；试剂成份稳定性较差。2 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定结果有严重系统误差。原因：试剂底物浓度不足。3 低值偏高 现象：试剂空白的变化曲线（吸光度VS时间）明显波动。原因：试剂自身不稳定，自行分解；工具酶纯度不够，杂酶含量超限，导致干扰作用。2 样品信息样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测模式，并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。3 测定范围每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质，应更换合格试剂。4 底物耗尽使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性非常高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。5 酶的预活化测定血清中的某些酶，如CK，离体（采血）后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基（一SH）被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂，名为N一乙酰半胱氨酸。实验研究证明，NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在AST，ALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的结果要高些。6 校准与结果溯源性酶的校正：要满足在同一方法学、同一测定条件、与理论计算的FACTOR值差异不大，没有发现有明显影响因素，方可进行校正。检验结果溯源性，得建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，然后将准确性转移到常规方法测定中去，使常规方法测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。在实现溯源性目标过程中，永远以患者新鲜标本为实验对象，以方法学对比试验方法为验证手段。方法学对比试验常采用回归方程进行统计分析，假如斜率接近1，截距较小，这意味着实验室常规方法对标本测定结果和溯源目标参考系统对标本检测结果非常接近。临床化学中参考标准（二级标准）要有通用性，但生产厂家提供的校准液并非通用的，只适用于某一特定的分析系统。校准液标示值往往是按其基质偏差修正的，所以标示值并非实际值。校准液、质控血清通常是经过处理的混合人或动物血清，这种制备物在特定分析系统中往往与人新鲜血清反应性不同而产生基质偏差。如总胆固醇测定基质效应研究指出：校准液酶法测定回收结果偏低可达5%~7%。7 试剂抗干扰作用的合理性有些液体双试剂，其实质并不真正具备抗干扰的能力而只是解决了试剂的液体化和稳定性问题。如，ALT试剂盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中极不稳定，在pH>8.7时才能稳定保存。因此，为了保证试剂稳定性，液体双试剂的R1需要维持pH>8.7，但此时LDH活性大大下降，就失去消除内源性丙酮酸的功能，只有加入试剂R2后，反应混合液的pH下降至LDHzui适pH，在经过延迟时间60 S后，才能消除内源性丙酮酸的干扰。再如，Tfinder反应中抗Vc干扰问题：由于维生素c易氧化，样品中Vc会竞争反应生成的过氧化氢，而产生负干扰。因此，在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶，这种方法是有效的，但不一定有很大的意义。因为Vc干扰必须同时具备二个条件：a）Vc摄入量较多；b）采血后立即测定。实验表明离体血清中Vc在90 min后会全部被氧化。又如，使用胺类新色原。a）分子共轭结构特性使得灵敏度提高，相应可以减少样本用量，zui终能有效地降低干扰物的量．b）使生成胺类色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避开黄疸、溶血干扰。如：亚铁氰化钾一H 0 ，能有效避免黄疸干扰的理论依据是亚铁氰化钾与H。0。亲和力远远大于胆红素。甘油三酯测定，有人主张选用双试剂方法消除内源性甘油，这个方法是可行的，但忽视了一个化学平衡理论。因为所有的酯在水溶液中都不是简单地以酯的形式存在，而是以水解与酯化相平衡的形式存在。在一个平衡体系中，如果去除游离甘油，这个平衡就向生成甘油方向移动，甘油三酯就会重新水解，生成新的甘油，达到新的平衡，因此样品与R1试剂孵育时间越长，测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定，不仅要去除游离甘油，而且还要克服样本含量真实性发生的变化，试剂中必须加入甘油激酶，并且延迟时间要标准化。所以，一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。

具有稳定的无污染环境是任何类型实验室中的基本问题，尤其是涉及微生物学领域的实验室。实验室培养箱提供了这一重要功能，可以在温度，湿度和二氧化碳等特殊条件下使细胞和组织培养物更加舒适。我们坚持认为这是种植和储存细菌培养物的设备。培养箱是进行细胞培养和组织培养工作的任何实验室的必要设备。培养箱可保护细胞免受温度，湿度，CO2和O2的影响。水或空气夹克可以调节温度。湿度水保持恒定的湿度，风扇使O2循环。模块化和标准二氧化碳培养箱由导热系数或红外传感器控制。实验室培养箱设备在细胞生物学实验，微生物学，重要研究所研究培养箱是你实验室的项目。如您所知，拥有理想的培养箱让您有机会通过实验保持适当的温度，湿度和其他因素来重建生活过程。有不同的培养箱类型，你可以找到干浴培养箱，生物需氧单位，这是昆虫或植物研究的理想选择，振动培养箱，模具培养箱和各种实验室测试室。如果您无法决定要购买哪种类型的培养箱，您必须牢记的培养箱的大小。也有不同的尺寸，如桌面单位到房间大小单位。这意味着您的选择取决于您的实验室规模。另外要记住的是你正在运行的实验室，因为除了组织培养，实验室培养箱对于生物化学和血液学研究，制药工作和食品分析至关重要。实验室培养箱容量如上所述，要记住的最重要的事情之一是培养箱的大小和容量。您必须估计同时孵化所需的样本数量，并且答案将为您提供有关培养箱需要的正确内部体积的一些想法。还有其他重要因素，如温度，湿度和CO2范围。你可以问自己：这些元素对我的工作是否必要？我需要水源吗？购买培养箱时要记住的另一件事是，你必须确保培养箱具有均匀的热量分布和消除冷运动。您应该知道培养箱可以是水夹套或空气夹套; 此外，培养箱可以使用另一种直接热源。在二氧化碳培养箱的情况下，一些模型包括热导检测。

应用高效液相色谱检测时，流动相的选择十分重要，因此稀释剂的选择就成为重中之重。根据高效液相色谱检测的不同要求，可以选择不同的类型的稀释剂。而选择时的LC-MS级这一指标到底有何意义?本文对此予以了详尽的解答。众所zhou知，在高效液相色谱检测中要使用高纯度稀释剂作为流动相，在此有不同纯度指标的稀释剂可供选用，例如HPLC级稀释剂、梯度级稀释剂以及LC-MS级稀释剂。在色谱分析中，应用不同稀释剂的质量和稀释剂的纯度之间有什么关系?稀释剂的质量为何要与检测任务保持匹配?稀释剂的质量表示的是：它们是由同一种原料生产的，理论上只有微量杂质(根据不同的产品：99.8%~99.9%)。但这微量的杂质却会在色谱分析中因不同的检测方法由被测样本而带来变化，此时的纯稀释剂已经不是原来意义上的“纯稀释剂”了。下面，我们将举例说明稀释剂质量的三个等级，以及使用合适质量稀释剂的意义。HPLC级纯度HPLC纯度主要是从利用紫外线探测仪或荧光探测仪进行等度分离来描绘的稀释剂质量。这种纯度的稀释剂以高纯度、高穿透性、低荧光以及低挥发残留物和低酸碱性而着称。这种稀释剂能承受特殊的清洁过滤处理，以便尽可能除去干扰物质。这样一来，由杂质引起的干扰和影响也都降低到了最di，还能够降低色谱分离的背景噪音。在完成过滤后，它们将按照紫外线探测和荧光探测的方法在高效液相光谱仪中进行测试。经质量监控可以保证：用户可以得到始终如一的稀释剂质量，以确保高效液相光谱分析的高重复性。梯度级纯度在高效液相色谱分离中，杂质的色谱法分离除了等度分离外还常常采用梯度清洗方法。在梯度清洗过程中液相的组成成分也在发生变化，例如在反相色谱中有机物含量增加。这对于不适合按照梯度分离法配制的稀释剂来讲会明显提高紫外线探测时的基线、对检测方法的灵敏性的影响。为了能够最佳利用Gradient纯度的稀释剂进行色谱分析，就必须对Gradient纯度的稀释剂进一步清洁。除了有利用紫外线和荧光进行探测的性能之外，还要对其梯度分离特性进行核查，从而保证Gradient纯度的稀释剂在一个批次的检验中质量稳定。LC-MS级纯度随着实验室引进了超高效液相色谱质谱联用系统，由于其具有较高的灵敏度，也对稀释剂提出了一些新的要求。因此，在质谱分析中应用的焦点，主要是针对低离子背景和高离子化效率。这样，稀释剂就要进行相应的净化处理，而最为关键的就是要清除微量元素、有机物质成分和(金属)离子。因为它们能够带来很高的背景噪音，还会在内收过程中将被分析物质收进来，从而明显降低检测的灵敏度。在质量监控时，将对利血平(m/z 609.49)的测试作为稀释剂质量监控的标准。在测试过的质量范围内只有很小的背景噪音，没有因杂质带来的干扰信号。由于LC-MS纯度的稀释剂有很高的纯净度，因此也非常适合在超高效液相色谱分析中使用。由于其能保证超高效液相分析柱有较长的使用寿命，因此也对其在紫外和荧光探测中的适应性进行核查。小结不同质量的稀释剂都有其存在的理由，实验人员进行分析工作时应根据需求选取适当的稀释剂是，只有这样，才能确保独立批次的色谱分析得到准确、可重复的检测结果。高效液相色谱分析技术中的纯度除了HPLC级、梯度级和LC-MS级纯度之外，有些生产厂家还使用了介于梯度级和LC-MS级之间的稀释剂纯度，使用低纯度稀释剂虽然可行但却容易带来一定的风险。由于从生产厂方没有zhi定高纯度质量监控的方法，色谱分析结果的正确性和重复精度都无法得到保障，每一新批次的色谱分析都会因高背景噪音或者干扰峰而得到令人吃惊的结果。

一、洁净间摆放的仪器（一）提供细胞培养环境的仪器l.CO2培养箱指能精密控制并提供恒温、恒湿、洁净、恒定CO2浓度的仪器，利用该仪器可使用培养皿、多孔板（(6-96孔板）、培养方瓶等进行细胞培养。根据容积大小，有60-190L台式，也有上下堆叠落地式。根据通气状况，一般通CO2和空气，也有3气（CO2、N2和空气）或4气（CO2、NZ2、O2和空气）培养箱。根据控温类型，区分为水套式和气套式两种。2．细胞工厂在CO2培养箱中，应用特定的培养容器进行细胞大量培养。3．滚瓶培养(1)滚瓶培养箱放置于CO2培养箱中使用，有驱动滚瓶滚动的机械装置，可以应用滚瓶进行细胞大量培养。(2)滚瓶培养架在CO2浓度、温度、湿度可控的洁净间内使用，有驱动滚瓶滚动的机械装置，可以应用滚瓶进行细胞大量培养。4．生物反应器生物反应器，也称动物细胞罐，应具有良好的无菌控制，通过专门的控制器组件进行细胞大量培养，一般需要4气（CO2、N2、O2和空气）培养，可分批次培养和连续培养形式。需要配置专门的补料瓶。培养工艺复杂，仪器设备的造价往往很高，通常用于研究、中试和生产。根据罐体容量和培养容量（培养容量往往比罐体容量小）区别大小。一般在研究实验室使用的生物反应器的罐体体积常在30L以下，用于生物制品制备的生物反应器体积达到500L以上。罐体可以是钢化玻璃、陶瓷，也可以是不锈钢或钦合金或铁。（二）用于换液操作的仪器1．微量移液器微量移液器是常用的无菌操作移液用仪器，有单通道、8通道和12通道等规格。常见的种类如下：(1)50-200μl单道微量移液器，配套200μl无菌塑料吸嘴使用。(2)50-300μl8道微量移液器，配套300μ1无菌塑料吸嘴使用。(3)500-5000μ1微量移液器，配套5000μ1无菌塑料吸嘴使用。(4)电动大量移液器，配合无菌长丝滴管、无菌刻度移液管使用，移液速度可调。（三）镜检与显微影像记录仪器1．倒置显微镜和倒置荧光显微镜与正置显微镜（普通显微镜）的主要区别在于，倒置显微镜是载物台在光源下方，或者说物镜在载物台下方的显微镜，使得物镜镜头与培养物液层下方的距离最短。倒置荧光显微镜是带有紫外光源（荧光激发光源）的倒置显微镜。倒置显微镜和倒置荧光显微镜都分别比同品质的正置显微镜（普通显微镜）和正置荧光显微镜（普通荧光显微镜造价高出10倍以上。倒置显微镜和倒置荧光显微镜往往属于三目显微镜（指除了装配有2个普通目镜外，尚有接驳显微摄影的目镜）。2．显微摄影系统指通过接圈与显微镜三目接头相连，借助配套的专业PC软件获得显微影像并能进行处理的装置。3．细胞计数器材细胞计数常用的是血细胞计数板或细胞计数仪。细胞计数仪价格昂贵，如invitrogen的Countess自动细胞计数仪。一般地，血细胞计数板并不属于仪器，单价数十至数百元。但是，血细胞计数板有计量许可，计数窗有玻璃刻画线，与配套的盖玻片一起使用。有2个计数窗，每个计数窗使用有4-5个计数大格。细胞密度／ml＝计数窗内大格的平均细胞数×104/ml。（四）无菌操作依赖的仪器无菌操作的区域主要是在洁净间内的超净工作台内完成的。1．空气净化器使洁净间内空气按要求进行除尘、紫外消毒灭菌、循环。2．洁净间换气装置使洁净间外新鲜空气经过初效和高效滤器滤过除尘后进人室内，并且把室内含粉尘的不新鲜的空气按要求排放到室外的装置，一般设置有定时开关，使每小时换气达到一定的次数，保证洁净间内空气洁净度维持在某个级别以上。3．超净工作台超净工作台，也称超净工作台或无菌工作台。根据通过高效滤器送出风的方向区分为垂直风淋和水平风淋两种，风速可调，内置照明灯管和紫外灯管。垂直风淋超净工作台常见的有单人双面、双人双面、单人单面、双人单面等规格。(1)超净工作台使用步骤①用前准备：先用消毒抹布擦拭台面干净，整理台面器材到台面两侧，关闭两侧玻璃门，开启电源开关，打开风淋，单独打开紫外灯照射30-40min再关闭；②使用时：操作者双手（或戴手套）消毒，打开照明灯，抬升玻璃门至合理高度，可点燃酒精灯以便辅助灭菌或消毒使用。由外部拿人的无菌操作物品需注意除尘处理（先在超净工作台外部拆解无菌物品的外包装、用消毒酒精棉球擦拭存尘外表面等）；③使用后：及时清理废弃物和溅落物，移走用过的器材，摆放好台面物品，并用消毒抹布或消毒酒精棉球擦拭台面使干净，关闭照明灯和侧玻璃门，打开紫外灯照射30-40min再关闭，然后关闭风淋和总电源开关。(2)超净工作台使用注意事项如果超净工作台电源、照明灯、紫外灯、风淋等出现异常，需经过调节使正常后方可使用。操作者双手在洁净台内部分的穿着（穿戴洁净服、乳胶手套，或无穿戴）必须符合无菌操作要求。每次使用后用消毒液浸泡的湿抹布擦抹台面粉尘，长时间不使用超净工作台也应定期用消毒液浸泡的湿抹布擦抹台面粉尘。定期擦抹照明灯管和紫外灯管上可能存在的微尘，以便保证充足的照明效果和充分的消毒灭菌效果。二、试剂、培养用液及细胞材料处置用仪器所涉及的一般试剂通常存放于辅助间柜子或洁净间柜子。需要冷藏或冻存的生化试剂、血清、培养基、细胞材料等，需要区别对待，存放到对应的仪器内，以保证其活性和功能。（一）用于生化试剂、培养用液存放的仪器1．普通冰箱存放培养用液的普通冰箱，通常放于洁净间。普通冰箱一般分为冷藏区和冷冻区，冷藏区的温度一般调节到4℃左右，冷冻区的温度一般最低能调节到-26℃。不能冻存的试剂和材料必须放冷藏区，可以冻存的试剂和材料最好放在冷冻区。2．冰拒冰柜分冷藏冰柜和冷冻冰柜。可大量存放生物试剂和材料。3．低温冰箱只有冷冻区，一般指低温能控制到-50℃，高温不超过0℃的冷冻用冰箱。用于长期存放蛋白类材料或试剂。（二）细胞材料冻存用仪器1．超低温冰箱一般指低温能达到-50℃以下，如-70℃，或者-86℃的冷冻用冰箱。主要用于细胞株、细胞系或其他细胞材料如组织、胚胎等的短期保存。2．液氮罐液氮层内的温度为-196℃，有足够液氮的液氮罐内气体部分的温度可到-100℃以下。通常用于保存细胞株、细胞系或其他细胞材料如组织、胚胎等。液氮会自动升华，因此，根据实际消耗状况，需及时地定期、定量地补充液氮。一般认为液氮内的细胞株、细胞系或其他细胞材料如组织、胚胎等可以实现永久保存。（三）培养用液升温用仪器一般需要准备一台恒温水浴，用于培养用液从零上低温到37℃的升温。恒温水浴使用时需加注纯水以免产生水垢影响无菌操作。

　　在微生物学、环境科学、分子生物学、毒理学、酶学、疫苗制备、药品生产等等领域的实验过程中，都需要应用各种细菌，储备标准菌种、参考菌种、特殊菌种是bi不可少的，下面就几种实验室菌株的保存方法简述如下。　　1  斜面低温保存法　　将分纯的待存菌接种于适宜的固体斜面培养基上，得到充分生长后，用封口膜封口，贴上标签，保存于4℃的冰箱中。此法操作简单、使用方便、不需要特殊设备，是实验室菌种保存z常用的方法。但保存时间短，一般每个月都要移种1次，而且菌种容易变异，所以此方法只适合实验室短期实验菌株的保存。　　2  半固体琼脂法　　用接种针将以分纯的待存菌，穿刺接种于半固体中，放入培养箱培养后取出，封上无菌的液体石蜡，贴上标签，放4℃冰箱保存。此方法简便易操作，不需特殊设备、技术难度不大，但保存的时间不长，一般只能保存1年以内，而且对抵抗力弱以及一些特殊菌种大概只能存活3～6个月，需要频繁的传代，这样很容易使菌株受到污染、变异。所以此方法不适用菌种的长期保存，只适合实验室一些要求不高的菌种的短期保存。　　3  液体石蜡保存法　　将液体石蜡灭菌，放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面1cm为准，将试管直立，贴上标签，置4℃下保存。此法制作简单，不需要特殊设备，菌种可以保存1年左右不需要经常移种，缺点是保存的时候需要直立放置。此方法适合实验室短期菌株的保存，而且保存时需要一定的空间。　　4  高层半固体琼脂石蜡保存法　　将待存菌经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中，经培养箱培养后取出，用灭菌过的液体石蜡滴加到半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度，贴上标签，存放4℃冰箱。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌株1～2年。所以适合实验室菌株的较长期的保存。　　5  纸片法　　将已分纯的待存菌用无菌镊子镊取纸片，在纸片上刮取4～5个菌落，放入冻存管内，盖上盖子后用封口胶布封住边缘，贴上标签，放入冰箱冷冻保存（－20℃左右）。此方法具有操作简单、不需特殊设备、经济实用、保存空间小等，而且保存时间至少2年，但对一些营养要求比较高的菌种，存活率不理想。所以此方法适合实验室一些营养要求不高的菌种较长时间的保存。　　6  甘油液保存法　　将已分纯的待存菌接种于肉汤中，37℃培养18～24h，然后按5份肉汤溶液、2份甘油－生理盐水保存液的比例分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中，贴上标签，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌种3年左右，无变异现象，而且此方法还可以保存一些要求较高的特殊菌种，适用范围广。所以此方法适合实验室普通菌种或特殊菌种的较长期的保存

⒈光合菌群： EM菌液中的光合菌群（好氧性和厌氧性）属于独立营养微生物，它能利用土壤接受太阳热能或以紫外线为能源，将土壤中的硫化氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸、维生素类、氮素化合物和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。光合菌的代谢物质或者被植物直接吸收，或者成为其它微生物繁殖的养分，光合细菌如果能够增殖，其它的有益微生物也会增殖。⒉乳酸菌群： 乳酸菌（厌氧型） , 它以摄取光合细菌酵母菌产生的糖类等物质为基础，产生乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧fu败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质转化成对动植物有效的养分。乳酸菌还能有效抑制连作障碍产生的致病菌增殖。⒊酵母菌群： 酵母菌（好氧型）利用氨基酸、糖类及其它有机物质，通过发酵，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌在 EM集团军中对于促进其它的有效微生物增殖所需要的基质（食物）的生产提供重要的营养保障。此外，酵母菌生产的单细胞蛋白是动物不可缺少的有效养分。⒋革兰氏阳性放线菌群（好气性）。 它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、 维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和 VA 菌根菌增殖。⒌发酵系的丝状菌群（嫌气性）。 以发酵酒精时使用的曲霉菌属为主体，它能和其他微生物共存，尤其对土壤中酯的生成有良好效果。因为酒精生成力强，能防止蛆和其他害虫的发生，并可以消除恶臭。由上可见，各类微生物都各自发挥着重要作用，核心作用是光合细菌和嗜酸性乳杆菌为主导，其合成能力支撑着其他微生物的活动，同时也利用其他微生物产生的物质，形成共生共荣的关系，保证 EM菌液状态稳定，功能齐全 ，发挥出集团军作战的强大能量。 EM菌液的主要功能是造就良性生态。只要施用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，清除氧化物质，消除fu败，抑制病原菌，形成适于动植物生长的良好环境，同时，它还产生大量易为动植物吸收的有益物质，如氨基酸、有机酸、多醣类、各种维生素、各种生化酶、促生长因子、抗生素和抗病毒物质等，提高动植物的免疫功能，促进健康生长，从而在减轻劳动、降低成本、提高产量、改善品质，提前上市，使人们吃（用）上无污染的高质量产品的前提下，提高全社会的生产水平和生活质量，保护地球环境和人类美好的家园。EM菌种配制菌液的方法：⒈先烧开5公斤的水，加5%的红糖，把红糖汤开，把红糖里面的有害菌消除。⒉温度在不高于40度的情况下加1瓶菌种（10克）⒊然后把5公斤的菌水整体装进一个大塑料壶或者其他的容器中，要密封发酵，不能漏气。不要装的太满，在发酵过程中会产生气体，装满容易涨破塑料壶。⒋发酵10天左右，温度低要多发酵几天，打开瓶口，有气体产生。闻到酸甜闻到就证明发酵成功。⒌发酵成功后的菌液如果一次不能大量的使用完，就用小瓶子分装密封保存。使用一瓶打开一瓶。

真菌检验基本上可分为培养技术和非培养技术两大类。非培养技术又分为显微镜检查技术、生化免疫检查技术和分子生物学技术。前者是直接观察真菌形态，其中组织病理学检查为侵袭性真菌感染诊断的金标准；后者是检测真菌的抗原、抗体和核酸。这些技术的综合使用可大大地提高侵袭性真菌感染诊断的准确性。常见真菌检验技术其中直接检查、分离培养和病理组织检验为传统的检验方法。而血清学真菌抗原抗体检查以及真菌核酸检测均为近些年发展起来的新技术、新方法，这些新方法不需要对标本中真菌进行培养，从而检测周期短、检测方法简便，越来越受到临床的欢迎。1、真菌显微镜检查显微镜检查是最重要、最基本的检查方法。发现真菌的有形成分如菌丝、假菌丝或较多孢子往往提示真菌感染，临床上具有诊断价值。但是，见到菌丝孢子并不能确定真菌的种类。直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。阳性结果可确定真菌感染，而阴性结果不能排除诊断，主要原因与取材是否合格，标本处理是否得当有关，1次取材直接涂片法的漏诊率高达45%。如果在无菌体液中发现真菌成分常可确定诊断，但在有菌部位则只有发现大量菌丝才有诊断意义。通过直接镜检一般可区分念珠菌、隐球菌和毛霉菌等，但进一步明确菌种需要通过培养鉴定来完成。2、分离培养与鉴定技术目前引起深部真菌病的主要为念珠菌、曲霉菌和新型隐球菌，如分离出新型隐球菌、红色毛廯菌等致病菌时诊断可以确定，而分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉，应结合临床进行判断，而对于孢子丝菌取脓液、组织块作真菌培养，鉴定菌种即可确诊。无菌标本如血液、脑脊液和腹水分离出的条件致病菌常提示明确的感染，但来自痰、咽拭子、脓液以及尿标本分离出的条件致病菌则应慎重解释结果。任何一株培养结果都不能轻易视为污染。标本直接镜检的结果往往可以解释培养的菌种，应强调直接镜检与培养检查相结合的重要性。3、组织病理学组织病理学检查是侵袭性真菌病诊断的金标准。通过组织病理学检查可确定真菌的种、属，如隐球菌、念珠菌、曲霉、着色真菌等。如用特殊染色可提高阳性率。但确切的菌种还需要真菌培养确定，二者相互补充。真菌在组织内一般表现为:孢子：酵母和双相型真菌在组织内表现为孢子；菌丝：许多真菌在组织中只表现为菌丝。组织中发现无色分隔、分支的菌丝多为念珠菌和曲霉。粗大、不分隔、少分支的菌丝为接合菌，多为毛霉、根霉、犁头霉等。粗大、少分支、有隔的菌丝为蛙类真菌。棕色菌丝为暗色丝孢霉病，由暗色孢科真菌引起；菌丝和孢子主要见于念珠菌感染；颗粒为组织内有菌丝形成的团块；球囊获内孢囊球囊内含有内孢子，为球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构。4、真菌非培养检验技术真菌非培养检验技术既是一门传统的技术，也是一门新兴的技术。就传统而言，显微镜直接检查和组织切片检查都属于此类，而有关真菌结构或抗原检查、抗体检查和核酸检查则属于后一类。例如，现在应用广泛，并已经作为侵袭性真菌感染诊断标准的G试验、GM试验以及隐球菌抗原检查均属于新兴的真菌检验的非培养技术。其中G试验和GM试验最具有代表性

1.设定使用温度，通常为4℃后，先把离心陀放入离心舱中，注意离心陀要卡好轴心；关上舱门，离心舱的温度开始下降，预冷时间要充足。2.把样本装入适当的离心管，双双用天平平衡重量，盖上离心管盖子并旋紧。注意离心管只装七成满，虽然加有盖子，但也可能因离心力太强而外泄。大部分离心管都附有盖子，注意离心管的盖子也要一起平衡。离心管通常都会放在碎冰上，注意取出平衡时，要把碎冰的液体擦拭干净。落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡。3.把平衡好的离心管对称地放入离心陀中，盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧。若离心陀的盖子没旋紧，离心时会掉出来，造成很大的伤害！4.关上离心机舱门，在仪表板上调好所要的转速与时间；例如：8000rpm、30min。注意所用转速绝对不能超过离心陀的限定，最高转速通常写在离心陀上面，例如TGL-20M的最高转速为20000rpm，但若离心机太老旧，必须往下调降。转速与时间设定尽量不要太高，例如能使用7000rpm者就不要用8000rpm。5.确定所有步骤无误后，按Start按钮开动，离心机渐渐加速，此时要密切监控。有些老式的时间转钮，设定5min以下时，要先转过10min再转回5min。按Start的按钮时，按住时间不能太短，请持续按约一秒钟后才松开。开始加速的时候最危险，若发现声音不对，或产生大震动，请立刻按Stop。6.等到离心达到所要的转速后，确定一切正常才可离去。7.完成离心时，要等离心陀完全静止后，才能打开舱门；请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置，尽速把上清倒出，小心不要把沉淀弄混浊。不管所要的是上清或沉淀，请取用干净的烧杯收集上清，以免有失误。倾倒上清要很小心，以免把沉淀一起倒出来；若不慎混在一起，就要重来一次。若离心管有漏，要找出原因，并且立刻清理离心陀或离心舱。8.在两次离心之间的空档，不需取出离心陀，但盖上舱门，勿让热空气流入离心舱。9.全部使用完毕后，取出离心陀清理，可以用自来水冲洗，并且倒放晾干。离心舱门要打开，等结冰融化后，再稍加擦拭及清理，若有液体漏出，要用清水洗之。也要回头检查平衡离心管的天平以及桌面，很容易弄脏，要仔细清理干净才离开。

【目的与原理]】掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白的含量。血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。用盐析法沉淀血清中球蛋白，用双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。血清球蛋白的量从两者的差值求得。【试剂与器材】试剂：1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。保存于25℃以上的温度中。2、双缩脲试剂3、标准血清：市售或配制。4、乙mi器材：可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。【实验步骤】1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。以1ml刻度吸管吸取悬液1ml（相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。剩余的混悬液另加乙mi约2ml，揿住管口，在约20秒钟内颠倒混和40次，然后经每分钟2500转的速度离心沉淀5分钟。此时试管内分成三层：上层为乙mi，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白测定管”。在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”。2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。3、计算将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值：（1）总蛋白测定管光密度/ 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清总蛋白g/100ml（2）白蛋白测定管光密度/标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清白蛋白g/100ml（3）血清总蛋白—血清白蛋白=血清球蛋白g/100ml（4）血清白蛋白÷血清球蛋白=血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。【方法评估】本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。在25℃操作时，无结晶析出。用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。血清经盐析分离后，蛋白质的测定一般均用比色法。【应用意义】白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白>球蛋白，另一些鱼白蛋白【注意事项】1、某些用乙mi及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙mi，而用优质小张中速滤纸在37℃水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时可按1：20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在25℃以上的室温中进行。如受实验室条件限制，只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与本法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23%硫酸钠溶液（无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21%亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g，加蒸馏水到1L）。

1、你若随便穿戴，我便生死相依你进细胞房时不换鞋，不戴口罩，不戴手套，虽然感觉呼吸畅快全身轻松，但其实是进细胞房的最大忌讳！有更严格的细胞房连帽子都要戴上。这么随便的就把我带进去见你的细胞，难怪她会被你气死，换鞋就不说了，你应该也知道有真菌吧。但你根本不能保证你口腔支原体是不是会污染细胞，每当你兴高采烈地给你的细胞哈一口气送温暖的时候，细胞就……狗带了。不戴手套，根本就清除不掉你手上的细菌真菌，要不你试试拿火燎一下你的手，焦了才算把我除干净。2、你想用紫外和酒精摆脱我，却也无法斩断我对你的情丝虽然你很想摆脱我，想用紫外和酒精消灭我，是的，确实伤到我了，但是紫外和酒精最多只能灭细菌，对真菌伤害很小。你不戴手套，可劲用喷壶喷手，三个字：然并卵。用清洁超净台时为什么不用棉球而要用喷壶呢？因为用棉球的话，可以在灭菌的同时把菌体从手上撸下去。而喷壶只能短暂灭菌而已，所以要多用棉球，少用喷壶。3、世界那么大，我想去看看，可你却不停地召唤我回来①生物安全柜：这个家伙的玻璃窗是有警戒线的，超过这个警戒线，生物安全柜的风帘就起不到太大作用，而且会引入室内空气中的真菌，还会让你给细胞送温暖的呼吸里，自动带上支原体。②生物安全柜操作时：门前最忌讳乱堆东西，枪头盒、血清、管子，培养皿、移液器、酒精喷壶、酒精灯，堆了一大堆。有的都堵住了你门前的出风口。一来你操作起来并不是井井有条，会导致动作幅度过大，扰乱气流。二来这些东西本身也会挡住风口，扰乱气流。气流变化会直接导致外部不洁净的空气流入，也同样会导致生物安全柜的洁净作用失效。这必须要注意！4、不论你管不管我，我都在水浴锅里不离不弃水浴锅里是我的温床，你那么大胆的将你心爱的细胞放在我身边复苏，呵呵，37℃复苏完，你猜我刚刚对你的细胞都做了什么？湿漉漉的冻存管，任你再怎么喷酒精也并没有什么意义了。那要怎么办，水浴锅一来是定期清洁，二来是加一些抑菌剂，用一次一周可保证水浴锅清亮。5、真菌走了，留下的孽种叫孢子说完水浴锅，那接下去讲讲另一个坐拥37℃温床的水环境，也就是培养箱的水盘。有几次当你不高兴搭理我的时候，我就会放肆的生长，水盘里飘着特别大的一块块霉斑就是我的杰作。即使换了水，但是我留下的孢子，是你不敢想象的。一污染就一箱子全报废了，培养箱要定期用 Incubator Cleaner 擦拭隔板和内壁，为了你心爱的细胞着想，一周一次就够了。水盘也一样，水盘中加入Tray Cleaner就可以有效抑制和杀死细菌真菌。

凝胶电泳操作注意事项：1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。琼脂糖加样时候注意事项：1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。6、 电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。7、 在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。8、 如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。琼脂糖核酸电泳实验操作流程1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最jia分辨范围0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000

在过去十年里，多-能干细胞成为了多个领域的实用工具，帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。不论你用干细胞做什么研究，都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源，不过冷冻干细胞可不像冷冻已分化细胞那么简单。我们不能简单沿用普通细胞的冷冻试剂和方案。科学家们一开始对人胚胎干细胞进行操作时发现，一次冻融循环之后只有5%的细胞还具有多-能性。这是因为压力条件会促使细胞发生分化，如果保存的干细胞发生了随机分化，就没有价值了。另外，冷冻还会激活一个程序性死亡通路，而且在绝大多数情况下添加凋亡抑制剂收效甚微。科学家们一直在试图理解，低温究竟对多-能干细胞产生了什么影响，希望在此基础上开发更好的冷冻方法，让更多细胞存活下来。应该用什么来冷冻干细胞？这个问题的答案取决于你的细胞系，不过大多数成功的冷冻方案也有一些共同点。人们一般先用蛋白酶来解离细胞，然后进行离心，最-后用含有冷冻保护剂的培养基重悬。经典的冷冻保存培养基，由90%的胎牛血清（FBS）和10%的DMSO组成，DMSO可帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响。但是如果你的细胞要用于人体，上述试剂就不合适了，它们可能有毒会带来副作用。此外，使用90 FBS/10 DMSO混合物时，细胞复苏之后的活性往往较差。近来，研究者们纷纷开始使用无动物源成份的试剂，以及更低浓度的DMSO。Caspase抑制剂常被用来避免细胞凋亡。今年早些时候，RIKEN发育生物学中心的Teruo Akuta等人比较了不同的低温保存方案和试剂，为自己的胚胎干细胞和诱导多-能干细胞确定理想的培养基。他们发现，在冷冻前用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA处理，可以提高干细胞的复苏率。Akuta指出，干细胞喜欢抱团生长，但冷冻保护剂难以浸透较大的细胞团块，用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA可以将细胞分成大小均一的小簇。Akuta团队还改良了商业化的低温保护剂CP-1，CP-1含有羟yi基淀粉（植物源的冷冻保护剂）和DMSO。他们通过添加人血清白蛋白和乙二醇，进一步提高了培养基的效力。研究显示，添加乙二醇时的复苏效lv最高，有活力的细胞占到44%。不过，这样的组合并不一定适用于任何人。“并没有所谓的最jia冷冻保护剂，”牛津大学的Zhanfeng Cui说。他建议新手们尝试不同试剂，查阅用到了相同细胞系的文献。许多人直接把细胞放在10% 的DMSO里冷冻，然后等着出现好结果。“花几个小时查文献，就能为你节省大量的时间，”他指出。“培养干细胞是个高成本又费时的过程，我们要尽可能的保护资源。”冷冻的速度重要么？绝大多数低温保存方案是，先将样本放在–80 °C冰箱过夜，第二天再转移到液氮进行长-期储存。有研究发现，使用程序性的冷冻方法能获得更好的结果。这种方法通过特殊设备，控制样本温度以稳定速度降低（每分钟几度）。不过就算你没有这样的设备也不必灰心，因为也有文章认为最终的细胞产量并没有太大差异。现在还出现了一种新兴的冷冻方法，即玻璃化（vitrification）。玻璃化是指通过超快速冷却，形成糖浆一般的液态而不是结晶的固态。这种方法能避免形成冰晶，但需要高浓度的冷冻保护剂和特殊的设备。还是那句话，要反复尝试才能找到最shi合自己细胞的方案，”如果你只有–80度低温冰箱，那么就试着优化培养基提高产量。如果有条件，控制冷却速度和玻璃化冷冻都很值得一试。应该如何复苏干细胞？在理论上，细胞在–196 °C的液氮中可以稳定存在很多年。激活细胞死亡和分化通路的是冷冻和复苏过程。因此，复苏干细胞的时机完-全取决于你自身的需要。冷冻过程需要慢而稳，而细胞复苏要很快。对于细胞复苏而言，速度是很有必要的，现在大家都在追求快速复苏。干细胞的试管可以放在37°C水浴中解冻，然后用生长培养基重悬。如果想除去DMSO，还可以洗几个循环。细胞复苏之后，最-好用几天时间来培养，筛查它们的功能是否正常。我能得到怎样的产量？如果幸-运的话（你的干细胞系特别有活力），第1次进行冻融可能会得到40%、50%甚至更高的产量。但是如果你的产量只有10%左右甚至更低，也完-全用不着惊讶。方法的优化往往需要多次尝试。另外计算产量不要操之过急，最初的细胞活力可能有误导性，细胞解冻之后有时要过一会儿才开始死亡，你可能会最终失去植板的细胞。研究显示，细胞死亡在植板后大约24小时达到高峰，因此最-好等一等再来计算产量。复苏后的细胞还是干细胞么？对于干细胞而言，复苏得到活细胞并不是我们的最终目标，关键问题是，这些细胞是否丧失了多-能性。除了在显微镜下分析形态，观察细胞植板后的生长模式，他还建议在冻融循环前后用相应标记（例如Oct-4）进行染色。这样我们就能够了解干细胞的分化情况。在细胞复苏后，也可以通过商业化芯片来检测拷贝数变异、表观遗传学改变和染色体畸变。复苏的产量低没什么大问题，我们只需要培养更多细胞就行。但是我们不能假定存活下来的细胞与原始细胞相同，特别是在产量很低的情况下。存活下来的细胞可能经过了某种选择。

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。细胞复苏步骤一.实验前准备：将水浴锅预热至37℃。细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面。在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等。二．取出冻存管：根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。三．迅速解冻：迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中的液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中1000r/min，离心5min。五.制备细胞悬液：吸弃上清液。向离心管内加入10ml预热的培养液，吹打制成细胞悬液。用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。六.细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。七.培养细胞：将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。八. 记录复苏日期：细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面容易出问题的部分，因此必须注意以下几点~注意无菌操作。取细胞的过程中可能会接触液氮，一定注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，如果冻存管密封不严，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时，在水浴中摇晃，冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸，所以，一定要戴保护眼镜和手套，复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖。应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外，细胞复苏后的操作Hao在4℃冰浴中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮取出的细胞在短的时间内放入水浴锅。离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液，经验总结，培养基越少细胞越容易贴附。复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果加培养基的太少，DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响。还有一个说法是1％。所以如果冻存液的浓度是10％DMSO，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。初学者易犯的错误：水浴锅未预热或者未预热到37℃直接融化。水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡，像水土不服一样。结果分析：判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。

从产生误差的根源上消除系统误差在测定之前，要求检测人员在检测过程中可能产生的系统误差进行认真的分析，必须尽可能预见一切可能产生系统误差的来源，并设法消除或尽量减弱其影响。例如，测量前对仪器本身性能进行检查，使仪器的环境条件和安装位置符合检验技术要求的规定；对仪器在使用前进行正确的调整；严格检查和分析测量方法是否正确等来消除仪器、检测方法、环境等因素而产生的系统误差；为防止因仪器长-期使用而使其精度降低，及时送计量部门进行周期检定。用校正方法来消除系统误差这种方法是对取测量用的滴定管、移液管、容量瓶等计量器具，在测量前进行修正，做出校正曲线或误差表，测量后对实际测量值进行修正，从而避免或消除因此而产生的系统误差。用空白实验来消除系统误差空白试验是指在不加试样的情况下，按分析检验方法标准或规程在同样的操作条件下进行的测定。空白试验所得结果的数值为空白值。然后再对加入被测试样按分析检验方法标准或规程在同样的操作条件下进行测定得出试样的测定值，最-后从试样的测定值中扣除空白值，就得到比较准确的分析结果，这样可以消除因蒸馏水含有杂质或所使用的试剂不纯所产生的系统误差。采用对照试验消除系统误差对照试验就是用同样的分析方法在同样的条件下，用标样代替试样进行的平行测定。通过对照试验可以校正测试结果，消除系统误差。不变系统误差消除方法对测量过程中存在固定不变的系统误差，可以采用以下消除方法：①交换法：根据误差产生的原因，将引起系统误差的某些条件相互交换，其他条件保持不变，使产生系统误差的因素对测量结果起相反的作用，从而消除系统误差。如用等臂天平称量时，由于天平左右两个臂长有微小差别，称量时会产生恒值系统误差。如果将被称量物品与砝码在天平左右称盘上交换，称量两次，取两次测量结果的平均值为被测物品的最终测量结果，就可以消除天平两臂不等而带来的系统误差。②抵消法：即要求进行两次测量，改变测量中的某些条件，如测量方向、电压极性等，使前后两次测量的系统误差大小相等、符号相反，取两次测量结果的平均值即可消除系统误差。③代替法：这种方法是在不改变测量条件的前提下，用已知的标准量代替被测量，再次进行测量，得出被测量与标准值的差值，即被测量等于标准值加差值，从而达到消除系统误差的目的。④零示法：为了消除指示仪表不准而造成的系统误差，在测量过程中使被测量对指示仪表的作用与已知的标准量对它的作用相互平衡，使指示仪表示零，这时被测量的量值就等于标准量值，这就是零示法。例如，电桥电路、电位差计等等都是用这种方法来消除指示仪表不准引起的系统误差。变化系统误差的消除法①半周期消除法：对于周期性误差，可以相隔半个周期进行一次测量，然后以两次读数的算术平均值作为测量值，即可以有效地消除周期性系统误差。例如，指针式仪表，若刻度盘偏心所引出的误差，可采用相隔180°的一对或几对的指针标出的读数取平均值加以消除。②对称测量消除法：对称测量法可以有效消除随时间变化而产生的线性系统误差。如用电压表进行电压测量时，在测量前先将电压表校准调零后，再对电压源的电压进行测量，随着测量时间的推移，电压表的零点逐渐漂移而产生线性系统误差，为了求得待测电压源与标准电源的电压之差，可以进行等时间间隔测量，则电压表所示的待测电压与标准电压之差不受系统误差的影响。

　　文献分析方法无法重现主要有以下几个原因：　　1，  测试环境因素；　　2，  关键试剂；　　3，  仪器设备影响；　　4，  检测参数差异；　　5，  操作人员水平；　　6，供试品性质不同。　　（一）测试环境因素　　测试环境主要有温度、湿度、震动等方面。最为常见的实例就是一些校正因子，南北方往往做出来的结果不同。当然这些影响需要结合我们供试品性质具体分析了，找出关键影响因素。　　（二）关键试剂　　目前市场上试剂的质量参差不齐，不同品牌的试剂同一条件做出来的实验结果不同，这种案例太多了。例如很多进口试剂做液相方法走出来的干扰峰少。　　（三）仪器设备影响　　不同仪器的精度和检测范围有差别，所以做出来的结果也会有差异。　　（四）检测参数差异　　对于色谱分析，这个参数影响比较大的是色谱柱。很多文献仅提供了色谱柱的填料类型没具体规定具体厂家、填料键合相、规格等具体信息，所以造成很多方法无法重现。　　（五）操作人员水平　　操作人员熟练程度不同、操作方式不同、个人习惯不同都会导致方法无法重现。例如①液相分析对于等度条件，流动相泵混合和手动混合方式不同做出来的结果也会有差异；②配制混合流动相混合和抽滤顺序不同也会造成实验结果不同。　　（六）供试品性质不同　　很多文献我们查询的被测物的工艺和我们供试品的不同，所以供试品体系也会有差异，这样也会造成分析方法无法重现。

　　离心机是实验室的精密仪器，因此需要好好的维护，在每次实验过后都会出现清洗的情况，平时也会出现维护的情况，下面的一下基本的原则与要求。　　离心机洗要求　　在离心机内腔，设置多个清洗头或清洗管，离心机可在不开盖或运转过程中对离心机内部进行清洗。重点有以下几个部位：　　(１)转鼓底面及轴承座部位的清洗；　　(２)拦液板表面及转鼓筒体外表面；　　(３)转鼓筒体内表面；　　(４)翻盖内表面及进料、刮刀等装置表面；　　(５)外壳内表面。　　离心机维护规则　　1.一次规则　　当系统出了故障，你可以试探性地改变某些状态，一次可以改变一个参数。做一些简单的改变步骤，也许就能解决问题。　　2.二次比较规则　　在动手检修之前已经明确了故障所在，或者已经确定了解决故障的方案。换句话说，动手之前已经找对了解决办法。例如，在进样过程中发现内标物的峰值变低了，可以重复进样看看重复性如何，如果是偶然变低，是否是定量管里进了气泡。这个规则可用于考察系统改变后的情况。更换了流动向后在正式进样前可以进两次标准品以检查保留时间的稳定情况和色谱峰的稳定性。在梯度洗脱中如果出现了多余的峰，可以空载梯度洗脱一次(真的有问题吗？)，用此规则可以避免不必要的改变，尽快确定纠正措施。　　3.取代规则　　用好的部件换下可疑的部件，是查找故障的最好方法。如果你怀疑检测器引起了噪音，就换一个性能好的无转子硫化仪检测器。如果故障被排除了，就说明换下的检测器有问题。这个规则应用的规模有大有小，可以从换整个部件到换印刷线路板上的集成块。　　4.换回规则　　这个规则和取代规则一起运用，好部件取代了溶体流动速率测定仪可疑部件后情况并未得到改善，应重新换上原部件。这样做的维修费用最小，也防止了用过的部件积压下来无转子硫化仪。这条规则仅适用于单一的故障。换回原则不适用于以下的情况：　　(1)在取下时新部件已损坏(如泵密封垫圈)；　　(2)部件价格低(如柱内衬过滤片)；　　(3)重新装上原部件要冒损坏的风险；　　(4)定期更换的部件。　　5.参考条件规则　　通常有两种参考条件：①标准参考条件；②试验参考条件。　　标准参考条件也叫标准试验条件，是从一个系统到另一个系统，从一个实验室到另一个实验室都易于验证的条件。用该条件所测得的数据有助于识别实际试验和系统间的问题。如果在某试验条件下系统压力升高，而在标准条件下压力正常。这说明溶体流动速率测定仪系统异常是由实验室的变化所引起的。下表列举了启用新色谱柱是的标准试验条件，在使用过程中也可用此标准试验条件检查系统的情况。

　　配制溶液时怎么使用容量瓶？下面一起来了解一下！　　(1)使用前检查瓶塞处是否漏水。向容量瓶内加少量水，塞好瓶塞，用食指顶住瓶塞，用另一只手的五指托住瓶底，把瓶倒立过来，如不漏水，正立，把瓶塞旋转180度后塞紧，再倒立若不漏水，方可使用。　　(2)把准确称量好的固体 溶质放在烧杯中，用少量溶剂溶解。然后把溶液沿 玻璃棒转移到容量瓶里。　　为保证溶质能全部转移到容量瓶中，要用溶剂多次洗涤烧杯，并把洗涤溶液全部转移到容量瓶里(见图a)。　　(3)向容量瓶内加入的液体液面离标线1~2厘米左右时，应改用滴管小心滴加，最后使液体的弯月面（凹液面）与刻度线正好相切。　　(4)盖紧瓶塞，用倒转和摇动的方法使瓶内的液体混合均匀(见图b)。　　(2)(3)详细步骤：　　用容量瓶配制 标准溶液时，先将精确称重的 试样放在小烧杯中，加入少量溶剂，搅拌使其溶解（若难溶，可盖上 表面皿，稍加热，但必须放冷后才能转移）。沿搅棒用转移沉淀的操作将溶液定量地移入洗净的容量瓶中，然后用 洗瓶吹洗烧杯壁2～3次，按同法转入容量瓶中。当溶液加到瓶中2/3处以后，将容量瓶水平方向摇转几周（勿倒转），使溶液大体混匀。然后，把容量瓶平放在桌子上，慢慢加水到距标线2-3cm左右，等待1～2min，使粘附在瓶颈内壁的溶液流下，再改用 胶头滴管滴加，眼睛平视标线，加水至溶液凹液面底部与标线相切。立即盖好瓶塞，用掌心顶住瓶塞，另一只手的手指托住瓶底，注意不要用手掌握住瓶身，以免体温使液体膨胀，影响容积的准确（对于容积小于100mL的容量瓶，不必托住瓶底）。随后将容量瓶倒转，使气泡上升到顶，此时可将瓶振荡数次。再倒转过来，仍使气泡上升到顶。如此反复10次以上，才能混合均匀。　　使用时应注意：当溶质溶解或稀释时出现吸热放热时，需先将溶质在烧杯中溶解或稀释，并冷却。　　1.计算　　2.称量　　3.溶解　　4.转移　　5.定容　　6.摇匀

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一 poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。3）用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)0.5mol/L NaCl1mmol/L EDTA(pH8.0)0.1％SDS可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无 RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌，待其次序却至65℃左右时加入已在 65℃预热30分钟的10 ％SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。4）用灭菌水溶解RNA，于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温，加等体积的2x层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后，加1倍体积的1x层析柱加样 ，继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。5）当全部溶液流出后，将收集液置于65℃温育5分钟，重新上样，并收集流出液。6）用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床， OD260会很高，后来OD260值则很小或为零。在某些方案中，上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有， 因此这一步骤可以省略。7）用2－3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA，以1/3－1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)1mmol/L EDTA(pH8.0)0.05％SDS用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压会使溶产生大量气泡。8）收集液置于透明的小溶器内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮 oligo(dT)－纤维素亲和量层析后得到的RNA中，带与不带poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA，可将洗脱液于65 ℃温育3分钟，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为0.5mol/L，用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。9）收集 oligo(dT)－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。10）于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA，小心弃去上清液，用70 ％乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。11）用少量水重溶RNA，置于比色杯内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗。12）将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加3倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收RNA时，只需取出一小份贮存液，加3mol/K乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L， 混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。i.OD260＝1的溶液其RNA含量约为40μg/ml.ii.从 107个哺乳动物培养细胞中可获得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1－2％。

(一)实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，用显微镜直接测定微生物总细胞数。(二)实验原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和稀释平板计数法。直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同、只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。血球汁数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度应有两种：一种是计数区分为16个大方格(大方格用三线隔开)，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开)，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1／4000mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。已知：1mL体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3所以：1mL体积应含有小方格数为1000mm3／(1／4000mm3)＝4x106个小方格。即系数K＝4x106。因此：每mL菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N) x系数(K) x菌液稀释倍数(d)。（三)实验器材(1)活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )斜面菌种或培养液。(2)器材：显微镜、血球计数板、盖玻片(22mm x 22mm)、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。（四）实验方法(1)视待测菌悬液浓度，加无菌水适量稀释(斜面一般稀释到10-2)，以每小格的菌数可数为度。(2)取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。(3)将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，注意不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。(4)静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小孔径光阑并减弱光照的强度。(5)计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格(即100小格)的菌数。如果是25个大方格组成的计数区．除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数(即80个小格)。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。(6)对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，求出每一个小格中细胞平均数(N)，按公式计算出每mL(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。(7)测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

实验室溶液制备是准确进行各类实验的基础，今天，和大家一起学习了解一下标准溶液相关配制知识。标准溶液就是已确定其主体物质浓度或其他量值的溶液。不同的情况需使用不同的标准溶液，可千万别一概而论。1.配制和标定方法（1）直接配制法基准物→干燥处理→分析天平称量→溶于纯水→转入容量瓶（已校正）→纯水稀释至刻度→摇匀。（2）标定法标定：①非基准物质先配置成近似（略高）所需浓度溶液；  ②再用基准物质测定其准确浓度，这一操作称为标定。三种方法：包括直接滴定法、间接滴定法、比较法。2.能用于直接配制或标定标准滴定溶液的物质，称为基准物质。基准物质必须符合下列要求：①物质必须具有足够的纯度，其纯度要求达到99.9%以上；而杂质含量应低于滴定分析所允许的误差限度；②物质的组成（包括：其结晶水含量）应恒定并与化学式相符；③试剂性质稳定，不易吸收空气中水分、二氧化碳或发生其他化学变化；④具有较大的摩尔质量。能够满足上述要求的物质称为基准物质，如，无水碳酸钠、邻苯二甲酸氢钾、重铬-酸钾、氧化锌、碳酸钙等。对于如，盐酸、氢氧-化钠、高锰-酸钾、硫代硫酸钠等不符合基准物质条件的试剂，不能用直接法配制标准滴定溶液，需要采用间接法。3.制备标准滴定溶液的注意事项在配制和标定滴定溶液时，必须注意尽可能地降低操作中的误差，其中最重要的是：（1）试样质量不能太小，以保证分析结果的准确度，一般分析天平的称量误差为±0.0002g，因此，试样量必须大于0.0002g。而滴定管读数常有±0.02mL的误差，所以消耗滴定剂的体积必须在20mL以上。（2）应使用校准过的仪器。通常应将所使用的设备、量器如滴定管、容量瓶、移液管等做相对校准。（3）标定标准滴定溶液于测定试样组分时的实验条件，应力求一致，以便抵消实验过程中的系统误差。溶液配制的注意事项1.分析实验所用的溶液应用纯水配制，容器应用纯水洗涤三次以上，特殊要求的溶液应事先做纯水的空白检验。2.溶液要用带塞的试剂瓶盛装；见光易分解的溶液要装于棕色瓶中；挥发性试剂（如，有机试剂）配制的溶液，瓶塞要严密；见空气易变质及放出腐蚀性气体的溶液也要盖紧，长期存放要用蜡封住；浓碱溶液应用塑料瓶装，如装在玻璃瓶中，要用橡皮塞塞紧，不能用玻璃磨口塞。3.每瓶试剂瓶必须有标明名称、规格、浓度和配制日期的标签。4.配制硫酸、磷酸、硝酸、盐酸等溶液时，都应把酸倒入水中。对于溶解时放热较多的试剂，不可在试剂瓶中配制，以免炸裂。配制硫酸溶液时，应将浓硫酸分为小份慢慢倒入水中，边加边搅拌，必要时以冷水冷却烧杯外壁。5.有机溶剂配制溶液（如，配制指示剂溶液时），有时有机物溶解较慢，应不时搅拌，可以再热水浴中温热溶液，不可以直接加热，易燃溶剂使用时要远离明火。几乎所有的有机溶剂都有du，应在通风柜内操作。应避免有机溶剂不必要的蒸发，烧杯应加盖。6.要熟悉一些常用溶液的配制方法。如碘溶液应将碘溶于较浓的碘化钾水溶液中，才可稀释。配制易水解的盐类的水溶液应先加酸溶解后，再以一定浓度的稀酸稀释，如，配制SnCl2溶液时，如果操作不当已发生水解，加相当多的酸仍难溶解沉淀。7.不能用手接触腐蚀性及有剧毒的溶液。剧毒废液应作解毒处理，不可直接倒入下水道。

在实验室的监控项目中，不同实验室对温湿度都有要求，大部分实验都是在明确的温湿度环境中展开。在医药、生化、仪器校准、农业、建筑与电器等领域中，实验室环境条件直接影响着各种实验或检测结果，每项实验的进行都需要精确可靠的监测仪器提供准确的环境参数数据。实验室要求适宜的温度和湿度。室内的小气候，包括气温、湿度和气流速度等，对在实验室工作的人员和仪器设备有影响。夏季的适宜温度应是18～28℃，冬季为16～20℃，湿度最好在30%(冬季)～70%(夏季)之间。除了特殊实验室外，温湿度对大多数理化实验影响不大，但是天平室和精密仪器室应根据需要对温湿度进行控制。首-先，识别各项工作对环境温湿度的要求：主要识别仪器的需要、试剂的需要、实验程序的需要，以及实验室员工的人性化考虑（人体在温度18～25℃，相对湿度在35～80%范围内总体感觉舒适，并且从医学角度看环境干燥和喉咙的炎症存在一定的因果关系）四个方面要素综合考虑，列出对温湿度控制范围要求的清单。第二：选择并制定有效的环境温湿度控制范围：从以上各要素所有要求清单中摘取最窄范围作为该实验室环境控制的允许范围，制定环境条件控制方面的管理程序，并依据该科室实际情况制定合理有效的SOP第三：保持和监控：通过各项措施保证环境的温湿度在控制的范围内，并对环境温湿度进行监控和做好监控的记录，超过允许范围及时采取措施，开空调调节温度，开除湿机控制湿度。某实验室温湿度控制标准（仅供参考）：实验室监控房间：试剂室      温度10～30℃，湿度35～80%样品存放室  温度10～30℃，湿度35～80%天平室      温度10～30℃，湿度35～80%水分室      温度10～30℃，湿度35～65%红外室      温度10～30℃，湿度35～60%中心实验室  温度10～30℃，湿度35～80%留样室      温度10～25℃，湿度35～70%实验室的标准温度为20℃，一般检测间及试验间的温度应在20±5℃，线值计量标准间为20±2℃，电工与无线电专业的标准间和线值计量的计量检测仪器间为20±3℃，实验室内的相对湿度一般应保持在50～70％。实验室温湿度控制要求环境条件温湿度的控制方面考虑的要素就是保证实验操作的环境温湿度是能够满足实验程序各个过程的需要。我们主要从以下几个方面来制定实验室环境温湿度控制范围。首-先，识别各项工作对环境温湿度的要求。主要识别仪器的需要、试剂的需要、实验程序的需要，以及实验室员工的人性化考虑（人体在温度18～25℃相对湿度在35～80%范围内总体感觉舒适，并且从医学角度老看环境干燥和喉咙的炎症存在一定的因果关系）。小结普通的化学实验一般只控制温度，实验室温度控制在20～25℃，湿度一般在80%以下就可以了。常温留样室温度是10℃～30℃，阴凉留样室是温度不高于20℃，湿度应该是45～75%。

1. 蒸馏水指天然水经过蒸馏、冷凝等方法，以除去其中杂质(杂质分子或阴、阳离子)，得到的纯水。而蒸馏水为软水。2. 硬水硬水分为暂时硬水(含碳酸氢钙、碳酸氢镁)和永-久硬水(含硫酸钙、硫酸镁或氯化钙、氯化镁)。永-久硬水是指溶有较多Ca2+、Mg2+的盐酸盐、硫酸盐的水，用药剂或阳离子交换法可软化。3. 软水水硬度的标准：相当于每升水含10毫克CaO为1度或1°。硬度8°以上为硬水，8°以下为软水，30°以上为最硬水，自来水的硬度在25°以下。4. 重水“重水”指由氘(D)和氧原子构成的水，其分子式为D2O，分子量为20。普通水中，重水所占比例为每6900个H2O中有1个D2O。重水作为原子反应堆中的中子减速剂。5. 生理盐水是指质量分数为0.9%的NaCl溶液。6. 卤水海水中提取出食盐后含有MgCl2、CaCl2、NaCl及少量MgSO4的水。7. 双氧水具有很强的氧化性。但遇见强氧化剂时，又表现出还原性，如：5H2O2+2KMnO4+4H2SO4=2KHSO4+2MnSO4+8H2O+5O2↑。H2O2不稳定，见光易分解，所以要放入棕色试剂瓶中保存。8.石灰水指Ca(OH)2的水溶液。应密封保存，防止与空气中CO2反应变质：Ca(OH)2+CO2=CaCO3↓+H2O。石灰水也是检验CO2的常用试剂。9. 氨-水指氨气的水溶液，发生的反应是：NH3+H2O⇌NH3·H2O⇌NH4+ +OH-。氨-水中含有六种微粒：分子(NH3、NH3·H2O、H2O)；离子(NH4+、OH-、H+)。其中NH3·H2O是不稳定的弱碱，易发生分解反应：NH3·H2O=NH3↑+H2O。10. 氯水氯气的水溶液，发生的反应是：Cl2+H2O⇌HCl+HClO。氯水中共含有三分子四离子：分子（Cl2、HClO、H2O）；离子（H+、Cl-、ClO-、OH-）。其中次氯酸HClO具有强氧化性，可将有色物质氧化成无色物质，具有很强的漂白作用。HClO是不稳定的弱酸(比H2CO3还弱)，见光发生分解：2HClO=2HCl+O2↑。11. 王水浓HNO3：浓HCl=1：3(浓溶液的体积比)。王水是比硝酸更强的氧化剂，能溶解不活泼金属金(Au)和铂(Pt)。王水性质不稳定，故须在使用前配制。12. 水玻璃Na2SiO3的水溶液。Na2SiO3俗称泡花碱，是一种水溶性硅酸盐，其水溶液俗称水玻璃，是一种矿黏合剂。

  样品空白作用：  1、样品空白可以抵消加入测试试剂前由于样品自身存在的色度或浊度而引起的正误差。  2、在使用样品空白对测试仪器进行调零后，只有样品与测试试剂发生反应而产生的色度被测定了。由于样品的背景色度和浊度往往各不相同，样品空白经常用来对仪器进行调零。  如：显色反应，按照与显色反应相同的条件，取同样量的样品溶液，但不加显色剂作为空白溶液，这适宜于样品基体有色，显色剂无色也不与样品基体显色的情况。  如，用硫氰酸盐测定钼时，通常以不加硫氰酸盐（其它操作不变）作空白，以消除Cr3+,Ni2+,Cu2+等有色离子的影响。  样品空白与空白样品  1、二者在取样上存在不同，一个是取纯水，另一个是取待测样品。  2、二者所用的分析方法不同，一个采用参照分析法，在分析的过程中不加任何显色剂成分，另一个则完全靠分析方法操作。  3、校正内容不同，一个是校正样品本身在某一波长下的吸光度，而另一个则校正试剂以及纯水中所含的待测成分与相应的干扰成分。  工作中常见情况分析  以空气中有毒物质检测为例：  在工作场所空气中有毒物质检测过程中，样品空白经常出现的现象有以下几种:  (1)采集的样品空白测定结果均与实验室空白(试剂空白) 基本一致；  (2)采集的样品空白中，其中一个与实验室空白(试剂空白) 基本一致，其余的测定结果偏大；  (3)采集的样品空白测定结果均较大。  出现(2)、(3)现象时，如果空白测定结果明显偏大，甚至高于样品测定值，则空白样品可能已被污染。  产生污染的原因  (1)空气收集器未经质量验收，空气收集器的本底值较高，影响检测结果。如用于采集钠等金属元素的微孔滤膜中可能会含有微量的钠等金属，采样后，可能会出现样品空白的吸光度高于样品吸光度的现象，使得检测结果为负值。  (2)空气收集器未清洗干净，使得样品空白值高于实验室空白。  (3)采样过程不规范，导致样品空白值异常。  (4)样品运输和保存不规范，导致样品被污染，样品空白值也较高。  如，使用沾污的样品保存箱运输、保存样品，或者中途无意打开样品空白等，都会影响样品空白值。  (5)样品预处理、测定步骤不规范，实验室环境交叉污染等同样会导致样品空白被污染。  如何处理？  样品空白值小于等于测定方法的检出限，说明样品在各个环节没有受到污染；  若大于检出限，小于方法空白样，则修正样品测得值；  若大于方法空白值，甚至大于样品值，说明样品被污染，检测结果应舍弃。  样品空白值如何取舍？  试剂空白值应小于所用测定方法检出限的1/2，样品空白也应小于或等于检出限。  如果两个样品空白值差异比较小，可以取均值或者取较大的那一个。  如果两个样品空白值差异较大，超出10%，就要分析原因，如果无法解释，则意味着本次采样失败，需要重新采样！  样品空白的意义  1、样品空白是由样品本身决定的，即使是无吸光值的蒸馏水，在实验的过程中如若不进行校正，那么分析的结果就会有误差，进而影响分析数据的准确性；  2、减少分析过程中出现的误差；  3、减少开支；  4、简化分析操作过程。  关于样品空白常见疑问解答  1、原子荧光实验设置参数中的样品空白是什么？  不加入样品，与样品一起加入同样的处理试剂和经过同样的消化、赶酸、定容步骤后得到的溶液即为样品空白，将该溶液所在位置设为样品空白，则样品的上机获得的荧光值均需减去该溶液的荧光值，得到真正的样品检测荧光值。  2、实验中做的试剂空白和样品空白，两者有何异同？  答：试剂空白是指由于测试试剂本身而带来的测试结果的微小的正误差。样品空白是指在某项测试程序中，使用某个样品的浓度作为仪器的零基准。样品空白可以抵消加入测试试剂前由于样品自身存在的色度或浊度而引起的正误差。一般情况下,试剂空白要求用高纯度的去离子水做。  3、本人最近一段时间用原子吸收石墨炉法测铅时，发现样品空白很高，大概有0.05左右（原来的是0.01～0.02左右，换了试剂做还是这样），做了很多次都是这样，而且有两个样品空白，平行性很好，为什么样品出现负值？  答：样品前处理用的试剂质量有问题，不知道你用的是微波消解、干法消解还是湿法消解？微波消解使用试剂量较小，出现上述问题的状况较少。干法消解还是湿法消解对试剂的要求较高，样品处理时反应剧烈，有损失，注意控制消解时的反应强度。

接种是微生物技术中最基本的操作之一，接种技术在微生物的分离纯化、生理生化等试验中都非常重要。由于接种的目的不同，所采用的接种方式也不同，接种可分成斜面接种、穿刺接种和三点接种等。选择正确的接种方法，对于微生物的分离、纯化、增殖和鉴别都有重要作用。因接种方法的不同，常常采用不同的接种工具，如接种环、接种针、移液管和涂布棒等。在接种过程中，必须进行严格的无菌操作无菌操作一般是在无菌室或接种箱内进行，并靠近煤气灯（或酒精灯，一般用酒精喷灯）的火焰操作。有条件的也可在超净工作台上操作。微生物三点接种法：三点接种是为了获得单菌落所使用的方法之一，它是在培养皿上接种，即用接种针蘸取少量霉菌孢子，在浇有琼脂培养基的培养皿（俗称平板）上，以等边三角形的三点轻轻点一点，培养后即在此三点上长出菌落。其优点是:同种菌落有三个重复，同时在菌落彼此相接近的边缘常留有一条狭窄的空白地带此处菌丝生长稀疏，较透明，还分化出典型子实体，因此可以直接把培养皿放在低倍镜下观察，便于根据形态特点进行菌种的鉴定。具体操作如下步骤一，倒平板，将已灭菌的琼脂培养基放在水浴锅上加热熔化，待冷却至45℃（手握不觉太烫为宜）后，用无菌操作法倒平板。步骤二，标明三点位置，待平板凝固后，在培养皿底部注明菌种、日期等，并以等边三角形的三个顶点标上记号。步骤三，右手拿接种针，先在火焰上烧红灭菌并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。步骤四，蘸取孢子，将灭过菌而且蘸湿的接种针伸入菌种管，用针尖蘸取少量霉菌孢子。步骤五，点接，以垂直法或水平法把接种针上的孢子点到预先标记好的部位，注意切勿刺破培养基。将培养皿倒置，于28℃恒温条件下培养，48h后观察生长情况。在接种的过程中需要注意哪些问题呢？（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。（5）恒温培养箱应经常清洁消毒。

　　细胞培养箱是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必须的关键设备，细胞培养箱广泛应用于细胞、组织培养和某些特殊微生物的培养，常见于细胞动力学研究、哺乳动物细胞分泌物的收集、各种物理、化学因素的致癌或毒理效应、抗原的研究和生产、培养杂交瘤细胞生产抗体、体外授精(IVF)、干细胞、组织工程、药物筛选等研究领域。　　细胞培养箱的污染来源　　对于细胞来说，非常理想的培养环境同样也适合这些污染物的生存，培养箱本身是不会辨别的，而细胞培养中大部分时间里细胞都是位于培养箱内，因此箱体内能否抑菌或灭菌非常关键!　　细胞培养箱中的主要污染源：细菌、真菌(霉菌和酵母菌)、病毒、支原体、非同种细胞。　　支原体：支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞已经受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等，往往被大多数实验者忽视。　　细菌：细菌污染后，培养基1-2天就会变色，对细胞生长影响明显，应迅速将污染细胞与其它细胞系隔离，灭菌后丢弃，还要用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台。　　病毒：由于病毒寄生生存，爆发后尽快和正常细胞隔离，丢弃处理，相对来说容易处理，对操作者威胁较大;尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。　　真菌(霉菌和酵母菌)：真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了;目前没有好的抑制方法，包括现在常用的两性霉素，一旦污染容易反复爆发，尤其孢子很难杀灭。　　非同种细胞：即细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

做蛋白表达实验时，通常用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，MARK是其中非常重要的参照物，使用Mark会遇到以下几种情况：条带模糊：电压过高或电泳时间过长，产热过多导致电泳缓冲液温度升高。建议参照Trans产品使用说明书。电泳缓冲液陈旧，建议使用新鲜的电泳缓冲液，为了获得理想的结果建议在使用前将缓冲液预冷。分离胶的浓度偏低，建议使用合适的胶浓度。SDS-PAGE凝胶放置时间过长，建议使用新配制的凝胶电泳。带型不整齐：建议点样时将蛋白marker 放在泳道中间。如在凝胶两侧泳道，由于边缘效应，离子强度不匀等，均会导致带型变宽或弯曲。凝胶配制不匀，凝胶内存有气泡，或点样孔中有细碎的残胶。样品滞留点样孔：浓缩胶配制有问题或胶孔堵塞。Marker蛋白表达检测免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。技术原理免疫荧光技术是根据抗原-抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在抗体的性质和定位。

对于分析蛋白质个体和蛋白质复合物，鉴定蛋白质与蛋白质、核酸之间的相互作用，蛋白质的纯化是这些研究的基石。由于纯化天然蛋白是一件ji具挑战性的工作，科学家开发出来利用标签融合蛋白来捕获纯化和检测目的蛋白的实验体系。纯化蛋白最-有效的就是亲和层析，它是通过目的蛋白与相匹配的固定化配体的进行特异性结合，实现纯化目的。最显着的特点就是，良好表征的标签与其对应的固相偶联的配体的结合，能够对标记蛋白单步操作实现亲和纯化。融合标签的抗体也被广泛用于下游检测和实验，从而无需针对每种特定重组蛋白去开发相应的探针。抗体纯化主要涉及从血清（多克隆抗体）、腹水和杂交瘤细胞系培养上清液（单克隆抗体）中选择性富集或特异性分离抗体。Protein A，Protein G和Protein L是三种细菌蛋白，因其与抗体的高效结合而被大家所熟知。这些蛋白经过基因工程编辑重组表达，通常用于从各种不同物种中进行关键抗体类型的亲和纯化。分类：1.抗体纯化填料/预装柱/试剂盒抗体纯化产品包括Protein A, Protein G, Protein A/G, Protein L。2.蛋白纯化填料/预装柱/试剂盒蛋白质纯化产品包含His, GST, MBP, Flag, Biotin, Strep II-Tag标签纯化。3.其它纯化填料/预装柱/试剂盒包含肝素（ Heparin）填料、苯甲脒（ Benzamidine）填料及内毒素清除填料。

牛血清白蛋白（BSA），是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，分子量为66.446KDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用。主要成分：1.蛋白质——是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。2.多肽——血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。3.激素——胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关；类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用；促生长激素：促细胞增殖效应。4.其他成份——氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。结构与作用：牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/1000ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含己糖和己糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 Da，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在wesern blot中作为Blocking agent。BSA一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加 BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10"20min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。牛血清白蛋白（BSA）的用途如下：1、用于生化研究、遗传工程和医药研究2、用作医药保健食品、调味品3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率应用：牛血清白蛋白（BSA）在生化实验中有广泛的应用, 例如在WB实验中加入BSA, 通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。