一、基本原理不同带电颗粒，因其所带电荷的性质和多少、形状和大小等差异，使其在同一电场强度、相同的支持介质和缓冲液的条件下，各自的泳动速度不同，从而使各种不同的带电颗粒如蛋白质、核酸等生物大分子得以分离。带电颗粒在电场中泳动速度以迁移率(mobility)表示。故迁移率可定义为带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，是指在1V／m的电场作用下，带电颗粒每秒钟移动的距离(m)，其移动速率为m／s，迁移率以m2／(V·s)表示。而在实际应用中以cm2／(V·s)表示，因此通过测量d、l、V、t，便可计算迁移率。二、影响颗粒电泳速度的因素1．测试样品(1)电荷在电场中，带电颗粒向各自相反方向的电极泳动。若同时带有正、负两种电荷,其移动方向取决于净电荷，其迁移率与净电荷的大小成正比。大部分生物大分子如蛋白质都带有阴离子和阳离子基因，是典型的两性电解质。带电的性质和多少取决于该物质的pKa、溶液的pH值及离子强度。(2)颗粒大小、形状和分子量大的球形分子，在固相或凝胶稳定的基质中，在非常稀的溶液中，其迁移率与球的半径成反比。而分子量小于5000的肽类或离子，其迁移率与颗粒半径的平方成反比，或与其分子量的2／3次方成反比。其迁移率与颗粒净电荷和分子大小的关系,同样大小的分子，因其形状不同，如纤维蛋白与球蛋白，在电泳时，与周围介质的磨擦力和静电力不同，迁移率也不同。2．电场强度电场强度是指每1厘米的电位降，故又称电位梯度，以V／cm表示。电场强度对泳动速度起决定性作用。在一定范围内，电场强度愈高，带电颗粒泳动愈快，根据不同电泳所需电场强度，可分为常压电泳和高压电泳。常压电泳一般在100～500V，高压电泳一般为500～10000V。纸电泳、醋酸纤维电泳、聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳只需200～500V,而固相pH值梯度等电聚焦电泳则需要3000～5000V高压。电压与支持介质的长度有关，而电流与支持介质的横截面(或宽度)成正比。大部分电泳用恒压控制电场强度。在做管状圆盘电泳时，一般用调节每管的电流(mA)控制电场强度，在电泳过程中，保持稳定的电场强度或稳定的电流，是电泳成功与否的重要条件。3．缓冲液(1)pH值溶液的pH值直接影响带电颗粒的解离程度，并决定其所带净电荷的性质和多少。氨基酸、蛋白质均为可解离的两性分子，pH值离等电点越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度愈快。当在某一pH值时，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零时，蛋白质在电场中不移动。此时溶液的pH值，即为该蛋白质的等电点。因此，在分离蛋白质混合物时，应选择合适的pH值，使各种蛋白质所带的电荷差异较大而彼此分开。在电泳过程中，为了使溶液的pH值保持恒定，必须选用缓冲溶液。(2)离子强度离子强度高，迁移率小，反之则大。但离子强度过低时，迁移率反而会因导电度的降低而减少，一般最适宜的离子强度为0.02～0.20。缓冲液离子强度的选择，取决于待测样品的组分。其缓冲作用应在整个电泳过程使pH值保持恒定。当增加离子强度时，使分离得到的蛋白区带更窄或斑点更为集中。4．溶液的温度和黏度因溶液的黏度与温度有关，故温度间接影响电泳迁移率。在0～5℃时，温度升高l℃，水的黏度下降约3％，而在室温时，温度的改变对黏度影响较小。因此迁移率随温度的升高而增加。当电流通过支持介质和缓冲液时，会放出大量的热量，而热量随电压和离子强度的增加而加大，当热量增至一定程度时，其产生的温度梯度在电泳槽中会导致分离区带失真，故在使用高压和高离子强度缓冲液电泳时，必须使用冷却装置。5．电内渗在电场作用下，液体对于固体支持介质的相对移动称电内渗(eletroendosmosis，EEO)。由于固体支持介质吸附水中的正或负离子，使溶液带电，在电场下，溶液就向一定的方向移动，产生电渗现象。如在纸电泳中，滤纸吸附羟基使表面带负电荷，而与纸接触的水溶液带正电荷，此时液体便向负极移动，并携带颗粒(包括中性颗粒)同时移动，故在电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的电泳速度与由于水溶液移动产生的电渗速度的矢量和。当电内渗向负极移动时，带正电的颗粒也向负极移动，则其表观移动速度将比电泳速度快，若颗粒原向正极移动，则表观速度将比电泳速度慢。为校正这一误差，可用中性物质如葡聚糖、糊精与样品同时做电泳，然后将中性物质的移动距离扣除后再测量泳动距离。电内渗因支持介质表面带电基团的多少而异，在琼脂糖凝胶中，能看到较明显的电内渗现象，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电内渗现象可以忽略不计。因此，在做大分子物质等电聚焦时，必须使用电内渗很小的琼脂糖，电内渗大的琼脂糖会使pH值梯度向阴极漂移，得不到正确的等电点。sjgma试剂手册在琼脂糖规格中均标出电内渗(EEO)值，应根据不同实验要求选用不同规格的琼脂糖。6．分子筛效应在不同浓度和交联度的凝胶中，其孔径大小不同，通过分子筛效应可将不同大小的颗粒进行分离，其分离机制是小分子通过凝胶微孔，而大分子颗粒难通过微孔而使迁移阻滞，从而将被分离的颗粒，按分子大小的顺序排列进行分离。

免疫共沉淀和亲和层析共分离：免疫共沉淀是证明蛋白质-蛋白质相互作用的最直接最经典和最有效的方法，如蛋白A能与B相互作用结合成异源二聚体，无论用抗A或抗B的抗体或与A或 B的亲和物偶联的agarose小珠都能把A和B沉淀下来。因此广泛用于蛋白质相互作用研究。常用的小珠：GST-Agarose（不需要抗体）ProteinA-Agarose(用时需加抗体)基本方法：1.表达蛋白质A2.蛋白质A与亲和小珠结合3.用结合有蛋白质A的亲和小珠调取细胞破碎液中蛋白质B4.离心、洗涤亲和小珠若干次5.处理亲和小珠使蛋白质A、B解吸附（可以直接用SDS-PAGE上样BUFFER煮）酵母双杂交系统基本原理，以酵母S.cerevisiae的转录因子GAL4系统为例GAL4有两个结构上互相分开，功能上相互独立的结构域。N 端1-147aa与DNA结合（DNA binding domain,BD）。C端768-881aa能激活转录（Activation Domain,AD)。BD＋AD—能激活GAL4效应基因的上游激活序列（UAS）。把N和C分开分别构建成两种表达质粒。如把Gal4的N端和诱饵蛋白（研究的目标蛋白A）融合表达，把细胞cDNA和C端融合表达，cDNA编码的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端联系在一起，就可以激活UAS下游的基因表达。半乳糖苷酶（Laz）基因克隆到URA3的下游。在x-Gal的存在下酵母菌落成蓝色(Fields)酵母GAL4基因缺失；GAL80基因缺失（GAL4的负调控因子）方法略假阳性多，因此还必须再用免疫共沉淀等直接证据证明发展：哺乳动物双杂交系统、二倍体双杂交系统、酵母单杂交系统、细菌双杂交系统、酵母三杂交系统FAR WESTERNWestern blot 是免疫印记，而Far western 是蛋白质铺盖技术，两者其实在本质上是相似的，只是免疫印记是直接用抗体去检测抗原，常用于蛋白质定性；而Far western则是用标记的蛋白（125I或荧光）去probe与之相互作用的蛋白，或再用抗这种蛋白的抗体显示这种蛋白的结合位置，用于研究蛋白质的相互作用。基本步骤：1.表达和提纯获得蛋白A，并作荧光或放射性标记，或制备抗A抗体2.细胞总蛋白SDS-PAGE(一起染色，另一块转膜)3.电转膜4.封闭5.加入蛋白A，如A带标记，洗膜后直接显影；如未标记，可加抗A抗体再加二抗或标记的蛋白A。优点：简单、经济缺点：SDS-PAGE影响蛋白质构象，可能影响相互作用表面等离子共振（SPR）法原理：SPR法是生物科学、物理学和计算科学结合的方法，在玻璃表面镀上一层金薄膜，再把目标蛋白通过氨基共价偶联在金膜表面制成传感芯片。当一束偏振光照射到传感芯片的金膜时会引起金属中的电子共振，而导致反射光会在一定角度内大大减弱，其中反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随着金膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，而折射率的改变又与结合在金膜表面的生物大分子的质量成正比，每结合1ng/mm2折射率的变化相当于1000RU（共振单位），如果通过的液相中有能与膜表面偶联的靶蛋白相互作用而结合的蛋白质或其它化学物，就使结合在金膜表面的生物大分子质量增加，检测的共振单位（RU）也增加。通过光检测单元检测反射光的变化，经数据处理系统处理后，获得实时传感图。特点： 灵敏度，所需样品少（20μl就可分析）2.可以同时确定互相作用动力学参数Ka、Kd值3.可以测蛋白质-蛋白质互相作用，也可测蛋白质与共它分子互相作用（小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂、噬菌体、病毒和细胞）可以回收结合的蛋白进一步研究和鉴定（如质谱分析）SPR分析的条件控制：样品制备：样品的PH、离子强度，对相互作用有显着影响，一般PH范围在6.8-7.8之间，低离子强度，样品中蛋白质浓度变化影响不大，样品体积20-50μl。温度：一般25℃+5℃，温度高于30℃对相互作用有影响进流速：全程流速恒定，进样速度不宜过快，保证接触时间，一般进样速度 5-10μl/分。

1：病理标本收集及保存：1）冰冻切片：取下适当的组织块放于液氮保存；2）石蜡切片：取下适当的组织块放于4%多聚甲醛保存；3）细胞爬片：细胞爬片4%多聚甲醛固定30min，换PBS浸没4℃保存。2：分子生物学标本收集及保存：1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存；2）石蜡标本：常温保存；3）全血标本：取适量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管；4）体液标本：高速离心取沉淀；5）细胞标本：细胞加TRizol裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。3：蛋白质实验标本收集及保存：1）新鲜组织：切割标本后放于液氮或者-80℃冰箱保存；2）全血标本：取适量全血加入EDTA或肝素抗凝采血管；3）细胞标本：细胞加细胞裂解液充分裂解后液氮或者-80℃冰箱保存。4：ELISA、放免、生化实验标本收集及保存：1）血清（血浆）样本：取全血加入促凝管（抗凝管），2500转离心20分钟左右，收集上清，液氮或者-80℃冰箱保存；2）尿液样本：样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液参照此实行；3）细胞样本：检测分泌性的成份时，样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；检测细胞内的成份时，用PBS稀释细胞悬液，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，2500转离心20分钟左右，收集上清同上；4）组织样本：切割标本后，称取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备用。5：代谢组学标本收集：1）尿液样本：样本2500转离心20分钟左右，液氮或者-80℃冰箱保存；胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液等参照此实行；2）组织样本切割标本后，称取重量，用液氮或者-80℃冰箱冷冻保存备用；

一、蛋白marker是什么？在WB实验中，蛋白marker的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。二、蛋白marker的分类总体来说，蛋白Marker可以分成未预染蛋白marker、预染marker二个级别。1. 未染色（pre mixed）蛋白分子量标准未预染蛋白marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白marker。未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，所以当看到特别浓的那几条可以作为标志带。不过小带通常都不那么容易看清楚。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。预混的Marker使用上不如预染Marker（pre-stained）好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才可以看到，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的。① 宽分子量蛋白标准如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区。不过条带越多，相应的上样量也会增加。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装，避免多次反复冻融。另外宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了。② 高分子量蛋白标准通常在检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准③ 低分子量蛋白标准在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低分子量蛋白标准，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量。2.预染蛋白分子量标准预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳；另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认；单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。三．Western专用的标记蛋白marker①生物素标记蛋白标准未染色的Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才能“拼”在最后的结果中，如果是预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪膜，最后在“拼上”。要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。比如生物素标记的蛋白标准。这种方法主要是配合化学发光法：在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗生物素的抗体或者偶联链亲霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时就可以同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。不同于普通蛋白分子量标准的便宜、预染蛋白分子量的方便，这一方法的优点是与Marker和目的蛋白对应性好，同时在同张片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素背景，那个抗生物素抗体有可能影响结果，而且反应体系太过复杂也会干扰实验结果。②特殊标记蛋白标准在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近些年由于下游蛋白操作的丰富化与复杂化，也出现带有“尾巴”的蛋白标准。比如His-Tag，如果每个Marker条带都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗体很容易将Marker条带显示在Western结果上。很方便，问题就是有可能有潜在的干扰，比如样品中正好有类似Histag的结构。不过这可以通过对照检测的。

免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。它采用固定在微珠支持物上的特定抗体，从复杂的混合物中，纯化单一抗原的实验。早期做科研的老师们，一般都会选用琼脂糖珠(也称琼脂糖树脂)作为免疫沉淀实验中的固相支持物的材料。随着实验技术的更迭，磁珠已经后来居上，在免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法中占据重要位置。那么，琼脂糖珠和磁珠各有什么优势？具体实验中又该如何选择呢？今天就带大家探究一下吧！琼脂糖珠琼脂糖珠，结构呈海绵状，直径 50-150 μm，通过与抗体结合，继而结合靶蛋白。它能够直接高效、快速结合抗体，而不需借助特殊的专业设备。此外，琼脂糖树脂呈多孔结构，这使得它们拥有更大的表面积可与蛋白质相互接触，具有更高的结合载量。在纯化大量蛋白的时候，琼脂糖偶联抗体是IP实验的完美选择。值得注意的是，在免疫沉淀实验中，抗体的量常常不足以满足琼脂糖珠的饱和荷载量，没有被抗体覆盖的琼脂糖珠的部分则可以自由地结合任何可粘附的物质，这种非特异性结合升高引起背景信号升高，这时，“高荷载量优势”会变成“高荷载量劣势”。对裂解样本进行预处理操作，是去除非特异性结合物最为简单有效的方法。不仅如此，多孔的结构会带来如下问题：1.抗体被困在孔内，难以洗去，因此需要大量的洗涤来降低背景。2.免疫沉淀的洗涤是在微量离心管中进行的，液体之间的交换通过移液枪来完成，很容易丢失样品。3.微球上的抗体与目标蛋白接触的慢，需要较长的孵育时间。4.较长的孵育时间及大量的洗涤导致目标蛋白的机械及生物（蛋白酶水解）损失。磁珠与琼脂糖珠不同，磁珠是固体，抗体的结合仅限于磁珠的表面。磁珠的直径只有1-4 μm，明显小于琼脂糖珠，磁珠没有多孔结构，但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多，使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合；同时还避免了多孔结构带来的弊端，结合磁力架快速分离沉淀和上清液，不但缩短了操作时间，也使操作更加自动化，但是相对成本也较高。为了能让大家更加直观的了解二者的使用性状差异，小艾特异让琼脂糖珠和磁珠进行了PK赛，下面向各位观众通报比赛结果：第一场：结合能力—琼脂糖珠胜！解说：由于琼脂糖珠直径较大且具有海绵状结构，因而比磁珠有更大的表面积和更大的结合能力。但是琼脂糖珠的可变多孔径会使抗体会落入孔内，导致结合受限，尤其是超大蛋白(一般是蛋白复合物)的结合，并且抗体可能会在洗涤步骤(离心)中流失。另外，琼脂糖珠的非特异性结合能力大于磁珠。第二场：背景低—磁珠胜！解说：琼脂糖珠的多孔结构，可以吸附更多蛋白，当然也包括杂蛋白，因此背景比较高，最好预处理一下再上样。磁珠表面光滑，背景低，预处理这步可跳过。第三场：抗体消耗—磁珠胜！解说：如果你的抗体比较贵，磁珠是个好选择！第四场：操作简单快速—磁珠胜！解说：由于琼脂糖珠免疫沉淀需要较长的孵育时间，预处理步骤和多次离心，所以其需要大量的手动操作，总时间为1-1.5小时。相反，磁珠免疫沉淀反应不需要离心，配合使用磁性分离架磁性分离，在30分钟内即可完成实验，因此可以在较短时间内轻松处理并获得较多样本的分析数据。第五场：自动化程度—磁珠胜！解说：磁珠操作简便，因此可以使用自动化免疫沉淀设备，不仅节省了工作量和时间，还可以应用于高通量。第六场：成本—琼脂糖珠胜！解说：免疫沉淀中设计微珠的成本主要取决于免疫沉淀方法和每个免疫沉淀反应所需要的微珠量。琼脂糖珠：琼脂糖珠必须通过离心浓缩在管底部，并在每次孵育和洗涤除去上清液，通常需要肉眼识别管底部的琼脂糖珠，因此，每个免疫沉淀实验至少需要使用 25-50 μL 的琼脂糖珠。磁珠：采用磁性分离，无需设定最小体积的的磁珠使用量，用量仅取决于目的蛋白和免疫沉淀抗体。当然，在使用琼脂糖珠的过程中，可以使用过滤离心柱代替普通的微量离心管，该离心柱包含一个过滤器，允许通过短暂的离心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流过，因此可以显着减少每个反应所需的琼脂糖珠使用量。总结：从PK赛的结果可以看出，琼脂糖珠和磁珠各有优劣。当样品体积 2 mL，建议使用琼脂糖珠。当抗体成本较低并且想要纯化大量目的蛋白用于多种下游分析时，琼脂糖珠是一个不错的选择。

反向PCR是一种多聚合酶链式反应(PCR)应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知RMA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的RMA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解RMA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆">克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。用T4连接酶在稀RMA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PCR大小适当的RMA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4 RMA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。常规 PCR 是扩增两引物之间的 DNA 片段,反向 PCR(reverse PCR)是用引物来扩增两引物以外的 DNA 片段。一般先用限制性内切酶酶解 DNA(目的基因中不存在该酶的酶切位点,且片段应短于2～3kb),然后用连接酶使带有黏性末端的靶片段自身环化,最后用一对反向引物进行 PCR,得到的线性 DNA 将含有两引物外侧的未知序列。该技术可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA 片段的序列。反向 PCR 已成功地用于仅知部分序列的全长 cDNA 克隆,Picter 中曾用此法扩增基因文库的插入 DNA。

一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。4、免疫荧光在封片时常使用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。2、每次试验均需设置以下三种对照：（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物；（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。2、两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。3、阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，用的是10%正常donkey血清。5、其余事项同免疫荧光单标操作。

ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特点。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。一、双抗体夹心法双抗体夹心法，其基本原理是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入含有抗原之待测样品，通过加入酶标记特异性抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。该方法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。二、竞争法竞争法一般分为直接竞争法和间接竞争法，这里我们以直接竞争法为例进行原理讲解。直接竞争法，其基本原理是：将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品（样本）和生物素标记的抗原物质进行竞争结合，经合适的温度和一定时间的孵育，洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素进行反应，TMB显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质，当然，这种方法也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。三、间接法测抗体间接法一般用来检测抗体。其基本原理是：将一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入无关蛋白载体封闭未结合位点后，加入待测样本，然后加入酶标二抗，经孵育和洗涤后，加底物显色。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。主要用于对病原体的检测而进行传染病的诊断。四、双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法，与双抗体夹心法类似，基本原理是将已知浓度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面，对未结合位点用无关蛋白载体进行封闭后，加入待检样本，然后加入生物素标记的抗原和HRP标记的链霉亲和素，经TMB显色和终止反应，酶标仪读数之后即可计算待测物浓度。双抗原夹心法与间接法都可以对抗体进行检测。五、捕获法测抗体由于我们检测样本中的IgM含量时，其中同时含有较高浓度的IgG类抗体，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法。其基本原理是：将抗IgM抗体包被于固相微孔板，用无关蛋白载体对未结合位点进行封闭后，加入待测样本，接着加入抗原物质，然后加入针对该抗原的经生物素标记的特异性抗体和HRP标记的链霉亲和素，经TMB底物显色和终止反应后即可计算浓度。

当样本细胞数少的时候，你应该如何进行样本处理？这个问题，曾经很多做实验的都碰到过，尤其是做小动物的，例如做小鼠的胰腺组织，往往只能分离出不多的细胞，处理中又很容易丢掉，导致最后上机获取到的细胞寥寥无几，给结果解读带来很大困难。因此，重要的是，如何尽量避免丢失，保障有足够的细胞进行实验呢。在Cyt-Geist中，汇总了以下建议，相信对遇到相同困境的FLOWER会有较大帮助：1、建议从野生型或其他相同细胞来源获取细胞掺入进去。如果感兴趣的细胞标记了荧光蛋白，那么可以使用没有荧光蛋白标记的野生型细胞来增加细胞数量，这样既可以区分出感兴趣的细胞，又使分析过程中的细胞损失降至最低。因为细胞丢失率是一定的，当细胞总量增加后，尽管你的目标细胞比例减少了，但是丢失的绝对数也相应减少。2、建议使用细胞系进行实验。在某些研究中，可以使用从感兴趣细胞建立的细胞系，这些细胞可以代替感兴趣的细胞来建立电压和设门等条件，这样可以大大减少样本的消耗，实现样本最大价值。3、与血液不同，来自实体器官的原代细胞在用于流式分析之前，必须经过数个涉及机械和酶解等步骤。由于这些解离步骤，细胞完整性可能受到损害。为了保证样品质量和细胞数量，需要关注解剖手法和解离方案的优化。除了优化解离程序外，还应优化整个实验中使用的温度条件。建议使用目标细胞优化这些条件，或者至少使用与目标细胞相似的细胞（即衍生细胞系）。优化条件和方案可以更好地解离细胞，并将解离时间最小化，从而保持细胞完整性。4、为了使细胞在准备步骤中保持“happy”和活性，建议使用无血清培养基，而不是常规使用的磷酸盐缓冲液（PBS）。应确保所使用的缓冲液不含酚红，否则可能干扰分析。另外，应考虑用于优化缓冲液，例如HEPES缓冲液在室温下的pH值优于磷酸盐缓冲液，这使其成为流式细胞术样品制备的理想选择。

在ELISA实验过程中时常会出现复测现象，即我们时常说的"花板"现象，这种现象影响检验结果的正确判读，对工作造成一定的不利影响，一旦出现“花板”，实验结果必须放弃，重新进行，不仅浪费物料和时间，而且还会出现样本量缺少、交叉污染、报告延迟等一系列问题。出现这现象的影响因素分析如下1、标本因素正确处理标本，防止大规模溶血、血浆层异物、使用一次性加样枪头，防止交叉污染。血清和血浆均可以用于检测，但血清的分离应在抽血后等血液完全凝固后再离心。2、试剂因素正确保存及使用有效试剂。使用过期试剂及底物接触金属容器、底物混合后放置时间较长均影响实验结果的准确性。选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好，批间差小的试剂。不同厂家的试剂不能混用，包括底物和洗涤液。检测前应将试剂放置室温平衡半小时，洗涤液应现用现配，同时观察浓缩洗涤液中有无结晶，若有结晶应放37℃水浴中融化后才可使用。3、技术人员操作因素严格按照相关实验SOP操作实验。加样时应尽可能的垂直加样，并加在包被孔的底部（注：勿应用力过度破坏底部包被物质），不可加在孔的上部及外部。4、温浴的因素使用水浴箱作为温浴设备时，应注意水的深浅对结果的影响，当水浴箱中水的的实测温度37℃时，则水面温度可能只有34℃，空气温度更低，甚至只有二十多度，所以当水浴箱中水位过低时则酶标微孔板没有浸入水中，则反应温度会达不到37℃，相应的就会影响酶促反应。为防止边缘效应，酶标板应尽量浸入水中，以保证受热的均匀。水浴时，酶标板应封好，以免水滴滴入包被孔中，或阳性标本的蒸发。严格掌握温浴时间，不可为了早点出结果擅自缩短温浴时间。5、洗板机的因素废液瓶装满后应及时清空，以防止废液回流对管道的污染，而使洗涤不彻底，造成“花板”。洗板结束后应用蒸馏水彻底清洗管道，以防止废液在管道中的残留。同时应根据仪器维护保养程序，定期对洗板机进行维护保养。6、酶标仪酶标仪应安置在避光条件下，比色前应提前15-30分钟开机预热，这样测定结果会更稳定。为防止显色的加深或减弱，显色时间完成后应立即滴加终止液（避免气泡产生），并在10分钟内完成比色。酶标板从水浴箱取出后应擦净孔底水滴，若有水滴或纸屑残留在孔底，会造成酶标仪读数错误，误判定为“花板”。

如何使用慢病毒感染细胞？使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类，因此首先要了解细胞的来源和背景。通常来讲首先要根据MOI和需要感染细胞量计算所需要的病毒量，然后将所需病毒液加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。慢病毒染后为什么细胞中出现大量黑点，并影响细胞生长？在排除细菌及真菌污染后，细胞中的黑点通常为细胞碎片，导致细胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，细胞破碎通常有两个原因：a. 慢病毒使用量过多，或细胞数量过少；b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖，故支原体污染被许多实验室所忽略。但支原体易在病毒感染细胞后爆发，故会出现大量细胞碎片。建议在使用病毒制品时，应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染，以节约时间。病毒感染目的细胞感染不上或效率低？和以下几个因素有关：1、病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新测滴度；2、目的细胞：最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如悬浮细胞，原代细胞等，或者动物实验适合用腺病毒或AAV；3、MOI值：一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的，同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样，如果感染细胞所用的病毒量不够的话，感染效率肯定不好；需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。4、感染时间：慢病毒一般在感染后24h换液，感染后换液太早会导致感染效率下降；感染后换液太晚，则对细胞的损伤太大，效率也不高。感染后48h开始观察荧光，由于慢病毒的表达时间较长，有的72h，120h才能看到荧光。5、其他：是否加入 polybrene 以及荧光显微镜的使用等因素有关要曝光很长时间才能观察到荧光？要曝光很长时间才能观察到的荧光，说明荧光比较弱，可能的原因有：1、显微镜汞灯使用时间长，这个可以通过对照排除，看是否有比较亮的对照，或者如果有其他比较亮的样品，证明不是汞灯的问题。2、PH值低，看培养基是否发黄导致绿色荧光猝灭。3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒荧光强度与对照相比弱一些，这个属于正常现象，增加曝光时间，看感染上的阳性细胞比例如何，看看目的和对照的荧光的差异，如果感染比例尚可，差异不是很大，用Puromycin筛选有大量细胞存活，则病毒也可以使用。

在我们买的食品中都会看到一个营养标签，有时会在标签中看到维生素B1的含量，接下来就让我们了解一下维生素检测前处理的步骤吧。 试剂配制20g/l的铁qin化钾溶液：称取1g铁qin化钾，先用少量的水溶解后再定容至50ml。100g/l的氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠，加水溶解后定容至100ml。碱性铁qin化钾：将上述的5ml铁qin化钾和100ml的氢氧化钠混合均匀后备用（现用现配）。0.1mol/l的盐酸溶液：准确移取8.5ml浓盐酸，加水稀释至1000ml。2.0mol/l乙酸钠溶液：称取27.1g乙酸钠，用水溶解后定容至100ml混合酶溶液：称取1.76g木瓜蛋白酶和1.27g淀粉酶，加水定容至50ml,涡旋混匀后冷藏密封保存，临用时现取。样品提取1.称取5g（精确至0.01g)固体试样或10g液体试样于带塞子的锥形瓶中，加60ml0.1mol/l的盐酸溶液，充分摇匀后塞上塞子，高压灭菌锅中121℃，30min.冷却至常温后摇匀。2.用2.0mol/l的乙酸钠溶液调节pH至4.0左右，准确移取2.0ml混合酶溶液，摇匀后放入培养箱37℃培养16h。3.将溶液用漏斗全部移至100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀后过滤。试液制备1.准确移取滤液2.0ml至10ml的离心管中，加入1.0ml的碱性铁qin化钾溶液，涡旋混匀后，加入2.0ml的正丁醇，涡旋1.5min后离心五分钟。2.吸取上层经0.45μm有机微孔滤膜过滤，取滤液2ml放入棕色进样瓶中待测。其他到这一步维生素B1的前处理就完成了，特别要注意以下几点：1.混合蛋白酶和碱性铁qin化钾要现用现配，曾经小编这里就出现过蛋白酶密封放冰箱三天就会变臭，可能是因为酶活性高，容易变质。2.一定不要忘记加1.0ml碱性铁qin化钾，否则不出峰。3.离心之前一定要涡旋1.5min,或者手动摇匀1.5min，使维生素B1充分提取出来。4.拔针头时注意安全，使用完后将针头盖好，保护他人安全。

安全事项1.进实验室之前应该穿实验服，戴手套和口罩，必要时应该把普通口罩换成防毒面具。2.实验室平常要保证通风良好。3.实验室要备有洗眼器和风淋区。4.操作高温仪器时需要佩戴防烫手套，自己办公室最好常备一个小药箱，放上烫烧膏，碘伏，棉签纱布等，以备不时之需。5.禁止在实验室驱逐打闹，饮食饮水等。6.实验室要配有温湿度计。7.做实验时女生不能散发，防止酒精灯点燃头发。操作事项1.配戴手套直接使用电子天平，使用之前要调平衡，计数时要关天平门，使用后应该清扫天平及桌面，天平清零，关上天平门，以便下次使用。变色硅胶变成粉色时要及时烘干，保证天平内环境的干燥。2.水浴锅使用前确认水位，防止干烧。3.离心机使用时应保证质量平衡，呈对角线使用，避免仪器损坏。4.取用带有刺激性气味或者强酸强碱的试剂时，佩戴耐腐蚀手套，在通风柜中进行。5.电磁炉和马弗炉使用完毕后要及时切断电源。6.使用仪器之前仔细阅读说明书和注意事项，切忌想当然。7.废水废液严禁直接倒入下水道。8.微生物平皿使用完后要及时放入灭菌锅灭菌，灭完菌后应立马洗刷出来，避免污染。9.大型仪器注意定期保养维护。10.使用完的玻璃仪器要及时清洗出来，以便别人使用。11.使用完毕后的试剂药品应及时放回原位置。12.做好易制du易zhi爆的使用台账记录，严格按照要求使用。 13.禁止佩戴使用过的手套触摸身体部位，门把手，手机等。做完实验应该尽快洗手。14.做实验之前再次阅读标准，确认实验步骤准确性（小编就有一次凭自己记忆称错称样量，之后步骤全白费了）。15.保存试剂的冰箱禁止放食物饮料。16.应该及时填写仪器使用记录，做完实验后完善原始记录。17.试剂和药品要贮存在避光、通风处，易zhi爆要严格要求规定存放，双人双锁。18.配制试剂时要在试剂瓶外面标注配制名称、浓度、时间。19.过期的试剂要定期清理。20.正确的灭酒精灯的方法是连盖两次，确认酒精灯熄灭后再离开。21.移液枪使用完后要将它调至最大量程。22.称量样品过量后要重新取器皿称量，严禁将已经倒出的药品再次放回药品瓶。23.避光实验要在暗处操作，关上窗帘不要开灯，防止样品分解。24.使用完仪器后要清理台面，关机，方便下次使用。25.实验有疑问要多和身边人讨论，确定后再进行。26.做完实验后要清理擦拭台面。记录1.实验中直接把数据填写在原始记录，不要随便写纸上或者记在。脑子里，实验做完后再誊写到原始记录里，这样影响实验的准确度。2.实验数据要实事求是，不可胡编乱造，弄虚作假。3.实验报告要经人审核后才能出具，私章要收好，或者看清报告再签名。4.如果实验数据不合格可以复测，严禁私自改动实验数据。5.实验室执行5S管理标准。6.下班后记得关闭计算机，关门关窗，断水断电。

实验中相信大家都经常要倒平板吧？初学者往往都倒不好，导致后续实验出现问题。这里总结几点小技巧供大家参考：培养基倾注温度1、培养基的倾注时适宜温度约45℃。培养基置手心感觉不烫，但是置手背感觉烫时，培养基温度大约就是45℃。培养基倾注时温度太高的话，凝固时间较长，另外皿盖上会有大量冷凝水，不利于后续实验。温度太低则容易出现倒板过程中瓶中培养基部分凝固的现象。2、有些培养基需要加入添加成分，这些添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。3、目前多数实验室培养基灭菌后会放置水浴或者烘箱中，需使用的时候拿出来直接倒板。但培养基静置时间不宜过长，静置时间一般不超过4小时。静置时间过长，培养基中琼脂可能会少量凝固，形成类似絮状析出。4、在实验过程中不可避免因特殊情况而导致未倒板培养基已凝固，凝固后培养基可重新加热溶解。一般来说沸水浴或者电磁炉加热，不能重新再灭一次菌。倾注量一般平板倾注量在18-20ml左右，如果培养时间超过48小时或者是培养温度高于40℃，为防止水分过量蒸发导致平板开类，倾注量一般是25ml左右。一些培养皿会有刻度，按照刻度倾注即可。平板气泡倒板过程中容易出现气泡，特别是像BS琼脂这类需要摇匀后倒板的培养基。气泡过多的话会影响结果观察，倒平板时尽量缓慢倒入，将气泡留在瓶子底部。平板中有少量气泡的话，可以把气泡摇到平板壁上，这样不会影响结果观察。

近年来随着仪器和试剂的不断发展，几乎所有的免疫检测应用都可以获得荧光读数。不过，尽管免疫荧光技术能够提供灵敏而准确的结果，并适合多重检测，但优化还是bi不可少的。操作方案要优化免疫荧光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再次洗涤以及测定读数。大多数研究人员的染色方案都是一成不变的，因此建议在使用珍贵的样本材料时，花点时间优化操作方案的每一步。就一抗孵育而言，必须考虑抗体的建议稀释度，以实现高的信背比。若抗体浓度过低，则荧光信号较弱，可能难以与背景区分开，但抗体浓度过高，则会导致较高的背景染色。千万不要低估各步骤之间彻底洗涤的重要性。利用生理溶液来洗涤，可去除未结合的荧光试剂，或那些只是粘在目标上而非特异性结合的荧光试剂，从而提高信背比。荧光试剂要放好尽管许多荧光基团具有相对的光稳定性，但在保存和染色过程中若未能避光，则可能导致荧光基团-抗体结合物降解，引起假阴性结果。荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。特别指出，串联的荧光基团对频繁操作引起的不稳定性特别敏感。尽管免疫荧光技术提供了准确的结果，但也存在一些缺点，包括自发荧光、荧光信号的淬灭，以及标本存储过程中的信号褪色。按照建议的实验方案来操作，研究人员可以避免一些技术上的缺陷。选择荧光要谨慎免疫荧光技术的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，如今流式细胞仪能检测每个细胞中20多个离散参数。在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的独特性质，如最大吸收波长和最大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素。人们通常要检测组织或细胞样本中的多个抗原，必须选择光谱不重叠的荧光基团。即使是最hao的检测系统，也无法克服仪器和试剂之间的不匹配。合适对照不可少任何实验数据的分析都依赖于相关的对照，免疫荧光染色也不例外。不加一抗，则能说明观察到的信号是否来源于二抗与组织或细胞样本的非特异性结合，此外，建议使用不表达目标的细胞或组织作为阴性对照。同时，为了确保所有组分都正常发挥作用，那些已知表达目标的阳性对照也少不了。在荧光Western blot或ELISA技术中，含有目标抗原的蛋白或肽段适合作为阳性对照。总之，免疫荧光染色是一种流行且强大的检测方法。通过精心选择荧光基团，并开发可靠的染色方案，你可以生成丰富的数据。

要想底气十足地秀出你的WB实验结果，单单内参对照就是一门学问。在对靶蛋白进行分析时，首先考虑是否等量上样，其次考虑信号是否属于检测的线性范围。那么，内参蛋白就尤为重要！通常，第一感觉内参蛋白就是 β-actin 或 GAPDH 等。实际上，可以选择的内参有很多，而选择内参有一定的标准。第一，实验条件不能改变内参蛋白上样量。第二，对照内参的分子量必须与靶蛋白不同。第三，也是最重要的一点，检测到的内参蛋白和靶蛋白的信号必须在一个线性范围内，否则你会发现你的条带无法进行定量。然而，实际操作中，很多同学没有意识到上述的第三个标准。他们认为，印迹上的内参蛋白数量与细胞数量成正比，但这可能是错误性的假设而已，特别是使用单个内参蛋白对多种 WB 实验进行标准化时。实际上，没有一种内参蛋白能同时满足以上3 点标准，又适用于你各种不同靶点的实验。通常内参蛋白远比靶蛋白丰富得多。在同一稀释度下，测定内参和靶蛋白时，内参蛋白的信号可能较为饱和，甚至会超过检测线性动态范围，这就导致不能报告出泳道之间的差异。当然 WB 的信号也与检测方法紧密相关。与胶片相比，使用电荷耦合器件 (CCD) 相机检测增强型化学发光 (ECL) 可产生出色的线性动态范围。如果数字信号饱和，则可以使用软件设置来显示红色像素。经证实，荧光扫描（使用与荧光染料而不是过氧化物酶偶联的二抗）可避免发光化学的固有限制，因而更好。所以在设置实验时，采用这些方法可能意味着更少的梯度稀释次数。但如果你的实验室无法使用最新最好的技术，你也可以使用传统ECL 和胶片获得较好的数据，但需要你花时间设置实验，解决等量上样和动态范围问题。既往还有文献推荐在做实验前，最好考虑使用 5 个内参蛋白，这有助于你发现至少一个（好的时候多个）在靶蛋白线性范围内的内参，但使用多个内参蛋白存在耗费时间、试剂的问题，特别是样品珍贵的情况下。所以相对可行的是测定每个样品泳道中的总蛋白上样量，无需探测多个内参蛋白。对每个泳道的所有蛋白条带或多个离散条带进行染色和扫描，同时还要确保染色剂不会干扰后续的免疫检测。对于许多研究生和博士后，可能会觉得进行 WB 实验是“常规程序”。但也不要忘了，解释实验的数据时，细节决定成败。仔细考虑样品制备、转移条件和一抗等问题，将帮助你避免出现失误。到了文章发表的时候，记得提供所有详细信息，以便其他人准确评估结果并重复做出实验。这才是负责地进行 WB 实验嘛！

首先明确一下，抗生素不是消炎药。抗生素是一种抗感染的药物，而消炎药具有消炎止痛的作用。在讲消炎药和抗生素之前，让我们先明确两个概念，炎症和感染，并看一下二者之间的关系。抗生素的作用机制感染是由细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。感染可以引起炎症反应，如流感可以引起全身的发热，头痛，这就是因为流感病毒感染在体内引起的炎症反应。确切的说，炎症不是一种疾病，而是一种现象，通常表现为红，肿，热，痛等。除了感染可以引起炎症之外，过敏、强酸腐蚀、外伤等也可以引起炎症反应。所以感染和炎症之间既有联系，又有区别，所以在用药上也存在很大差异。消炎药可以减缓炎症因子引起的机体的红肿热痛等现象，具有消炎止痛的作用。对于非感染引起的炎症具有较好的治疗效果，但对于感染性炎症，单纯的消炎药无法达到治疗目的，还需要抗感染药物的配合。由于感染又分为细菌感染，真菌感染，病毒感染等，针对不同的感染类型需要服用不同类型的药物。抗生素只是抗感染药物的一种，主要对抗生素敏感的细菌引发的炎症具有较好的效果，但对于病毒，真菌，过敏或外伤等引起的炎症却无能为力。所以得了流感，服用头孢是没有作用的。最正确的方法就是遵循医嘱，对症下药。讲到这里，可能已经清楚了消炎药与抗生素的区别，但对抗感染是否又有些小混乱？在科研中，如何区分哪些是抗细菌，抗真菌，抗病毒的化合物呢？这个不用担心，MCE 抗细菌化合物库和抗真菌化合物库，这两个化合物库中包含通过各种机制抑制细菌或真菌生长的抑制剂，如抑制细胞壁的合成；破坏细胞膜通透性，干扰蛋白合成及抑制核酸转录复制等。结合抗病毒化合物库及抗感染化合物库，为您在抗感染领域的研究中提供更多便利。

蛋白质是非常敏感的，即使已经提取浓缩，在储存时仍然会发生降解、聚合和失活。如下分析几种保存方法的优缺点和一些小技巧，在储存时应根据自己的蛋白和实验需求选择适合自己的方法，权衡利弊，以免造成实验的麻烦。下面跟随远慕生物一起了解下吧！1.储存在4°C溶液将浓缩蛋白质储存在单一溶液（如PBS），置于聚丙烯管或干净的玻璃容器中，放在4°C冰箱保存。优点：蛋白容易获得，可以快速进行实验，且同一管样品可重复取样，这样避免了因经常解冻而加速蛋白的降解。缺点：在重复取样时，温度升高且暴露于环境中，可能会导致微生物污染，蛋白质失活和氧化。要避免这种情况，可以把蛋白质分成小份储存，并加入蛋白酶抑制剂、抗菌剂和还原剂等。但也要根据自己蛋白的情况，如果你的蛋白是完整的膜蛋白或分泌蛋白,很可能分子内存在二硫键，为保证其完整性，应该存储在氧化环境中。另外，储存时间超过一个月的蛋白可以考虑扔掉。2.储存在-20°C，加入冷冻保护剂可以将蛋白保存在含有25-50% (w/v) 甘油或乙二醇溶液中。优点：在低温下，蛋白质对微生物污染，蛋白酶降解和氧化反应更有抵抗力，容易保证其活性。用甘油或乙二醇稀释使蛋白处于溶液中，可以方便取样。此外，这种方式储存的蛋白质可以保存长达一年，对于抗体轭合物是一个好的选择。缺点： 蛋白质在-20°溶液中仍有可能遭受水解、污染和氧化，也需加入抑制剂、还原剂等。而且将样品存放在50%冷冻保护剂中有时是不可取的，取决于你接下来要做的实验。3.冻存在-80°C或液氮中将蛋白质分装成一次使用的量，快速冷冻。优点：可以长期保存（多年)，不需要甘油、叠氮化钠等化学物质，避免蛋白质降解或微生物污染。缺点：冷冻蛋白质应一次性使用，为了避免反复冻融发生降解。此外,抗体轭合物(特别是碱性磷酸酶复合物)冷冻后可能会失活。4.冻干粉末将你的蛋白质脱水冻干成粉末，在冰箱中无限期存放。优点：蛋白质不会像在水溶液中发生会水解和其他形式的化学降解，冻干蛋白质的空间也比溶液要小，而且可以长期储存。缺点：冻干并不适用于所有蛋白质，与细胞膜相关的蛋白质容易被冻干破坏。而且，并非所有的蛋白质都冻干后都能保持稳定性，有的可能会变性，从而减少它们的有用性和再溶解的能力。此外，一些蛋白质可能需要与蔗糖、甘露醇或BSA等才能保持稳定。六个储存小技巧：1.无论是冷冻还是储存在溶液中，将蛋白进行分装，以避免冻融，降低污染的风险。2.低浓度蛋白能更好地与塑料或玻璃结合，将蛋白浓缩至1mg/ml以上，,或添加BSA等减少这种结合。3.添加乙二醇或甘油等保护剂，使蛋白稳定，防止结冰。。4.抑制微生物的生长，添加硫柳汞01%(w / v)或叠氮化钠0.05%(w / v)。5.添加EDTA 、PMSF等蛋白酶抑制剂来减少蛋白质降解。6.阻止半胱氨酸氧化，可以加入1-5mM还原剂，例如DTT。

多肽固相合成法是多肽合成有机化学的一个重大的提升。它的最大的优点是不必纯化中间物质，合成过程能够连续开展，从而为多肽合成的自动化奠定了基本。目前全自动多肽的合成，基本上全是固相合成。其主要过程以下：根据Fmoc化学合成，先将所需合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不可溶的高分子树脂相接，然后以这一氨基酸的氨基做为多肽合成的起始点，同其他的氨基酸早已活化的羧基功效产生肽键，持续重复这一过程，就可以获得多肽。依据多肽的氨基酸构成不一样，多肽后处理方法不一样，纯化方法也是有差别。1.做免疫用的多肽多长为合适?一般约10-15个氨基酸，自然长一些免疫效果非常的好一些，但是合成费用也会提升。MAP多肽则期待长短在15aa之上，实际效果不错。此外，10aa下列的多肽免疫实际效果非常差。2.免疫用多肽的纯度必须很高吗?一般而言，免疫用Peptide，70-85%就可以。3.大家合成的多肽溶解性不太好，多肽就有问题对不对?难以准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。假如多肽无法溶解就觉得多肽合成有问题这一观念并有误。4.多肽情况是怎样?如何保存存储?大家带来的多肽是粉状，一般为灰白，构成不一样，多肽粉末状的色调有差别，多肽一般长期性储存必须遮光储存，并应储存在-20度，短期内能够储存在4度。能够短期内得话是以室内温度运送。5.怎样溶解多肽溶解多肽是比较复杂的事儿，一般难以一下子明确合适的有机溶剂。一般是先取一点实验，在都没有明确合适的有机溶剂前千万别合部溶解。以下方式有利于您挑选合适的有机溶剂：(1)判断多肽的正电荷特殊，设置酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1；碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其他氨基酸的正电荷为0。测算出将电荷数。(2)假如净电荷数>0，多肽为碱性，自来水溶解：如果不溶解或溶解性并不大，加入醋酸(10%之上)；假如多肽还不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。(3)假如净电荷数(4)假如净电荷数=0，多肽为中性，一般必须用有机溶剂如乙腈，甲醇或异丙醇，DMSO等溶解。也有人建议必须尿素来溶解疏水性非常大的多肽。6.非HPLC纯化的多肽中有什么杂质?粗品和除盐等级的多肽中多肽和非多肽类杂质：如非总长多肽和多肽后处理的一些原材料如DTT、TFA等。7.HPLC纯化的多肽有什么杂质?历经HPLC纯化的多肽，仍会出现一些一些杂质存有，在其中的杂质主要是短肽和少量TFA。8.多长的多肽为合适?多肽合成必须考虑到多肽的长短，正电荷，亲疏有别水溶性等要素。长短越长，合成粗品的纯度和产出率都随之减少，纯化的困难和没法合成的概率便会大些。自然多肽功能分区的编码序列是难以更改的，可是为了更好地多肽的顺利合成，有时候必须在作用取的上中下游提升一些辅助氨基酸，以改进多肽的溶解性和亲疏有别水溶性。假如多肽过短，合成也很有可能有问题，关键情况是合成的多肽后面处理方式中有一定的难度系数，5肽下列的多肽，一般要有亲水性的氨基酸，不然后处理难度系数增加。15个氨基酸残基下列的多肽一般都能够取得认可的产出率和得率。9.怎样从多肽编码序列中判断多肽的溶解性?(1)多肽中假如带有高比率的疏水性较强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽难以溶解与水溶性水溶液中或压根不太可能溶解。这种氨基酸不论是纯化或合成，都是有很有可能有问题。(2)一般状况下疏水性氨基酸的占比10.为何带有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?带有Cys,Met，或Trp的多肽无法合成，与此同时难以获得高纯的商品。关键是因为这种官能团不稳定，易空气氧化。这种多肽的应用和存储都必须需注意，防止不断打开外盖。11.为何有一些多肽的合成产出率或纯度会非常低?多肽合成与引子合成有非常大的差别，不可以合成的引子非常少，可是不可以合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这种氨基酸邻或重复时，多肽链在合成过程中无法完全舒展溶解，合成效率降低。下列多种情况，合成效率和物质的纯度都非常低，如：重复Pro,Ser-Ser，重复Asp，4个连续Gly等。12.多肽是怎样纯化的?多肽纯化一般应用正相反柱(如C8，C18等)，214nm。缓存管理体系一般为含TFA的有机溶剂，pH2.0。BufferA为含0.1%TFAinddH2O，BufferB为1%TFA/ACN/pH2.0。纯化前用BufferA溶解；假如溶解不太好，用BufferB溶解后，然后用BufferA稀释；对疏水性强的多肽，有时候还必须加入少量的FormicAcid或醋酸。HPLC剖析多肽粗物质，假如多肽不长(15aa下列)，一般会出现主峰，主峰一般为总长物质；针对20aa之上的长肽，要是没有主峰，HPLC需配搭Mass来判断相对分子质量，从而明确哪个峰是所需合成的多肽。

1、在开展一个蛋白纯化以前，应当对其蛋白有一定的科学研究，包含其性质，敏感性，比如该蛋白的溶解度，对高盐或pH比较敏感，是不是非常容易空气氧化等；2、需要考虑蛋白的主要用途，来决定制取蛋白的数量级规模，这就需要充分考虑层析柱的规格，获得的蛋白浓度值怎样，是不是需要维持其活力及其防止多余的污染物；3、蛋白的检验方式 ，针对带有不一样成分的蛋白水溶液，其检验方式 一般不一样，融合其敏感度，正确度，精确性等综合性考虑在不一样纯化流程中采用不一样的检验方式 ；4、蛋白缓冲液添加剂，出自于提升 蛋白可靠性，避免微生物生长发育，减少冰度或维持蛋白活力等，一般能够 加上各种各样表面活性剂，金属材料抗氧化剂，胰蛋白酶缓聚剂，添加剂，氧化剂各种各样缓存文件成份等；5、蛋白的存储标准，确保活力的前提条件下，其适宜的温度，是不是能够 冷冻，不断冻融循环，存储器皿等；纯化前需要对序列信息内容开展科学研究，能够 根据软件分析间接性获得一些蛋白的基本情况特性。在表述全过程中，采用细菌，细菌，或是动物细胞系统软件更强，表述后是不是确保其恰当的汉语翻译装饰，复制时挑选哪种标识更易过表达和纯化全是需要考虑的难题。表述后提取液采用如何的全过程开展体细胞粉碎，粉碎全过程中是不是会造成蛋白转性，构造发生改变，是不是会造成溶解，可靠性产生变化等。纯化全过程中采用哪种纯化方法，如蛋白质变性，有机溶液沉积，或是离心式，电泳原理，层析柱等方式 的挑选，根据粗获取，到植萃，期内的纯化次序直到最终的规模性大批量化得到。生物信息学在蛋白质纯化设计方案中的运用一般能够 获得下列信息内容：1、多肽链的分子质量。2、等电点PI，能够 开展离子交换法层析或是等电点沉积方式 开展纯化，酸碱性蛋白选用阳离子互换环氧树脂，偏碱蛋白选用正离子互换环氧树脂，3、克分子消光系数，谷氨酸，色氨酸，二硫键等在280nm光波长上有消化吸收值，根据克分子消光系数能够 测算蛋白浓度值。4、胱胺酸成分，决定是不是在纯化全过程中加上DTT等氧化剂。5、二级结构，能够 分辨趋向于产生α螺旋式和β拐角等二级结构。6、可靠性，能够 预测分析蛋白在身体的药物半衰期和多变性。7、亲水性区和跨膜区，能够 用于寻找潜在性的跨膜地区，而且对作用不明的蛋白，能够 预测分析其是不是为膜蛋白。8、序列相似度暗示着开放阅读框和很有可能同样的辅因子亲和性。能够 查找蛋白数据库查询以明确其是不是与别的某一已经知道蛋白具备很高的相似度。9、潜在性装饰结构域。能够 分辨是不是有糖基化结构域，生物素化结构域，金属材料融合结构域。10、大肠埃希菌中过表达蛋白的可溶。一个蛋白在大肠埃希菌过表达，能够 根据序列预测分析是可溶解的或是不能溶的包涵体。可是根据蛋白序列依然没法获得大量精确的信息内容，比如蛋白的三级构造，样子，表层特性，多亚基特点，同宗多聚体或异源多聚体，地基沉降特性等。因而根据蛋白序列能够 分析判断一些纯化对策，但大量情况下蛋白纯化或是经验性的试验工作中为主导。

蛋白质的结构和功能需要在合适的pH值环境中才能维持，因此在蛋白的制备及纯化过程中，生物缓冲液的选择非常重要，只有合适的缓冲液才能保证蛋白的活性和结构稳定。蛋白纯化过程缓冲液作用用于蛋白纯化的缓冲剂有很多种，在维持体系的pH同时，要保证蛋白在纯化过程中不能失活，或者是尽量减少蛋白失活的量，在蛋白纯化的每一个步骤中都要保持蛋白的可溶性和活性。蛋白纯化缓冲液要求蛋白纯化过程中的缓冲液既要防止蛋白降解，也要防止蛋白聚合，其对实验结果影响显着。在选择和试剂缓冲液时应考虑以下几个因素：pH值、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂。其中每一个因素都要根据所纯化的目标蛋白进行优化，并以目标蛋白的活性作为优化的评估标准。了解蛋白稳定性条件蛋白的种类很多，不同的蛋白适应的pH值有差异，需根据其最适pH值来选择缓冲液。很多时候采用的是pH是7.4，这是模仿的生物条件，大多数蛋白在这个pH值下是稳定的。不过也有一些是例外的，这就需要调整pH值，以保持蛋白是可溶的且不会降解。蛋白纯化常用的缓冲剂蛋白纯化过程中常用的缓冲液有Tris、Tricine、Bis-Tris、MOPS等，其中普遍的是用Tris，它的缓冲范围接近生理pH值，且有着较低的离子强度，是蛋白质的良好溶剂，能保证蛋白的稳定性。需注意的是配制缓冲液时，尽量避开目标蛋白的等电点pl。因为蛋白在其等电点的pH溶液中表面没有静电荷，带百分子间排斥力减小，容易聚集，溶解度降低。现在需纯化的蛋白的适应pH值、等电点、以及缓冲液的缓冲范围都是可以查到的，直接按对应要求匹配即可

一、PH值的影响每种酶仅在特定的pH范围内才表现出较高的活力，该pH值即是酶作用的合适pH值，酶在合适pH值表现就会很稳定。若酶反应pH值过高或过低，酶都会受到不可逆的破坏，稳定性、活力下降，甚至失活。而且不同酶的合适pH范围不同，偏酸性、中性、偏碱性的都有。二、温度的影响在一定条件下，每种酶都有一个合适作用的温度，在此温度下酶活力zui高，作用效果zui好，酶也较稳定，酶催化反应的速度增加和酶活力的热变性损失达到平衡，这个温度便是酶作用的合适温度。每种酶都有一个活性稳定的温度，在此温度下在一定的时间、pH和酶浓度下，酶较稳定，不发生或极少发生活力下降，这一温度为酶的稳定温度。超过稳定温度进行作用，酶会急剧失活。温度对酶作用的影响还与其受热的时间有关，反应时间延长，酶的zui适温度会降低。三、酶浓度和底物浓度的影响底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素，在一定的温度、pH及酶浓度的条件下。底物浓度很低时，酶的催化反应速度随底物浓度的增加而迅速加快，两者成正比。随着底物浓度的增加，反应速度减缓，不再按正比例升高。有时底物浓度很高，还会因底物抑制作用造成酶反应速度下降。当底物浓度大大超过酶浓度，酶催化反应速度一般与酶浓度成正比。此外，如果酶浓度太低，酶有时会失效，使反应无法进行。四、抑制剂的影响许多物质可以减弱、抑制，甚至破坏酶的作用，这些物质称为酶的抑制剂。如重金属离子（ Fe3+ 、 Cu2+ 、 Hg+ 、 Pb+ 等）、一氧化碳、硫化氢、有机阳离子、乙二胺和四乙酸等。实际生产中，要了解和避免抑制剂对酶催化作用的影响。五、激活剂的影响许多物质具有保护和增加酶活性的作用，或者促使无活性的酶蛋白转变成有活性的酶，这些物质统称为酶激活剂。激活剂可分为三类：第一类是无机离子，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+ 、Zn2+等阳离子，以及Cl-、NO3-、PO43-、SO42-等阴离子。第二类是分子较小的有机物，主要是维生素B族及其衍生物。第三类是具有蛋白质性质的高分子物质。激活剂对酶催化反应速度的影响与底物浓度相似，但在实际生产中应用很少。六、保存环境的影响酶制剂在低温环境下处于休眠状态，要使酶长期保存而不失去活性，在10℃保存酶活损失5-10%/6个月，常温保存酶活损失10-15%/6个月。所以关键在于环境干燥和低温。热和光照都易使酶失去活性，因此，酶制剂应密闭储存在低温避光处。另外，酶制剂水分含量越高，越易失活，故一般粉状酶制剂易于保存和运输。此外，有些金属离子也能引起酶失去活性或抑制酶的活力，应避免选择金属离子的容器来保存酶制剂。

我们在做免疫荧光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡检测（TUNEL）时，免不了要制备细胞爬片，爬片质量完全决定了最后拍照的质量以及实验数据的精准性。今天，小编就教大家如何制备好的细胞爬片。爬片的准备1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用细胞爬片（价格比较昂贵）但是细胞贴壁牢固，拍出照片效果好；2.可根据自己的需要，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；细胞爬片（以常用24孔板为例）1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作，玻片是无菌处理的，可以酒精灯外火焰附近做。3.根据自己的需要，选择合适的细胞密度（细胞太密影响拍照效果），将计数分好的细胞混匀后铺到孔中，种入24孔板一个孔内即可。4.待细胞贴壁后，可去上清加处理组培养基。5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等不同时间点实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。爬片细胞的固定处理以下为常用的固定液：1.冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。将纯丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10min。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。2.多聚甲醛(常用4%)：避光保存，可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 室温固定15-30min后，将表面液体吹干， -20℃保存3.95％乙醇，可用于免疫组化。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，孵育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。室温固定15min后，将表面液体吹干，入-20℃保存4.甲醛优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。小编将以多聚甲醛为例，讲讲24孔板内，细胞爬片固定步骤：1.准备多聚甲醛（PFA）： 4℃冰箱保存。2.将细胞从37℃培养箱取出，用预温的PBS洗3遍，每次加入1ml PBS，轻轻晃动，避免将细胞冲掉。3.注意爬片的细胞面向上，每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可，室温固定30-40min，避光。4.固定后，用PBS洗三次。5.0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min，覆盖细胞即可。6.PBS洗三次。如果是做免疫荧光7.后续用3%的BSA，用PBS配置，封闭1h。8.封闭后，用PBS洗三遍，按比例加入一抗，4℃过夜，若转入荧光标签的质粒，要避光。9.过夜后，用预温的PBS洗细胞，动作轻缓，可多洗一会儿，可以用慢摇床摇。10.加入用3%BSA稀释的二抗，室温孵育1h，避光。11.孵育结束后，避光用PBS洗3次，动作轻缓，可以多洗一会儿。12.1ug/mL DAPI ，室温避光，染细胞核DNA 20min。13.PBS洗三次。细胞爬片封片1.将载玻片洗好在干净无尘纸上晾干 。2.将PBS中的细胞取出，注意细胞面朝下，载玻片上滴入亮甲油，或者防防猝灭封片剂，盖在载玻片上（市面上可以买到封片防猝灭剂）。细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后做固定。根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡TUNEL染色时就避免洗，凋亡细胞在洗的过程中可能会脱落。保存细胞爬片时，一般用培养皿或避光湿盒，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照没有问题的。制备好的细胞爬片是不是很简单呢？

哺乳动物表达系统克服了原核表达系统翻译后修饰蛋白表达的问题。表达的蛋白具备折叠和修饰的功能，高度人源化，可以用于结构、功能分析。利用哺乳动物细胞表达蛋白通常有两种方式：瞬时表达与稳定转染（构建稳定细胞系）。利用细胞稳定转染将外源基因转染至细胞染色体上，能够长期稳定地生产目的蛋白。但是实验成本高、周期长、操作难度大。瞬时蛋白表达是指外源基因存在于游离的载体上，并没有转染到细胞的染色体。构建好质粒后，经过细胞复苏、转染、细胞培养、蛋白纯化等步骤即可得到目的蛋白。操作简单，实验成本低，周期短，最适合应用于快速、小规模制备一定量的重组蛋白和重组抗体。快来看看如何提高瞬时蛋白表达吧！策略一 ：优化编码序列根据特定的下游应用设计最佳的编码序列并选择最合适的表达载体。在开始蛋白表达之前，使用密码子优化算法 (如OptimumGene?或GenSmart Codon Optimization) 以及表达载体选择指南 (如金斯瑞的GenSmart? Design工具) 可节省时间、精力和费用。你知道吗？金斯瑞可提供从基因合成（免费的密码子优化）到蛋白表达、纯化等一体化服务！策略二：提高蛋白溶解度较低的蛋白质溶解度是造成重组蛋白表达产量低的一个关键因素。我们建议首先调整一些常用的表达条件参数来提高蛋白质的溶解度。温度对于HEK293和其它哺乳动物细胞系，建议在37°C、5% CO2孵箱中培养细胞。有些研究表明，在转染后24小时将温度从37°C降至33°C培养，可提高HEK293细胞的蛋白表达。尽管不同供应商提供的基础培养基十分类似，但它们之间的微小差异可能会影响特定表达细胞系的生长。一定要优化外部成分的浓度、pH值、类型甚至是批次或批号，如添加到培养基中的血清。培养基培养基添加剂在某些情况下，我们建议向培养基中添加特定的试剂来提升蛋白表达。例如添加组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，使染色质解聚并增加整合基因的转录活性。或者，向培养基中加入特定的生长因子有助于提高蛋白产量。策略三：使用融合伴侣蛋白标签是插入到重组蛋白上的短肽序列，可以用于提高蛋白表达。通常会在蛋白表达结束时采用酶切或化学试剂去除。表1列举了常用的蛋白标签类型及其优缺点。表1：常用标签列表针对特定表达系统选择合适的标签取决于多种因素。如果目标是获得极高的产量，则需要使用助溶标签，比如GST有很强的翻译起始信号，能促进高水平的表达。但是，如果需要较低的表达水平，建议使用更严格的表位标签，如His标签。策略四：优化纯化方法根据下游应用和纯度要求设计不同的纯化方法。如果蛋白表达量高，那么使用一步式亲和纯化方法就能获得足够量和纯度的蛋白，满足各种下游应用。如果需要进一步纯化，亲和纯化后通常可以进行分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC)。如需更进一步纯化，则可使用离子交换色谱 (Ion Exchange, IEX) 。

爬片又名细胞爬片，是指让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，病冻切片，细胞涂片，原位杂交等。细胞爬片特点1.玻片表面经过TC处理，双面均可使用.2.γ射线灭菌,保证无菌.3.使用便捷,只需打开包装,将爬片放入孔板内,将细胞悬液滴到爬片上即可培养.4.爬片厚度为0.17mm,直径为8mm/14mm/20mm/25mm.分别适用于48孔细胞培养板/24孔细胞培养板/12孔细胞培养板/6孔细胞培养板5.超强吸附：该玻片表面具有yong久的阳离子电荷,可以通过静电作用吸附冰冻切片组织或细胞,使之粘附在玻片上,进而在玻璃和切片组织之间形成共价键.因此，无需粘黏剂或者蛋白包被，该玻片也能牢固的粘附切片或细胞。操作注意事项使用细胞爬片时(比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面积往往会比爬片面积多出一部分,加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底,有时细胞生长边集现象,就是靠近壁边缘密度要高些,这样处于中央玻片上爬的细胞数量就可能相对较少。比较好的做法是将玻片放入孔板的孔内后,加细胞悬液时只滴到玻片上,一直滴到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘(因为液体表面张力作用可以很容易做到这一点。),放在培养箱里,等细胞贴壁后,取出,再滴加培养基布满整个孔底,继续培养,这样玻片上的细胞生长的密度就会很集中.细胞爬片怎么保存细胞爬片有三层包装,在超净台无菌的状态下打开包装.未用完的爬片按原先包装方式再包装起来即可.友情提示该爬片表面带有正电荷,请勿用手触摸,以免使用效果不佳.玻片经过γ射线灭菌后,透明玻片颜色会略变为淡茶色,属正常现象.

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。一、基本结构流式细胞仪由三部分构成1.液流系统，包括流动室和液流驱动系统;2.光学系统，包括激发光源和光束收集系统;3.电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的I作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。二、流式细胞术的基本操作与技巧1）细胞的制备、培养2）封闭3）荧光素偶联抗体标记4）光电倍增管电压的设定5）对照的设置6）补偿调节以体外培养的PBMC细胞为例：1、细胞培养在96孔板中，直接收集细胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C离心5min，弃上清；2、然后用1ml FACS buffer重悬沉淀，350g，4°C离心5min，弃上清；3、封闭：标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor, Fc受体），如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等， FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。封闭方法1： 取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。原则是，如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。封闭方法2： 适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4'C静置 15min。CD16是一种FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力较强；CD32也是一种 FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力中等。而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。4、标记相应的荧光素偶联抗体，这里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min；5、加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，350g，4°C离心5min，弃上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，尽快上机分析。6、电压的设定：上机分析时，确认机器没有问题后，首先就是调节每个通道的光电倍增管的电压，目的是为了区分细胞群，假如我们想研究人的淋巴细胞群，我们都知道人的PBMC含有淋巴细胞、单核细胞还有中性粒细胞等，那我们怎么把它们分开呢？这时候就要用到我们前面提过的FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，原则就是使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后就开始调节APC-cy7、FITC的电压（我们可以在铺细胞的时候多铺一个孔，染色时将CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC电压的调节），原则就是使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。三、注意事项（1）在细胞制备、培养阶段，如果该培养细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后收集待测样品细胞，离心、洗涤、封闭后标记荧光素偶联抗体即可。（2）如果是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，制成单细胞悬液，只需直接将脏器经钢网研磨即可。（3）如果是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。（4）调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。（5）关于样本的封闭，并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品，一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的，如标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠，人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合，但是，也有可能因为种属关系较近，或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生，但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以，条件允许的话，实验者最好养成封闭样品的习惯。

无血清培养基是在合成培养基的基础上发展起来的，与传统的培养基相比，既能满足细胞在体外长时间培养的要求，又能避免动物血清所带来的不利因素。无血清培养基的发展历程分为无血清培养基（Serum-Free Medium，SFM）、无动物源培养基（Animal Component Free Medium，ACFM）、无蛋白培养基（Protein-Free Medium，PFM）及化学成分限定培养基（Chemically Defined Medium，CDM）等四类。在使用无血清培养基时，有些细胞需要逐渐适应，即先将原来的培养基与无血清培养基混合培养，渐渐地再转为完全的无血清培养基培养。有些贴壁生长的细胞，复苏时也可用少量的血清先培养，因为血清可助细胞贴壁，然后再换成无血清培养基。组成成分无血清培养基由营养较完全的基础培养基和补充因子组成。基础培养基在不同细胞培养时，根据细胞需求对成分已知的基础培养基组分进行适当调整即可使细胞更好地生长并提高目的产物的表达量。大多数人工合成的培养基如DMEM、DMEM/F12、1640。补充因子补充因子是代替血清的各种因子的总称。多数无血清培养液必须补加3-8种因子。胰岛素、亚硒suan钠和转铁蛋白是必须补充因子，其他多数为辅助作用的因子。按其功能不同，补充因子可分为五类：激素和生长因子很多细胞用无血清培养时需要加入激素，如胰岛素、生长激素、胰高糖素等。胰岛素是重要的细胞存活因子，与细胞上的胰岛素受体结合后可促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡。此外，雌二醇、孕酮、氢化可的松等也是无血清培养基中常添加的补充因子。结合蛋白常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。转铁蛋白与细胞上的转铁蛋白受体结合是细胞获取铁元素的主要来源。白蛋白与脂类、激素、维生素、金属离子和生长因子结合后可调节上述物质在无血清培养基中活性的作用，此外，由于牛血清白蛋白一般添加量比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。贴壁因子许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤粘连蛋白、胶原蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤粘连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞、CHO细胞等。酶抑制剂培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。其他补充因子。一些细胞培养使用的无血清培养基还需要补充微量元素、维生素、脂类等低分子量物质。优点1）避免血清不同批次间的质量差异，提高细胞培养实验结果的一致性。2）避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。3）避免血清组分对实验研究的影响。4）有利于体外培养细胞的分化。5）可提高目的蛋白的表达量并使产品易于分离纯化。6）组分稳定，可大量生产。7）不含有丝分裂原抑制剂，可以促进细胞增殖。缺点1）细胞易受某些机械和化学因素的影响，培养基应用不如传统的合成培养基方便。2）成本高。3）针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。4）不同细胞对培养及营养成分的需求不同。5）虽然不添加动物血清，但为了细胞的生长，培养基中依然包含大量动植物来源蛋白，添加物质的化学成分也不够明确。生产生物制品目前，生产生物活性蛋白、疫苗、单克隆抗体和基因治疗药物的表达载体等生物制品时一般都采用可高密度生长的动物工程细胞。无血清培养技术的运用，给动物工程细胞提供了更优的条件，进而表达更多的目的产物，并有利于后续目的产物的分离和纯化。基础研究领域虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合。如，在利用DC肿瘤疫苗治疗时，所需要的树突状细胞和用于抗原致敏的肿瘤细胞，往往在胎牛血清（Fetal Calf Serum，FCS）中进行培养，这使得很难分辨哪些免疫应答是由血清引起而非真正的先天免疫系统的作用，需要使用成分明确的无血清培养基排除动物血清的干扰。

稳定转染，即进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。这是相对瞬时转染而言的。瞬时转染的表达时间短暂，外源基因导入整合基因组的几率非常低，绝大部分以游离形式存在，不能随细胞分裂而一同复制，导致最后拷贝数被稀释，无法达到持续表达外源基因的目的。一般用转染试剂进行质粒转染，多为瞬时转染。一般如下情况需要构建稳定株：1) 长期在目的细胞中研究基因功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究；2)部分蛋白半衰期极长，瞬时RNA只能干扰表达，无法去除已经表达的目的蛋白，通过构建稳定株可以实现更好的基因干扰效果；3)瞬转往往会引入极高拷贝数的表达，导致因为人为因素造成实验结果的不精确，构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究；4)需要用诱导表达系统的，主要是一些致死基因或者是需要时空表达的；5)需要用细胞做动物实验的，比如裸鼠成瘤等，往往需要构建成稳转株。构建稳定株的方法：其实用脂质体转染、磷酸钙转染法等理论上是可以构建稳定株的，但这些方法整合入基因组的效率极低，很难成功。而慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组，效率很高，是建立稳定株的最优方式。构建稳定株的注意点：稳定株构建是个长期过程，从质粒构建到慢病毒包装，再到细胞感染及后期的筛选，每一步都至关重要，所以建立稳转株花个半年时间，也是常有的事，而且要承担病毒包装不成功，细胞感染效率低等风险。

基因表达载体是广大科研人员普遍需要的研究工具，而病毒载体凭借其优良效能则越来越成为最shou欢迎、也最为普遍的基因表达载体。然而病毒载体也分为好几类，不同实验类型、不同研究目的、不同“受体”性质需要我们准确评估与选择。因此，详细了解不同病毒载体的相关知识是我们科研人员必须掌握的。本文详细介绍了常见病毒载体的原理、特点和适用范围。一、慢病毒载体慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒的一种，有由于其感染潜伏期较长，临床症状发展缓慢，被称为慢病毒。而慢病毒载体则是在慢病毒的基础上改变重组其构成原件，进而在去除其生物危害性的同时，利用其高感染等性能表达目的基因。人类免疫缺陷病毒（HIV）是常见的慢病毒载体改造原型。如下以HIV中最为常见的HIV-1型：HIV-1为双链RNA病毒，主要组分包含三种重要病毒核心基因：gag（编码结构蛋白或称为核心蛋白），pop（编码复制相关酶类），env（编码包膜糖蛋白）；调节基因：tat（转录控制）和rev（表达调节）；四个辅助基因：vif、vpr、vpu、nef（作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染）；两端为长末端重复序列LTR (内含复制所需的顺式作用元件)。第一代慢病毒载体为双质粒系统，基本保留了HIV的所有组件，产毒滴度低，复制缺陷，且存在产生复制能力的活性HIV病毒的可能；第二代慢病毒载体为三质粒系统，分为包装质粒、包膜质粒和载体质粒，其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓宽了病毒的感染宿主细胞范围，虽然三质粒降低了病毒重组的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附属基因，产生活性HIV依然存在可能；第三代慢病毒载体则去除了HIV病毒所有辅助序列，只保留核心的3个基因（gag、pol、rev），病毒RNA不能转录，故意外重组的可能性很低；第四代慢病毒载体为四质粒系统，即将病毒核心基因分散在多个质粒中(pGag/Pol、pRev、pVSV-G和载体质粒)，同时去除tat，故病毒重组、产生活性病毒的可能进一步降低，同时四质粒系统中的载体质粒中可以包含可诱导基因，使得该基因表达系统可以条件性调控。慢病毒载体感染能力强、且宿主广泛（分裂和非分裂细胞）；能够整合进宿主DNA且筛选后稳定遗传；表达潜伏期短，一般细胞24h-48h、体内96小时可表达；慢病毒载体可以插入组织特异性启动子或增强子；慢病毒携带基因的长度大致无5kb以内。由于慢病毒依然是HIV来源，自然宿主是人，依然存在潜在的生物毒性，故操作时避免直接接触人体。慢病毒载体适合常见类型的体外研究（细胞），包括过表达、敲除、敲低都基因干预操作，但慢病毒载体不适合于体内研究，因为其滴度不能够满足体内用量且免疫原性较强。二、腺病毒载体腺病毒（Adenovirus）是一种线性无包膜的双链DNA病毒，腺病毒的衣壳结构可以分为五邻体和六邻体两部分，腺病毒的基因组主要包括病毒DNA复制前期的Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4（编码病毒调节蛋白）和DNA复制后期的Ll～L5（编码病毒结构蛋白），以及两端的反向重复序列，ITRs（包装所必需的顺式作用元件）。在天然腺病毒（主要是人5型腺病毒）的基础上改造而得的腺病毒载体，其基因携带量增加，感染效率增加，且生物毒性降低。第一代腺病毒载体是删除Ela、Elb基因的复制缺陷病毒，其复制必须在表达E1蛋白的细胞中，病毒滴度高且稳定，不整合宿主基因组，但包装量少（约为4.5kb），免疫原性强；第二代腺病毒载体进一步删减病毒原有基因，在减少免疫原性和细胞毒性的同时，进一步提高载体容量，可以达到14kb，但是病毒滴度较低；第三代腺病毒载体则只保留了ITRs和包装信号序列，因此其携带外源基因容量更大，约36 kb，但由于病毒包装基因必须基因被删除，第三代腺病毒载体工作组装需要辅助病毒（表达腺病毒装配必须基因），第三代腺病毒载体容量大，免疫原性低，但是量产困难，存在辅助病毒污染风险。腺病毒感染力强、宿主范围广（分裂和非分裂细胞），表达迅速（24h-48h）且表达量高，包装容量大，但腺病毒不能整合入宿主基因组内，规避了整合入宿主基因组的生物风险，安全的同时也形成了细胞分裂过程中不能均等分配给子细胞。腺病毒载体适合一般体外实验，使用细胞类型较多，免疫原性较强，不适合体内实验。三、腺相关病毒腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是无包膜单链线状DNA 缺陷型病毒，外包二十面体衣壳蛋白，基因组包括两端的反向重复序列ITR（包含复制和包装所需的唯1顺式作用元件），中间的两个核心基因：Rep 基因（编码参与病毒复制、包装和基因整合的蛋白），Cap（编码结构蛋白VP1、VP2、VP3）。AAV为复制缺陷病毒，不能独立存在，其复制增殖需要辅助病毒作用。衣壳蛋白不同的AAV病毒，对组织器官的亲和力不同，形成各种AAV血清型：如AAV1较易感染骨骼肌，AAV6较易感染肺部，AAV8则亲嗜肝脏，AAV9则为神经和外周组织（见后表）。腺相关病毒载体（重组腺相关病毒载体, rAAV）的发展同样在天然AAV的基础上不断优化改进。最早采用重组载体质粒、目的基因质粒、辅助质粒、腺病毒共转染细胞，步骤多、产率低、风险高；随后采用目的基因载体、AAV基因载体(rep／cap)、辅助质粒（包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似辅助功能的基因元件）共转染细胞，但包装效率低，生物风险高；Ad/AAV嵌合载体、辅助质粒感染恒定表达Rep/Cap细胞系的方法以及AAV生产细胞系法，这些方法均操作繁琐；目前最chang用的载体方法为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统：将rAAV包装组分AAV2的Rep基因序列、Cap基因序列、以及ITR-目的基因表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，分别转染昆虫细胞Sf9各自扩增，然后通过共感染Sf9细胞来生产rAAV，该方法可以量产、成本低、操作简单且不会对人体产生损伤。AAV载体免疫原性极低，非常适合动物实验，感染效率高，宿主范围广（分裂和不分裂细胞），不整合到基因组，稳定表达持续时间长（半年以上），但是表达水平低且慢（细胞需要1周，动物需要2周），携带目的基因片段约为2kb。

　　一、薄层色谱概念　　最chang用的薄层色谱也属于液-固吸附色谱。同柱色谱不同的是吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。与柱色谱过程相同，经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。　　除了固定相的形状和展开剂的移动方向不同以外，薄层色谱和柱色谱在分离原理上基本相同。由于薄层色谱操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快，所以经常被用于探索柱色谱分离条件和监测柱色谱过程。　　二、薄层色谱条件　　⑴固定相选择　　柱色谱中提到的吸附剂都可以用作为薄层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱色谱的选择原则相同一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度更小。商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。　　⑵展开剂选择　　薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大选择展开剂时，除参照表列溶剂极性来选择外，更多地采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验：　　①若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强；　　②若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。　　当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混合展开剂常需多次仔细选择才能确定。　　⑶相对移动值从点样原点开始到展开后的溶剂前沿，是溶剂的移动距离，记为lo，混合物中各组分的移动距离分别记为l1，l2，l3…。　　⑷显色　　分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外线显色。　　①碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。　　②紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F，氧化铝F等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。　　有时对于特殊有机物使用专用的显色剂显色。此时常用盛有显色剂溶液的喷雾器喷板显色。　　三、薄层色谱操作（见视频“色谱装置与操作”）　　⑴制板（以硅胶板为例）　　选择合适的玻璃板（经常使用显微镜上的载玻片），依次用水和乙醇洗净，晾干。取适量薄层色谱用的硅胶，加适量蒸馏水调成糊。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。将糊倒在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115oC左右烘干40-50分钟。冷却后使用。　　⑵点样　　将试样用最少量展开剂溶解，用毛细管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量过多。　　⑶展开　　吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定高度（由试验确定适当的展开高度），取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。　　⑷显色，计算Rf值　　挥发干展开剂，选择合适的显色方法显色。量出展开剂和各组分的移动距离，计算各组分的相对移动值。　　四、薄层色谱应用　　⑴可用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；　　⑵可用于确定混合物中含有的组分数；　　⑶可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；　　⑷可用于检测反应过程。