1mg或是几mg的标准品怎么称量?有人说，要用百万分之一天平，用十万分之一的达不到要求，误差太大。还有人说，在称几个mg的标准品时，最好还是用减量法称量，减量法会更准确。但是，少量标准品一般用分析天平称好溶解后，再一步步稀释得到，而不用一步称到位，再溶解。我们都知道，有些标准品非常昂贵，厂商只能以非常小的包装提供给客户，如1mg\5mg\10mg等，所以，如何高效称量，需要好好判断好再行动哦。　　标准品的分级　　国际标准化委员会将标准品(参考物)的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质，并将其分成三级。　　⒈一级标准品一级标准品(原级参考物)是已经确定的稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量。它可用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为“二级标准品”定值。一级标准品都有证书，在美国由国家标准局(NBS)发给合格证书，并指明它的性质和有关数据。　　⒉二级标准品二级标准品(次级标准品)或是纯溶液(水或有机溶剂的溶液)，或存在于相似基质中。这类标准品可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定，主要用于常规方法的标化或为控制物定值。　　⒊控制物控制物有冻干的或溶液，可以用适当的标准品(一级或二级)以参考方法定值，用于质量控制，不用于标化(除经准确定值者)。　　标准品相关定义　　参考值：该值为标准样品研制单位提出，但未经验证或只确定的数值。　　不确定度：测定结果表达式中说明数值范围的那一部分，表示真值以给定的概率落在此范围内。　　不确定度的含义是指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度。反过来，也表明该结果的可信赖程度。它是测量结果质量的指标。不确定度愈小，所述结果与被测量的真值愈接近，质量越高，水平越高，其使用价值越高;不确定度越大，测量结果的质量越低，水平越低，其使用价值也越低。　　准确度：测定值和真值之间的符合程度。　　标准品称量方法　　请根据您需要称量的重量和容许误差选择合适的天平。如称量少于10mg的产品，建议使用十万分之一的分析天平。在购买产品时也请注意产品的重量能否满足您的需求。一般采用增量法或减量法进行称量，以下是一些建议供您参考：　　a.称量前：建议将产品直立放置一段时间，使产品全部集中至底部，便于取用。尤其是粘稠状物质，可以倾斜至与竖直方向呈45度，使产品集中在瓶底边缘。如果当心瓶盖上有粘附，可以在未打开瓶盖前甩动瓶身，使产品集中至瓶底。　　b.粉末或晶体：建议采用增量法称量，准备合适的干燥容器，归零后将产品倾倒在容器内，得出容器中用于配制标准溶液的物质重量。　　c.粘稠状或液体：建议采用减量法称量，先称量原产品连瓶一起的重量，再用适当器具移取所需样品至配制容器中，称量移取后的产品连瓶重量，其差值为实际用于配制标准溶液的重量。　　d.如果瓶盖上粘有物质，可以在减量法称量时连瓶盖一起称量，移取产品时注意使用干燥的器具。　　瓶内少量标准品的称量和溶解　　请根据已有的方法或者物质的相关理化性质选择合适溶剂。不适当的溶剂可能造成无法溶解或者产品降解。　　1.当样品量非常少时，如何从瓶子中获取所有的纯物质呢?有些标准品非常昂贵，厂商只能以非常小的包装提供给客户，如1mg\5mg\10mg等，拿到产品时可能会觉得瓶子是空的，这种情况是由于粉末状的物质会分散在瓶壁和盖子上，而液体状物质会在瓶壁形成一层可能看不见的液层。可根据具体的实际情况，按照以下操作来获取瓶内所有产品：　　1、擦拭瓶外壁和盖子，等其晾干。　　2、称量整个瓶子，记录数据，精确至0.1mg。　　3、用合适的溶剂将瓶内的产品转移到容量瓶中。荡洗瓶盖和瓶内壁数次并都转移到此容量瓶中。　　4、中等加热或者氮吹使瓶外壁和内壁干燥。　　5、在同一台天平上称量空瓶连盖的重量，精确至0.1mg。　　6、两次称量差值即为容量瓶内溶解的产品量。　　7、用溶剂定容至容量瓶刻度，即可计算所配溶液的浓度。　　2.能否直接将溶剂加入标准品的瓶子中进行溶解，再转移到容量瓶中定容?不能。一般除非特别指明，所有标准品厂商给出的产品质量和体积都不是精确数值，比如10mg的标准品，其瓶中的产品重量可能大于10mg，如10.5mg或11mg。如果产品的重量为精确数值，厂家一般会特别注明，如CDDD-SC494-10MG，其在证书中有说明。所以请务必先对产品进行称量，在标准曲线浓度计算中使用实际称量数值。　　注意事项　　产品的保质期：厂家的标签或分析证书上一般有保质期限，其含义是当产品未打开使用并按照厂家注明的条件进行保存时，厂家对产品的纯度与分析证书上的纯度的一致性负责。由于分析中会有一定的误差，所以产品的纯度一般有一个不确定度或误差范围。有一些产品，由于物质性质比较特殊，厂家对产品不标明具体的保质期限，而是保证在出厂或者客户收到产品的一定时间范围内有效，即在此时间限度内厂家对产品的纯度与分析证书上的纯度的一致性负责。　　产品打开使用后：产品打开使用后，纯品型的标准品，一般在适当储存条件下还是比较稳定的，厂家给出的产品保质期也是可以参考的，少数挥发性物质如乙醛等除外。而对于溶液型的标准品，建议客户打开后尽快使用，物质降解和溶剂挥发等原因都有可能对溶液的浓度产生影响。　　标准溶液的稳定性：对于购买的溶液型标准品和自己用纯品型配制的标准溶液，在初次使用后请在适当条件下保存。一段时间后如需再次使用，请通过与之前的数据对比对溶液的浓度进行确证再使用。

　　1.什么是pH标准缓冲溶液？它有哪些特点？　　pH缓冲溶液是一种能使pH值保持稳定的溶液。如果向这种溶液中加入少量的酸或碱，或者在溶液中的化学反应产生少量的酸或碱，以及将溶液适当稀释，这个溶液的pH值基本上稳定不变，这种能对抗少量酸碱或大或稀释，而使pH值不变化的溶液就称为缓冲溶液。　　pH标准缓冲液有以下特点：　　（1）标准溶液的pH值是已知的，并达到规定的准确度；　　（2）标准溶液的pH值有良好的复现性和稳定性，具有较大的缓冲容量，较小的稀释值和较小的温度系数；　　（3）溶液的制备方法简单；　　2.如何配制pH标准缓冲溶液？　　对于一般pH测量，可使用成套的pH组冲试剂（可配制250mL），配制溶液时，应使用去离子水，并预先煮沸15～30分钟，以除去溶解的二氧化碳。剪开塑料袋将试剂倒入烧杯中，用适量去离子水使之溶解，并冲洗包装袋，再倒入250mL容量瓶中，稀释至刻度，充分摇匀即可。　　3.如何正确保存和使用pH缓冲溶液？　　缓冲溶液配制后，应装在玻璃瓶或聚乙烯瓶中（碱性pH缓冲液，如，pH=9.18、pH=10.01、pH=12.46等，应装在聚乙烯瓶中）瓶盖严密盖紧，在冰箱中低温(5～10℃)保存，一般可使用六个月左右，如发现有混频器浊，发霉或沉淀现象，不能继续使用。使用时，应准备几个50mL的聚乙烯小瓶，将大瓶中的组冲溶液倒入小瓶中，并在环境温度下放置1～2个小时，等温度平衡后再使用。使用后不得再倒入大瓶中，以免污染，瓶中的缓冲溶液在＞10℃的环境条件下可以使用2～3天，一般pH=7.00、pH=6.86、pH=14.00三种溶液使用时间可以长一些，pH=9.18和pH=10.01溶液由于吸收空气中的二氧化碳，其pH值比较容易变化。　　4.pH缓冲溶液有何用途？　　（1）pH测量前标定校准pH计。　　（2）用以检定pH计的准确性，例如，用pH=6.86和pH=14.00，标定pH计后，将pH电极插入pH=9.18溶液中，检查仪器显示值和标准溶液的pH值是否一致。　　（3）在一般精度测量时检pH计是否需要重新标定。pH计标定并使用后也许会产生漂移或变化，因此在测试前将电极插入与被测溶液比较接近的标准缓冲液中，根据误差大小确定是否需要重新标定。　　（4）检测pH电极的性能。

　　一、无菌操作要求　　1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。　　2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间， 工作前经紫外线消毒后使用。　　3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。　　4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。　　5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。　　6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取 出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。　　7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆 的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。　　8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。　　二、无菌间使用要求　　1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌 间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。　　2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。　　3、无菌间使用前后应将门关紧， 打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。　　4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。　　5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。　　三、消毒灭菌要求　　微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。　　（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法　　1、灭菌前准备　　（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如 用金属筒应将上面通气孔打开。　　（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包 好。　　2、装放　　（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。　　（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能 过挤。　　3、设备检查　　（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。　　（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：　　①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水 量补足，水变混浊需更换）.　　②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。　　③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。　　④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。　　⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至 60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。　　（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：　　①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。　　② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。　　③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定。　　④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。　　⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按 动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。　　5、灭菌温度与时间　　（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。　　（2）压力蒸气灭菌 锅灭菌温度与时间。　　（二）间歇灭菌方法　　1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。　　（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。　　（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。　　（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。　　2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营 养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。　　（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。　　（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。　　3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2%石/炭酸煮沸5 min，加入0.02%甲醛，80℃煮60 min均可达到灭菌目的， 但选用 煮沸消毒的增消剂时， 应注意对物品的腐蚀性。　　4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。　　（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。　　（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。　　（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。　　（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。　　（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无 菌物品使用。　　（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。　　（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。　　（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。　　四、有毒有菌污物处理要求　　微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。　　1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。　　2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。　　3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石/炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。　　4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯 中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。　　5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石/炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。　　污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。　　五、培养基制备要求　　培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：　　1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药 品应进行质量检验。　　2、PH 测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基 PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可 影响一些培养基的 PH 降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基 的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。　　3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉 花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。　　4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。　　5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。　　6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养 基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。　　7、目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。　　8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。　　六、样品采集及处理要求　　1、所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。　　2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。　　3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤 酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。　　4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。　　5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。　　（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。　　（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。　　（3）按规定采样数量不足者。　　对送检符合要求的样品， 检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。　　6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。　　（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。　　（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml 灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。　　（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。　　七、记录和报告的要求　　1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验， 检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。　　2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

　　微生物活性检测的技术原理是通过准确测量微生物细胞内的三磷酸腺苷（ATP）浓度，来判断微生物的活性。微生物细胞内的ATP和荧光酶混合后会反应发光，通过测量发光的亮度RLU来计算ATP浓度，然后再根据经验公式将ATP浓度转化为微生物浓度。　　微生物活性检测的几大影响要素分析：　　1.营养物质的比例　　B：N：P。另外还需要一些微量元素，如铁、锌、锰等。　　2.温度　　50-70℃；-5-0℃；是微生物无法适应，直接死亡的危险温度。处理污水的各类微生物适宜在20-35℃。　　在适宜的温度范围内，温度越高，微生物的活性越强，处理效果也越好；反之则相反。　　3.PH　　水解酸化微生物可在PH 3.5-10范围内生存，PH为：5.5-6.5。　　硝化微生物在PH 8-9范围内强，小于6.5要加碱；　　反硝化微生物在PH 8-9范围内能进行正常反应，在6.5-8的范围内，小于6.5时要加碱；　　除磷微生物在6.5-8内能正常进行，如小于6.5时要加碱。　　一般应将PH控制在6.5-8或6.5-9的范围内。　　微生物活性检测设备作为便携现场工具，可以协助运营人员快速诊断问题以及指导工艺调试。预警污泥膨胀以及检测附着状态下（mbbr，生物膜，生物滤池）的微生物活性，表征生物膜上、填料上微生物的生长情况。

标准品实际上就是大家所说的标准物品，它所充当的角色就是衡量标准，专门用做药物方面对照品的一种衡量标准，即为含量测定中的标准含量。标准品种类也是多式多样的，常见的有冶金标准品、化学计量标准品和药检标准品等。虽然标准品与对照品有一定的区别，但是标准品或对照品混用的现象是司空见惯的，这就带来了一定的麻烦。那么，为什么会出现标准品或对照品混用的情况呢?下面远慕生物来给大家简单分析一下其原因。为什么会出现标准品或对照品混用的情况呢：(1)卫生部提供的对照品使用说明书不够详尽，极其关键部分并没有做一个详尽的介绍，大多无对照品质量要求及标定方法，这就使得人们在使用标准品和对照品的时候出现了纰漏。(2)使用者们对标准品或者对照品，甚至是两者的正确使用方法知识相当的缺乏，正所谓要使用一个东西就必须对其有一个充分的了解，所以在不了解的情况下出现错误是情理之中的。(3)日常科研中极难找到相应的对照品，所以科研人员就只好用标准品代替对照品，久而久之大家就搞混了两者的区别。(4)中国药典正文中也常存在对照品混用的问题，如常将含量测定用的标准品或对照品用于溶出度检查，而含量测定方法与溶出度分析方法又不同，故极易引起混用。总而言之，上述所介绍的四点就是标准品和对照品常常出现混用情况的原因，希望大家在彻底了解了其相关原因之后，能够竭尽所能的改正自己常常犯的错误，在使用标准品或者对照品的时候，大家首先务必要认真检测自己是否拿错了，接着看看标准品和对照品的说明书，然后在正确将其投入使用中。

常见的规范品的保存办法有：1，常温保存：一般用于化学性质比较安稳的规范品，主张保存于干燥阴凉的当地。2，+4度冷藏：用于常温下不是很安稳的物质，保存于冰箱冷藏室。3，-20度冷冻：用于化学性质不安稳，常温下容易分化的物质。4，-80度保存：一些具有生物活性的物质，需求保存于特定的-80度的冰箱。运送条件：相关于长时刻保存的条件，运送进程因为时刻比较短，所以运送条件相对来说要求没有保存条件那么严格。长时刻保存条件为常温和+4度的规范品都可以在常温条件下运送，-20度保存的规范品在运送时可以放入冰袋来下降温度，而-80度保存的物质则需求在运送时参加干冰。但是干冰的有用时刻只能保持1天左右，所以这类型的物质不适合于长途运送。分为两种：一，是所购买的规范品有无失效，一般说来规范品都会有规范证书，只要按规范品证书上的条件进行保存即可通过时刻来认定其有用与否；二，是所配制的规范溶液是否失效。严格说来应该通过期间核查来承认，即用新配制的规范溶液来测定前一段时刻配制的规范溶液是否在差错的范围之内来认定其有用与否。（这个差错范围定在5%以内可行）关于配制成溶液的规范品在保存的时候还需求注意：除非产品标签指明放入冰箱冷藏或冷冻，不然最好放在阴凉干燥的当地室温保存即可。因为低温的时候物质确实不容易分化，但低温使得化合物的溶解度下降，因此导致常温下就难溶解的化合物在低温下长时刻放置时分出晶体，并且一旦分出晶体很难再溶解。规范品也要期间核查？规范品存放时刻，这其实在实验室认可中有清晰的要求，便是所谓的规范品的期间核查。关于已经打开运用的规范品溶液型的产品最好一次性运用完，假如不能运用完，请尽量转移到一个可以避免溶液蒸发的容器中，依照产品的标签进行保存。但在保存进程中，还是有很大可能性因为溶液蒸发导致成分的值与COA不符合。

LC-MS可以通过采集质谱得到总离子色谱图。由于电喷雾是一种软电离源,通常很少或没有碎片,谱图中只有准分子离子，因而只能提供未知化合物的分子量信息，不能提供结构信息。很难用来做定性分析，可以用来定量分析。但单级MS如果不用软电离源，而是EI之类的话，就有碎片峰，可以提供分子结构信息。LC-MS/MS采用串联质谱，既能得到分子离子峰，又有碎片离子峰，因而可以用来进行定性和定量分析。一个基本相似之处是：他们的应用领域都适用于液相适用的领域。质谱的最大特点是：它本身是有质量信息的，是可以靠这个质量信息定性或提供定性的一些依据的（还需要其它的一些定性仪器）。其次，质谱本身也有一个分离作用，就是按照质量的分离，如果液相分离了一次，那LC－MS就分离了两次，而LC-MS/MS就分离了三次，LC-MS3就分离了四次....（3级以上是离子阱质谱的特点）。LC-MS和LC-MS/MS（或MSn）的最大区别是：如果你关心的结果是你样品中的主成分，而且是你已经知道的目标物，比如质控、有机合成后看一下纯品、部分的农药全分析工作、药物合成中前导化合物的指导（合成一锅就打一针看看合成得对不对）等等，都可以用LC-MS。因为它很便宜，操作也很简单。即时有些东西液相没分开，但只要你关心的是主成分，影响都不大。通过调整一下液相条件，或做完扫描图直接看提取离子图，或做SIM都可以。这些领域用LC-MS/MS是大材小用，花这么多钱是浪费。而如果你关心的结果是：（1）未知的东西，打一针LC-MS无法定性，需要更多的碎片信息；（2）是混合物中的痕量成分。那你必须用LC-MS/MS：LC-MS/MS可以给出需要更多的碎片信息，帮助你来定性；LC-MS/MS可以降低背景噪音，让痕量组分的谱图不受丰量物质的干扰；LC-MS/MS可以降低很多背景噪音，使你的化合物的灵敏度大幅提高，定量结果变好。1.LC-MS-MS如何用内内标定量分析？Q：本人现在用三重四级杆LCMSMS定量分析目标物，但是没有标准品。内标法该具体怎么操作呢？资料说先配制一定重量比的待测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线，如果这样的话，没有标准品怎么办？方法一：1、内标法进行定量分析，同样需要待测物标准品。如果没有待测物标准品就不能准确测量其含量，因为无法绘制标准曲线。2、没有待测物标准品不能准确测量其含量，但可以通过加入内标的方法测量待测物的相对含量，可以比较待测物在各样品中的多少及相差倍数。3、用LC-MS-MS做定量一般都采用MRM的扫描方式，你没有待测物标准品，就无法建立和优化MRM扫描的质谱参数，这样你只能使用FULL SCAN或SIM的扫描方法。没有待测物标准品，你也无法准确得到待测物在LC上的保留时间，如果你的样品中有与待测物相似质量数的化合物，你得到的色谱峰就不会很纯净，会对你判定那个是你的待测化合物产生干扰。方法二：没有标准品，就只用面积相对定量。然后选用LCMSMS的SIM模式（样品杂质比较少，选择同位素丰度为100%的分子量，上下增减0.2）。考察因素导致的量的改变比较微量，选择一种物质为回收率指示物（反应液前处理前加入），一种物质为内标物（前处理后、液相小瓶中进样测试前，在待测样品中加入定量的内标物，然后进行测试）。2.LC-MS可以进行定量分析吗？LC-MS如何进行定量分析？请问液质联用中质谱跑出来用于定性的图谱是什么样的，既然是用质谱来进行定量的话，那色谱本身配置的紫外检测器跑出来的图谱用于何用？液质联用有SIM和全扫描的，那么一般在药物代谢动力学试验中一般用哪一种呢？尤其是在对体内药物分析时，内标法用于定量的质谱图是什么样的？质谱定量分析，使用的一般是LC-MS/MS,不使用LC-MS, 看一下质荷比，推测下分子量。UV可以用来定量，但是在有紫外吸收的干扰峰的时候，定量是不准的。LC-MS/MS使用母离子/子离子来进行定量，相对来说，干扰要少的多，也比较准确，在PK/TK的应用很广泛。这里只有LC-MS/MS定量的谱图，仅供参考！183.1/141.3 通道的是内标，其他的两个是化合物。质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯1的断裂。合并特异的母离子质量和唯1的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。3.LC-MS-MS如何进行定量分析？我想用LC-Q-TOF-MS 来做代谢组学，因为是样品是体液含有多种化合物，想加入内标后先进行一个相对的定量来判断含量发生变化的化合物，怎样去定量？用总离子流图好像不合适，如果利用峰面积进行相对定量的话，用哪个图比较合适？必须得用标准品才能定性吗？LC-MS-MS定量分析使用SIM 或MRM模式。公认的MRM更为准确。SIM使用Q选择性的滤过选中的分子量。但是分子量相同的化合物很多，所以，如果样品稍微复杂的话，SIM基本不合适。MRM选择母离子和子离子。使用Q过滤母离子，q 轰击母离子，TOF过滤子离子，使子离子被检测器检测到。分子量相同，轰击后产生的子离子不一样的干扰离子就被排除了。所以，MRM模式是更为可靠的LC-MS定量分析方法。MRM检测是离子对。内标的选择原理是结构基本和待测化合物类似。结构相同或类似，主要是为了满足被离子化的效率与样品类似。这就是为什么很多都选择使用该化合物或此类化合物的氘代化合物。内标的选择还要求其分子量与待测物质不重合(还需要尽量避开化合物的isotopic peak的m/z)，并且可以和待测物质分开。如果使用MRM, 样品被分开的话，那么理论上来说总离子流图上的每个峰都是代表一种物质。同时使用MRM模式，如果样品们的分子量与子离子不重叠，那么，即使在柱子中不被分开的化合物，也是可以认为在MS中被分开了。文献报道的液质中几个峰，MRM检测到几十个物质就是多个物质在同一时间从色谱柱跑出来了。虽然出峰时间一样，但是每个化合物的peak应该是软件中可以显示出来的，只不过报道中由于篇幅有限，会被简略掉。定性的话，需要标品，retention time 需要一致。定量的话，需要先作标准曲线。peak area ration vs concentration.

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。在接种的过程中需要注意哪些问题呢？（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。（5）恒温培养箱应经常清洁消毒。说到这个恒温培养箱，跟大家多说几点，恒温培养箱供大专院校、生物、农业、科研等部门作储藏菌种、生物培养，进行科研的必须设备。要想做好微生物接种实验，就要选喆图生产的专用微生物接种培养箱，能保证实验更顺利的完成。 

　　蛋白质工程是开发有用或有价值的蛋白质的过程。它是一门年轻的学科，正在对蛋白质折叠的理解和蛋白质设计原理的识别方面进行大量研究。它也是一个产品和服务市场，到2017年估计价值为1,680亿美元。　　蛋白质工程有两种通用策略：合理的蛋白质设计和定向进化。这些方法不是互斥的。研究人员经常会同时使用这两种方法。将来，对蛋白质结构和功能的更详细了解以及高通量筛选的进步可能会xxx扩展蛋白质工程的能力。最终，甚至可以通过较新的方法（包括扩展的遗传密码）包括非天然氨基酸，该方法允许以遗传密码编码新氨基酸。　　一旦蛋白质经历了定向进化，定量设计或半定量设计，就必须筛选突变体蛋白的文库，以确定哪些突变体显示出增强的特性。噬菌体展示方法是筛选蛋白质的一种选择。该方法涉及将编码变体多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合。通过在体外与固定的靶标结合来选择在噬菌体表面表达的蛋白质变体。然后在细菌中扩增具有选定蛋白质变体的噬菌体，然后通过酶联免疫吸附测定法鉴定阳性克隆。然后将这些选择的噬菌体进行DNA测序。　　细胞表面展示系统也可用于筛选突变多肽文库。将文库突变基因掺入表达载体中，然后将其转化成合适的宿主细胞。对这些宿主细胞进行进一步的高通量筛选方法，以鉴定具有所需表型的细胞。　　已经开发了无细胞展示系统以利用体外蛋白质翻译或无细胞翻译。这些方法包括mRNA展示，核糖体展示，共价和非共价DNA展示以及体外区室化。

　　琼脂扩散试验包括琼脂双向单扩散试验和琼脂双向双扩散试验，后者是最常用的琼脂扩散试验，一般用于抗体或抗原的定性检测，其原理是可溶性抗原与相应的抗体（抗血清）在琼脂凝胶中向四周自由扩散，如果抗原和抗体相对应，则在二者比例适当处形成肉眼可见的白色沉淀线，反之则不会出现沉淀线。常用已知抗原检测未知的血清样本，也可用已知抗血清检测未知抗原样本。　　1 琼脂扩散试验的影响因素　　1.1 琼脂板的制备　　琼脂板的质量、浓度、黏度、厚度、湿度等都会影响琼脂扩散试验的结果，琼脂浓度越低，则孔径越大，扩散速度也会越快；如果琼脂浓度越大，那么琼脂的黏度也会随之增大，扩散速度会相对减慢，建议使用较好的琼脂（琼脂糖），最适浓度为1%，厚度约2.5毫米，注意倒热融化琼脂液时不要产生气泡，而且空气中的湿度很低，琼脂中的水分容易蒸发，待琼脂冷凝后加盖，把平皿倒置，放在装有湿纱布的搪瓷盘中，防止水分蒸发，保证湿度。　　1.2 打孔　　打孔是琼脂扩散试验中的关键，反应孔应现用现打，放在4℃冰箱中过夜后再使用。实验室常用梅花打孔器，然后用针头挑出内容物。用此种方法在打孔的过程中，注意挑出空内容物时避免将凝胶划破，否则可造成孔与孔之间产生裂痕，产生错误的实验结果。如果试验检测的样品数量不是很多，还可以将若干梅花打孔器先放在空平皿中，孔口朝下，向平皿中倒入稍冷却的热融化琼脂液，之后迅速并平稳地放入4℃冰箱中，冷却后取出平皿，逐个轻轻拔出打孔器，根据实验需要重复此操作。打孔后用酒精灯轻烤平皿底部进行封底时，在酒精灯上来回几次，以平皿不烫手（微热即可）为宜，若是塑料平皿要注意烤的时间不要过长，以免变形，待琼脂刚刚融化为止，防止琼脂板与平皿底部脱离导致阳性血清、被检血清及抗原相互串通，避免出现模糊的沉淀环，影响实验结果。　　1.3 加样　　在加样之前，首先在琼脂板上标记好实验日期及样品编号，加样过程中小心谨慎，每个样品加完后都要换枪头，避免产生小气泡，需要注意的是每孔会因受人工操作的影响在封底时各孔的容积不同，在加样时注意不要让样品溢出导致液体混合。如果大批量检测样品，必须将被检血清、阳性血清和抗原先后加入一个梅花孔后再加入下一个梅花孔，防止加入的时间间隔太长而扩散的时间不同进而影响抗原抗体结合及沉淀线的产生。　　1.4 判定结果　　当标准阳性血清和抗原孔之间只有一条明显致密线时，被检血清与抗原孔形成沉淀线，或阳性血清的沉淀线向相邻的被检血清的抗原侧偏弯，则被检血清为阳性。如果被检血清没有出现任何沉淀带，或出现的沉淀带与阳性对照沉淀带完全交叉者判为阴性。观察时需借助强光源，调整角度、方位直到阳性血清和抗原孔之间出现清晰白色沉淀线则试验成立，否则应重做。　　2 注意事项　　2.1 温度　　温度对整个试验也会有影响，制备琼脂板时融化琼脂时需在水浴中进行，注意防止在加热过程中由于水分的蒸发而影响溶液的浓度，在琼脂中加入0.01%的硫柳汞防止细菌污染，避免腐败。在一定条件下，温度越高扩散越快，通常反应在0～37℃下进行，在试验中为保证沉淀线清晰度防止沉淀线变形，可在37℃下形成沉淀线，然后置于4℃条件下。　　2.2 时间　　扩散时注意时间，时间过短不能出现沉淀线，时间太长会导致沉淀线解离或散开出现假阴性而影响实验结果，沉淀线的形成一般在24小时、48小时、72小时观察并记录，过久会出现沉淀线消失。　　2.3 其他因素　　不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、打孔时孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、抗原抗体浓度不同、孵育时平皿未放平等等，所以在做琼脂扩散试验时一定要设立对照，以免出现假阳性。

酶切的原理：DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA段(如Sma Ⅰ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言， 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。实验过程：实验材料 ：λDNA; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液; HindⅢ酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)。实验试剂：5×TBE电泳缓冲液：6×电泳载样缓冲液：0.%溴粉蓝，40%(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。溴化乙锭(EB溶液母液:将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于 室温即可。实验步骤：1、 DNA酶切反应1) 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl。2) 将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。3) 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。2、 DNA分子量标准的制备采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为 0.5mg/ml，酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段，长度分别为23.1， 9.4， 6.6， 4.4， 2.3， 2.0， 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段，长度 分别为21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9和2.5kb。3、 琼脂糖凝胶电泳1) 胶板的制备（参见琼脂糖凝胶电泳详细说明）。2) 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3) 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。4) 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。5) 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。6) DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。7) DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根据迁移距离直接查出DNA段的大小)。反之，若已知DNA段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。

免疫标记分析技术主要包括：放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记和金标记方法。1 放射物标记分析：用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)是美国科学Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法。该技术利用核素标记物的放大效应,改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。2 荧光标记分析：以荧光标记的荧光免疫分析(fluorescein immunoassay, FIA)是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高,但荧光素常会产生生物学毒性,导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降3.酶标记分析技术：是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique)，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall Van Weemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。4.发光标记分析20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。狭义的发光免疫分析( luminescence immunoassay,LIA )主要是指化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)。另外,还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析( electrochemiluminescence immunoassay , ECLIA)。CLIA是Sohrocler和Halman在20世纪70年代末期建立的,该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反应的特异性。其基本原理同酶标记分析法,是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体,标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定。5 超顺磁微粒标记分析以磁性粒子标记的磁性免疫分析技术(Magnetic Immuno Chromatofraphic Tes,tMICT)是现代物理学与生物技术结合研发生产的磁性分析检测技术,最早应用于基础医学领域[13,14]。与其它标记技术不同,该技术一个显著的优点就是用磁性粒子标记不受有色杂质干扰,可用于直接测量血液、食品、污水等有色样品。其原理是利用超顺磁性纳米微粒作为标记物,由高灵敏度磁性检测仪器测定结合在免疫复合物上的磁性微粒所产生的局部磁场效应,从而得出所测分析物的定量结果。

在免疫学实验中，通常使用封闭剂来减少非特异性结合。常用的封闭剂有脱脂奶粉，BSA，血清以及 Fab 片段单链二抗等。根据不同的平台选择相应的封闭剂。脱脂奶粉作用原理：脱脂奶粉含有多种蛋白，可以封闭未吸附蛋白的固相载体（WB 膜、ELISA 板等）位点，减少抗体与之结合的概率，避免非特异性结合带来的高背景。优点：价格便宜，因含多种不同分子量的蛋白，故封闭起来更全面。缺点：成分复杂，适用范围窄。不适用于生物素和碱性磷酸酶标记的抗体系统。且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的生产中较少应用。牛血清白蛋白BSA作用原理：同脱脂奶粉，封闭未吸附蛋白的固相载体位点。优点：成分单一，适用于 ELISA 实验，生物素、碱性磷酸酶系统的免疫学检测实验或者其他对特异性要求较高的实验。缺点：大部分 BSA 中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，造成一定背景。动物血清作用原理：1、待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，血清和 BSA 没有明显区别；2、待检样本中可能会有 Fc 受体，可以和抗体恒定区结合，而封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本 Fc 受体之间结合。BSA 则无法封闭 Fc 受体。优点：因为血清可以封闭 Fc 受体及减少抗体间的非特异性结合，故在免疫组化、免疫荧光实验中有广泛应用。缺点：某些封闭血清中可能含有叠氮钠，因此不适用于 HRP 酶标的检测体系。Fab 片段单链二抗作用原理：由于二价的抗体（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有两个结合位点，不能用来封闭。而 Fab 片段单链二抗只有一个结合位点，因此可完全封闭免疫球蛋白。应用：在 IHC 或 IF 双标/多标实验中，封闭样本表面的免疫球蛋白，封闭组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白，并可解决两个一抗来自同一种属的麻烦。无蛋白封闭剂---新型高效封闭剂Blocker 无蛋白封闭剂，该封闭剂是通过化学合成高亲水性化合物，不存在生物封闭剂所担心的生物安全性、质量、批间差等问题。主要特点：1）与微球表面活化的羧基偶联形成稳定的共价键2）纯化学合成，批间差小，纯度高3）空间结构简单，更充分的封闭微球表面，降低微球非特异性吸附，减少基质干扰4）提高试剂灵敏度5）含大量亲水基团，有利于提高试剂稳定性应用领域：乳胶免疫比浊试剂/ 化学发光试剂 ，代替 BSA 作为封闭剂或与 BSA 联合封闭。免疫试剂稳定液免疫试剂稳定液主要用于免疫分析检测试剂/抗原/抗体/蛋白的保存.  该产品属于即用型，无需稀释，使用简单方便，将待保存物质溶于稳定液中后置于冰箱即可。免疫试剂稳定   液有利于维持蛋白的三维结构，保持蛋白的生物活性，可延长免疫分析试剂及蛋白的使用期限，确保产品的性能。应用领域:1）免疫分析试剂保存, 如免疫比浊检测试剂/化学发光检测试剂2）蛋白质保存，如抗原/抗体/酶类等

很多小伙伴在对胶片印迹进行短暂曝光后，检测不到目的蛋白。可从以下几个方面来优化实验步骤：1、裂解物制备每道全细胞提取物的 20–30 ?g 总蛋白，通常足够用来检测。如果靶标蛋白的基础水平，或蛋白质修饰程度低，可能需要通过化学刺激剂来诱导表达或修饰。你可能要调查备选细胞系或组织，其所含的目的蛋白含量更高。应将样品溶解于适当的缓冲液中，该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂。应务必对裂解物进行超声处理，以确保有效的染色质和膜结合靶标的蛋白质提取。请查看我们网站上的对照物表，获得推荐的阳性对照物和处理方法。2、一抗稀释和/或孵育使用推荐的封闭剂（5% BSA 或 5% 脱脂奶粉），以推荐的稀释度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，过夜孵育一抗。使用备选封闭剂，如明胶、血清、无蛋白封闭剂、酪蛋白、或混合封闭剂，可能降低靶标信号强度。如需单个抗体的优化结果，请查询产品数据表找到推荐的稀释缓冲液。3、SDS-PAGE 凝胶选择一般来说，推荐采用 Tris-Glycine 凝胶。但是，对于高分子量蛋白质，我们推荐采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。蛋白质从 1 毫米凝胶转移比从 1.5 毫米凝胶转移更有效。使用更厚的凝胶，可能会导致高分子量蛋白质的转移不完全，所以我们推荐监测转移效率，根据目的靶标蛋白质分子量大小，优化转移条件。4、转移和膜可通过延长转移时间或使用更高的电压，可改善转膜不完全。一般来说，我们建议在转移缓冲液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 电压下进行为时 2 小时的湿转。对于高分子量蛋白质，我们建议减少转移缓冲液中的甲醇至 5%，以提高转移效率并避免大分子蛋白质在凝胶基质中固定，并且在 70 V 电压下延长转移时间至 3 小时。检测较小的蛋白质时，可能在转膜期间出现过度转移（过膜蛋白质转移）问题。对于小蛋白质分子，使用孔隙大小为 0.2 ?m 的膜并在 70 V 电压下进行为时 1.5 小时的湿转，而不是使用孔隙大小为 0.45 ?m 的膜或进行过夜转移，这样做很重要，因为后者可能会导致过度转移和丢失小蛋白质分子信号。5、封闭膜封闭时间过长可能会掩盖抗原表位，并阻止抗体结合。在室温下仅封闭 1 小时。6、洗涤洗涤时间超过推荐的三次 5 分钟是一个常见问题，可能会导致减少信号。我们推荐计时洗涤，以确保准确性。TBST 应包含 0.1% Tween? 20。这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。此外，我们建议在 TBST 中洗涤，因为已有数据显示在 PBST 中洗涤会导致减少信号。7、二抗稀释和/或孵育可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释，以优化二抗浓度。务必在室温下，在含 5% 脱脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小时。避免在 HRP-偶联二抗的缓冲液中加入叠氮hua钠，因为叠氮化物会抑制 HRP 的活性。8、检测试剂采用能用抗-生物素-HRP 进行检测的生物素化分子量标准作为化学发光检测的阳性对照物。

区别：1、化学式不同。丙二醇：C3H8O2   丁二醇：C4H10O2   乙醇：C2H5OH2、状态不同。丙二醇和丁二醇均为无色粘稠状液体；乙醇为易燃易挥发的无色透明液体。3、气味不同。丙二醇近乎无味，细闻微甜；丁二醇无味；乙醇具有特殊香味，并略带刺激。4、用处不同。在化妆品中，丙二醇、丁二醇均可做保湿剂且具有一定的抑菌效果；乙醇不能做保湿剂。此外：丙二醇可用作不饱和聚酯树脂的原料.在化妆品、牙膏和香皂中可与甘油或山梨醇配合用作润湿剂。在染发剂中用作调湿、匀发剂，也用作防冻剂，还用于玻璃纸、增塑剂和制药工业。丁二醇可用于有机合成，是聚酯树酯、醇酸树脂的原料，增塑剂的原料，聚氨酯涂料的原料，湿润剂和柔软剂，医药、染料的中间体，表面活性剂，塑化剂，吸湿剂，偶合剂，溶剂，食品添加及香味剂。乙醇可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70%~75%的乙醇作消毒剂等，在国防化工、医疗卫生、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。乙醇：有机化合物的一大类，是脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子被羟基取代而成的化合物。一般所指的醇，羟基是与一个饱和的，sp3杂化的碳原子相连。若羟基与苯环相连，则是酚；若羟基与sp2杂化的烯类碳相连，则是烯醇。酚与烯醇与一般的醇性质上有较大差异。化学反应1、与金属反应因为乙醇可以电离出极少量的氢离子，所以其只能与少量金属（主要是碱金属）反应生成对应的有机盐以及氢气：结论：（1）乙醇可以与金属/钠反应产生氢气，但不如水与金属/钠反应剧烈。金属/钠与水反应剧烈，钠熔化，气泡猛烈，反应生成的热，可使钠燃烧；而乙醇与金属/钠的反应很缓慢，形状不怎么变化，气泡很缓慢，金属/钠沉在溶液底下。（2）活泼金属（钾、钙、钠等）可以将乙醇羟基里的氢取代出来。醇的金属盐遇水则迅速水解生成醇和碱。 2、酯化反应乙醇可以与乙酸在浓硫酸的催化并加热的情况下，发生酯化作用，生成乙酸乙酯（具有果香味；酒放得越久就越香就是因为乙醇被缓慢氧化成乙酸，然后发生酯化反应作用，生成乙酸乙酯）。反应为可逆反应：反应中酸脱去羟基，醇脱去羟基上的氢，即“酸脱羟基醇脱氢”。 3、取代反应乙醇可以和卤化氢发生取代反应，生成卤代烃和水。通式：（X为卤素）注意：通常用溴化钠和中等浓度的硫酸的混合物与乙醇加热进行该反应，故常有红棕色气体（溴单质）产生。

一、物质不同1、1,3-丙二醇1,3-丙二醇是一种化学物质，分子式是C?H?O?。可以发生氧化，酯化反应，可以与水混溶，可以混溶于乙醇、乙醚。在工业生产中作为有机溶剂被广泛应用。2、甘油丙三醇，能从空气中吸收潮气，也能吸收硫化氢、氰化氢和二氧化硫。难溶于苯、氯仿、四氯化碳、二硫化碳、石油醚和油类。 丙三醇是甘油三酯分子的骨架成分。相对密度1.26362。熔点17.8℃。沸点290.0℃（分解）。折光率1.4746。闪点（开杯）176℃。急性毒性：LD50：31500 mg/kg(大鼠经口)。二、性质不同1、1,3-丙二醇外观与性状： 无色、无臭，具咸味、吸湿性的粘稠液体。(纯品)熔点(℃)： -27沸点(℃)： 210-211相对密度(水=1)： 1.05(25℃)相对蒸气密度(空气=1)： 2.62、甘油性状：无色无臭的黏稠状液体，有甜味。沸点（℃,101.3kPa）：290，182（2666pa）熔点（℃,流动点）：20相对密度（g/mL,15/15?C）：1.26526相对密度（g/mL,20/20?C）：1.2613三、作用不同1、1,3-丙二醇可用于多种药物、新型聚酯PTT、医药中间体及新型抗氧剂的合成。2、甘油气相色谱固定液（最高使用温度75℃，溶剂为甲醇），分离分析低沸点含氧化合物、胺类化合物、氮或氧杂环化合物，能完全分离3-甲基吡啶（沸点144.14℃）和4-甲基吡啶（沸点145.36℃）。适用于水溶液的分析、溶剂、气量计及水压机缓震液、软化剂、抗生素发酵用营养剂、干燥剂、润滑剂、制药工业、化妆品配制、有机合成、塑化剂。可与水以任何比例溶解，低浓度丙三醇溶液可做润滑油对皮肤进行滋润（开塞露）。

【目的与原理]】掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白的含量。血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。用盐析法沉淀血清中球蛋白，用双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。血清球蛋白的量从两者的差值求得。【[试剂与器材】试剂：1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。保存于25℃以上的温度中。2、双缩脲试剂3、标准血清：市售或配制。4、乙mi器材：可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。【实验步骤】1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。以1ml刻度吸管吸取悬液1ml（相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。剩余的混悬液另加乙mi约2ml，揿住管口，在约20秒钟内颠倒混和40次，然后经每分钟2500转的速度离心沉淀5分钟。此时试管内分成三层：上层为乙mi，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白测定管”。在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”。2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。3、计算将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值：（1）总蛋白测定管光密度/ 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清总蛋白g/100ml（2）白蛋白测定管光密度/标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清白蛋白g/100ml（3）血清总蛋白—血清白蛋白=血清球蛋白g/100ml（4）血清白蛋白÷血清球蛋白=血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。【方法评估】本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。在25℃操作时，无结晶析出。用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。血清经盐析分离后，蛋白质的测定一般均用比色法。【应用意义】白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白>球蛋白，另一些鱼白蛋白【注意事项】1、某些用乙mi及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙mi，而用优质小张中速滤纸在37℃水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时可按1：20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在25℃以上的室温中进行。如受实验室条件限制，只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与本法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23%硫酸钠溶液（无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21%亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g，加蒸馏水到1L）。

　　牛血清白蛋白(BSA)，是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，分子量为66.446KDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用。　　是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着;α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着;转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。　　折叠多肽　　血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。　　牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分(38g/100ml)，分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在westernblot中作为Blockingagent。　　牛血清白蛋白的用途：　　1、在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。　　2、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。　　3、生化研究，遗传工程和药物研究。　　牛血清白蛋白的储备方式：　　每10克加100毫升水进行溶解，或用 PBS溶解也可，视用途而决定。然后分装成小支。若不使用防腐剂可贮存在零下20或30摄氏度的恒温柜中，若使用防腐剂则可贮存在零上4摄氏度的环境下。一般可存放数月不变质。防腐剂可能对牛血清白蛋白的效果造成影响，应慎用。　　在免疫试验中常用作封闭剂包括ELISA、WB（Western Blot）。作为载体蛋白，将其交联于半抗原和其他弱抗原可以使它们在抗体生产中具有更强的免疫原性。在限制性内切酶消化反应中，BSA常常被用作一些酶的反应稳定剂，并且能防止它粘附到管壁和枪头上。BSA也常用于生物制药的生产过程或者作为营养物用于细胞和微生物培养。除此之外，还作为蛋白定量检测的标准品使用。

实验概要可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。本文介绍了单向和双向两种琼脂扩散试验的操作流程。单向琼脂扩散试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量；双向琼脂扩散试验可用来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。实验原理1. 单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。2. 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。实验步骤1. 单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的测定   1) 材料IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器(10微升)、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。   2) 方法      a. 免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴比/妥缓冲液配成)，加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度)，混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。      b. 稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。      c. 加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。      d. 扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，(如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察)，必要时可以染色后观察。      e. 绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法：      Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散(＞48小时)的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。      Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。2. 双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)   1) 材料羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。   2) 方法      a. 用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。      b. 待琼脂凝固后，按右图用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。      c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。      d. 将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3 缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。(1)按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。(2)改用不依赖CO2培养液。(3)松开瓶盖1/4 圈。加HEPES 缓冲液至10 到25mM终浓度。(4)在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。(5)如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。

可能原因：1 细胞崩解了；2 培养基可能污染了，取部分培养基进行检菌试验细胞培养中常见的生物污染类型有7种,分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染.他们在细胞培养中污染的特点如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显.2、支原体：黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一.而且它不能用过滤的办法除去.支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去.3、黑胶虫：可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的.常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象.对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理.4、真菌：一般培养液清亮,不变色,镜下有丝状物,有些真菌开始很像死细胞碎片,只是它很多很多的小块很清楚,象珊瑚状,不象细胞碎片分不清,慢慢的会长出很细的黑色丝状物.真菌生长的比较慢,不象细菌那么容易被发现,但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了,也很难救活了5、原虫：培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮.他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养.这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,最终形成恶性循环.6.病毒：组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染.目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒.尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的.因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 。7、非同种细胞污染 ：即是细胞交叉污染,由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另一种细胞污染.目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效.非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致.

对照品（标准品）是执行药品质量标准的实物对照，是量值传递的重要载体，是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具、测量药品质量的基准、确定药品真伪优劣的物质对照，也是作为校正测试仪器与方法的物质标准。对国家药品标准而言，它是国家颁发的一种药品计量、定性的标准物质。药品标准物质必须具备材料均匀、性能稳定、量值准确等条件，才能发挥其统一量值的作用。在药物研发当中，对照品（标准品）涉及量值溯源、产品定性、杂质控制等重要环节，其制备和标定情况与药品的质量研究、稳定性研究乃至药理毒理学研究中剂量的确定等临床前基础研究间存在密切关系，因此，药品对照品（标准品）的制备与标定是药品技术审评的一项重要内容。一般来讲，药品研发中标准物质的使用一般可参照如下原则：1、所用对照品（标准品）中检院已有发放提供（可参阅中国药典2010年版二部附录ⅩⅤ　G），且使用方法相同时，应使用中检院提供的现行批号对照品（标准品），并提供其标签和使用说明书，说明其批号，不应使用其他来源的标准物质；使用方法与说明书使用方法不同时，如定性对照品用作定量用、效价测定用标准品用作理化测定法定量、UV法或容量法对照品用作色谱法定量等，应采用适当并经验证的方法重新标定，并提供标定方法和数据；若色谱法含量测定用对照品用作UV法或容量法，定量用对照品用作定性等，则可直接应用，不必重新标定。2. 中检院尚无对照品（标准品）供应时，可使用如下标准物质进行标准制订和其他前期基础性研究工作：（1）国外药品管理当局或药典委员会发放的对照品（标准品）或国外制药企业的工作对照品（标准品），但应提供其包装标签的彩色照片及使用说明的复印件，说明批号、有效期、使用方法等信息，能保证其量值溯源性；（2）申请人自行标定或委托省所完成对照品（标准品）的标定，申报时提供标准物质的研究资料及相关信息，一般包括如下内容：①主成分对照品--制备工艺、结构及含量方面的研究资料以及通用名、化学名、结构式、分子式、分子量、各种杂质含量（水分、残留溶剂、无机盐等）、主成分含量测定数据（不同分析技术）、用途、贮藏条件等信息。②杂质对照品--制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及含量（不同分析技术）方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、用途、贮藏条件等信息。③混合对照品（定位）--各组分制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及纯度方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、含量（如必要）、定性具体方法与限度要求。同时，申请人应及时与中检院接洽对照品（标准品）的标定事宜，以便产品上市后可以及时获得法定标准物质。3、质量标准中用到的对照品如中检院在目前情况下尚不能正常提供，建议申请人在申报资料中明确产品上市后，标准物质的可获得性及相应措施。4、质量标准中涉及到的各已知杂质，应在质量标准中明确其通用名称（或化学名称）、化学结构式、分子式、分子量等相关信息，以准确指称、控制各特定已知杂质。5、一般情况下，为确保标准物质的准确使用和控制，尚需提供对照品（标准品）的质量标准，并规定专属性控制项目，如非对映异构体杂质的比旋度等。

 原因有以下：1、 可以考虑是不是样品不纯，目的产物与杂带相差不大，所以要多跑一段时间才有尾巴。参考marker,marker应该不会有。如果有的话说明配胶有问题。2 、琼脂糖检测DNA一般去1~5微升原液，加2微升溴酚蓝便可，注意上样浓度；3、可能是原液浓度太大造成的；4、可能DNA已降解。5、在提取前对样品进行一定的脱腐处理呀。很简单。有一种TENP buffer，文献中查的到的。6、 DNA降解避免核酸酶污染。7、 DNA上样量过多，可以减少凝胶中DNA上样量。8、 所用电泳条件不合适，可以将电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应 ＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。9、 DNA样含盐过高，可以在电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。10、 有蛋白污染，可以采用电泳前酚抽提去除蛋白。11、 DNA变性，电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA

　　检测核酸的方法是一种灵敏度较高的核酸检测方法。曾经有美国科研人员发现，核酸检测能够检测得出刚染上人类免疫缺陷病毒(HIV)的病患，而现有的标准检测还无法做到这点。　　核酸检测方法有哪些　　核酸检测目前多是通过取咽试子的方法，病毒感染口腔黏膜上皮以后会寄宿在口腔黏膜上皮，通过采咽拭子可以达到取样的目的。既不需要开刀，也不需要打针，只需要被检测者张开嘴，用一个像棉签一样的试子擦拭扁桃体和咽隐窝附近的分泌物，也可以通过鼻腔取鼻咽喉部的分泌物，然后放入专门的试管内，在1小时内送到专门的检测室进行检测。　　中国工程院院士钟南山曾经回应核酸检测的准确性，他表示，这个方法本身还是正确的，应该相信核酸的检测，但得看取材，平常绝大多数是取鼻的，还有咽的，要非常注意它的取样取得合适不合适。钟南山表示，假如培训很多采样的护士进行比较准确的取材，准确性应该很高，在这个意义上核酸的准确性是准确的。　　核酸检测相关知识：　　核酸检测是检测病毒的方法，它可以更早发现感染。现在临床中对乙肝、丙肝、艾滋病都开展了核酸检测，可以在抗体产生前检测到血液中是否存在病毒。而一些呼吸道疾病可以通过咽拭子或者呼吸道分泌物的核酸检测来判断是否感染，以及推测是否具有传染性。　　季节性流感、禽流感、冠状病毒感染等通过咽拭子检测可以方便地判断出上呼吸道是否存在病毒成份，从而判断被检测者是否属于感染者。　　新冠病毒的核酸检测已经是比较成熟的检测方法了，只要在咽喉部位擦拭几秒钟就可以采集到标本。通过分析判断是否有新冠病毒的核酸成分，可以尽早发现感染者，甚至在感染者出现症状前就可以检测到阳性。　　感染者经过隔离治疗后咽拭子检测阴性说明病毒已经清除，不具有传染性了。目前两次咽拭子核酸检测阴性是确诊病例和无症状感染者解除隔离的标准之一。

　　1、核酸抽提原理　　简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。 经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。 zui常用的纯化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。*种方法是利用 PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是*种纯化方法的一个变体，省略了 PC操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。　　2、了解你的实验样品　　如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。 绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得zui好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下 -20C保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液zui好只保存有核细胞；将样品分割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。　　3、裂解方法的评价　　含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA是很容易"缠"住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA"缠"住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使zui终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质"缠"在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。有些样品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质)，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得zui大得率和zui高纯度的基础。 不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是zui高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现zui简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，zui重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质"缠"住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。 含 CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。　　该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。 SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C静置一段时间以及采用 4C 离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在zui后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒(50 kb 以上)，该方法可能会有问题。　　PCR模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性)比例也比较高。该方法zui简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法zui适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。 选择了合适的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。这个问题非常重要，但却没有获得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 组织或者 C个细胞；我的建议是，你的样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率)没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。　　4、纯化方法　　评价 PC 抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC抽提都会损失一部分核酸(因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的zui大的问题是不适合大规模抽提。 PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 –此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC抽提的，否则核酸必定降解。 高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4C会更好一些。 介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其zui大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状(如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是zui高的。　　5、醇的沉淀　　醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 –的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。 就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来(当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的*性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题 –时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。zui有参考价值的是 TRIzol提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。 如果核酸抽提的起始样品是比较"脏"的，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人"发现"乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个方面综合考虑，则建议：少量核酸用异丙醇沉淀 (量少，洗涤不是问题，不丢失为先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丢失不是问题，洗涤方便为先)。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过(我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀？)；我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。 当然，也不要忘记异丙醇沉淀的zui大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀zui终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。 PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。　　6、洗涤　　洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时(使核酸沉淀zui终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。教科书中的操作基本上都是"倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻"，这一描述本身没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了"水土不服"的问题。如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。*不受管子质量影响的操作，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。一定要牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。 另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越强，洗涤越要彻底：放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。zui关键的，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。　　7、核酸的溶解和保存　　纯化后的核酸，zui后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA 以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的稳定，我却宁可认为这是个例。 如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适　　导致的水解 (RNA在弱酸性更稳定，而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的，就是 EP管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。 现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。　　8、核酸质量的检测问题　　将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是*可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。 关于紫外分光光度仪的检测。首先，不要使用不能选择波长的仪器；使用那些已经固定了波长的仪器，大概可以算是你梦魇的开始。(没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真。)其次，一定要经常调较仪器；调较可以使用非常纯的自备核酸，也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法，非常简单；具体道理可以见我以前的帖。)zui后，要记住读数 A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了。有两个值得商榷的观点：如果 A260/A230 > 2就是纯的，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大许多，一定是有杂质残留的(具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定，A260/A280 > 2.3 决不提示核酸降解，原因是：那些能导致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小，常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的；更可能的原因是：你仪器提供的 A260/A280实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰顶，在 A280则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率zui小，在半山坡的斜率zui大的特点，不难得出如下结论：A230 和 A260的读数受仪器准确性的影响比较小，而 A280 受仪器准确性的影响比较大。 建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测。电泳后，可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害)，以及核酸的大致浓度，这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了，要测的该取多少量等)。　　9、问题解答　　A 抽提过程中的现象及可能的原因 I：核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。)。75%乙醇洗涤后，如果是空气干燥，几乎不可能过分干燥的，尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验：撕取少量 Merck 的丝状CT DNA到一个离心管中，加入无水乙醇；10 分钟后彻底去除乙醇；待乙醇完全挥发后，加入 TE，10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。 II：使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色 – 多糖残留。 III：核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留。 IV：75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变大了 – 见 10-III。　　B 紫外检测 I：A260/A280 比值低 – 蛋白质残留。但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。 II：A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差 – 苯酚残留。　　C 电泳中的现象及可能的原因 I：加样孔有荧光 – 首先一定有 DNA 的滞留；其次多含蛋白质残留；如果是比较特殊的样品，其杂质也可能导致荧光。蛋白质几乎不会被 EB染色，能出现荧光，则一定含有核酸。非常巨大的基因组DNA (>50kb)，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。更多的时候，是比较大的 DNA与残留的蛋白质结合后，电泳不能出孔而在孔中产生荧光。酶反应产物，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易在孔中出现荧光，其原因是酶与核酸几乎都有比较强的结合能力 (基因组 DNA 的PCR产物电泳往往在孔中都有荧光，而且荧光强度与体系的特异性成反比。)。如果是植物样品，还可能由其它杂质残留引起。我的经验是：蛋白残留的荧光有点发闷，其它杂质残留亮得很刺眼，且薄得锐利。 II：总 RNA 非变性电泳显示过多的条带 – 根本就不是问题。 III：总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮，但条带清晰无弥散 – 多提示 28S 没有被 EB 饱和。RNA 残留多时，基因组 DNA 的电泳也会有相似现象。简单的补染可以解决此问题。再次电泳时，或者降低上样量，或者增加胶中 EB 的量。　　D 降解的现象、原因及对策 降解的现象，如果抛开问题电泳所致，可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。 以现在的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主要是在彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织(此处的质量不仅指纯度，也指完整性才对)。彻底裂解悬浮细胞的时间zui短，彻底裂解组织的时间zui长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验室并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞 – 不应该降解，碾碎的组织 – 不应该降解，大块组织(包括鼠尾) –部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点，即使蛋白酶 K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA在抽提过程中间不被降解。 减少或者杜绝核酸降解，一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面已经说过了，不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。　　E 后续酶反应失败 资料书中连篇累牍的原因我就不说了，因为都对。我相信因为大家首先相信的就是它们，所以碰到问题首先一定会从那些方面着手。如果三次实验后，问题还没有解决，那么 90%的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀，可以陆续"杀"死很多酶；大分子物如蛋白质，像绳子，只能"捆住"一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。　　F 蛋白质是如何残留的 PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。 高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。 介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。　　G 小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的 醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。 介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。　　10、某些使用的操作手法　　实验做多了，的确希望能偷点懒；偷懒也有讲究，否则就是偷鸡不成失把米。下面就是一些在确保抽提成功前提下的通用操作方法；有些看起来很麻烦，但请想一想抽提失败后的再次抽提，应该是可以算偷懒的方法了： I：混匀操作 (1.5ml 离心管内) – 如果液体体积在 100ul 以内，用指头弹击尖底混匀；在100-400ul 之间，用振荡器混匀；大于400ul，用手晃动混匀：晃动时使离心管底永远处于斜上位置，频率要快。 II：PC 抽提时上清的移取 – 离心管倾斜，根据上清的量选择不超过 200ul 的移液器，在外面先压下移液器，再将 tip 移入上清。Tip 要尽可能靠近液面，tip 的尖嘴接触内壁，缓缓松手吸取上清。可多次移取，但决不要使用 1ml 移液器。 III：核酸的洗涤 – 核酸沉淀后离心，将上清倒掉。如果核酸是来源于杂质比较多的样品 (如植物、动物肝脏、细菌等)，则在加入 75%乙醇之前，再将离心管短暂离心后，用移液器将残留液体彻底吸出，否则，75% 的乙醇非常容易将残留液体中的多糖等杂质给沉淀下来。移取 75%乙醇使用一次性的塑料吸管，加入后将核酸彻底悬浮起来，置于室温一段时间 (时间长短取决于沉淀大小)，期间多混匀几次。如果去除 75%乙醇的操作是"离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体"，则洗涤 2 次；如果去除 75% 乙醇的操作是"离心后倒掉"，则洗涤 3次，但zui后一次仍然采用"离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体"。这样洗涤的目的，是确保小分子物的残留低于 10 万分之一 (zui大残留不高于10uM 级)。　　11、一些特别的问题　　a：EP 管的问题 几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象 (如核酸在 -20C 保存一天后发生了降解) 有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。 硅化可以提供zui高质量的 EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。zui糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。 我个人认为，只有硅化过的 EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。　　b：核酸抽提中的温度问题 核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是zui好的选择。那些认为"低温操作可以防止或者减少降解"之类的理由，并没有多少可操作性的。低温的确可以减低酶的活性，但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度，此消彼长，没有办法给出结论的。就 RNA 抽提而言，彻底匀浆前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的风险，彻底匀浆后的温度对RNA 的完整性影响已经不会大的；如果发现影响很大，说明 RNase没有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更没有道理的是认为低温沉淀和低温洗涤可以防止降解了。事实上，核酸一旦被沉淀下来，对酶的耐受力是很强的，这就是核酸保存在醇溶液中zui稳定的理论基础。如果说沉淀使用低温还可以提高得率，洗涤使用低温又是为什么？彻底的错误而已。　　c：如何阅读操作手册 拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和 By the Way之类的话中含有真正的有用素材。

血清血浆的区别：成分、作用和凝血反应。血清血浆从外观是很难分辨出来的，但是可以从以下方面来进行区别：1、成分，血浆就是从人体中抽出血液加抗凝剂，经过离心沉淀后，下面的部分叫做血细胞，上面淡黄色的部分叫做血浆。血清则是从人体中抽出血液不加抗凝剂。2、作用，血浆的作用主要是提供血细胞，运输维持人体生命活动所需要的物质和体内产生的废物等。血清的主要作用是提供基本的营养物质、提供激素和各种生长因子等，血清还能够用来检验血型。3、凝血反应，在凝血反应中，血小板释放了非常多的物质，凝血因子也会发生变化，这些成分都留在血清中并继续发生变化，并随血清存放时间逐渐减少以致消失。血清和血浆似乎在表面上没有差异，两者的主要区别在于血清是不含有纤维蛋白原，这是在没有抗凝治疗的血液凝固后获得的。在某些需要血清测定的测试中经常会遇到血液测试，基本上是通过血浆测量的。血清主要用于测定血液生化指标的免疫力;血浆主要用于血液凝固的测定。血清和血浆均是不含细胞（包括血小板）等有形成分的血液液体部分，其主要区别是血清不含凝血因子和血小板，血浆则含有凝血因子，它们的制备方法如下：1、血清的制备：获得的血液不能抗凝，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心（一般为3000rpm，离心 5～10min），得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出（注意切勿吸出细胞成分），分装备用。2、血浆制备：在盛血的容器中先加人一定比例的抗凝剂（抗凝剂：血液 = 1：9，将血液加到一定量后颠倒混匀，离心（离心条件同上）后所得的上清液即为血浆。初用者最好将上清移至另一清洁容器，吸出血浆时用毛细吸管贴着液面逐渐往下吸，切忌不能吸起细胞成分。3、富含血小板血浆制备：将获得的血液经800rpm，离心5min，其上清即为富含血小板血浆。

把细胞养好的三个关键要素是：良好的细胞来源，正确的实验操作，以及合适的培养体系。其中“合适的培养体系”就是要创造适合细胞生长的环境，给细胞建立一个满意的“家”。细胞培养基本条件：1.合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。2.优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。3.无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。4.恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。5.合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。6.细胞培养温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。7.合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。

细胞培养起来感觉会很简单，但是有时候也会出现各种不顺的问题 ，例如：污染，生长缓慢，变形，死亡率过高…..，毕竟细胞是体外培养的，在培养的时候会受到各种外界因素的影响，培养基、血清、孵育温度、C02浓度等，除此之外还有抗生素……一般来说细胞培养是不需要加抗生素，因为细胞培养必须要无菌操作。如果实验室污染严重，建议彻底打扫一下，擦拭消毒、熏蒸或者紫外照射杀菌。然后把细胞实验涉及到的试剂都做下空培，包括使用的胰酶，胎牛血清等。如果实验室无菌条件优异，细胞培养可以不加抗生素，因为抗生素的药效水平和毒性水平非常接近。特别是用于细胞治疗的培养。若当心细胞感染，可以适当添加一些抗生素预防，如果已经有污染，建议按照以下方案添加：１、最常用的是青霉素、链霉素联合抑制细菌，即所谓的“双抗”，主要针对革兰氏阳性菌、阴性菌；对于细菌的感染也可用庆大或卡那霉素；２、如果真菌污染严重，可用两性霉素／制霉菌素控制；３、若为支原体污染， 可以用远慕生物的支原体抑制剂，包装简洁，10ug/支 ，使用方便。在培养基中加入新鲜的支原体抑制剂溶液，每3-4天更换一次。一两周内的足以消除污染。可以有效的可以查杀各种原因感染的支原体。抗生素多加对细胞无益。加抗生素的主要问题是操作不慎造成的污染未必能及时发现，造成后期较大的损失。青链霉素是广谱抑菌剂，对革兰氏阴性和阳性细菌有抗菌性，青霉素影响细菌细胞壁合成的终末步骤，在转肽反应步骤一直多肽链的延伸；链霉素与核糖体的30S亚基单位结合，阻断细菌蛋白质的组成。比较常用 。一般用于哺乳动物细胞培养。一旦细胞污染，最佳处理办法扔掉，查找原因，全面预防。如果细胞是经过大量工作或高价才得到的，扔掉实在可惜，可以针对污染源加抗生素。也可以不加抗生素进行单克隆有限稀释至96孔板，再克隆化。但是污染带来的实验影响和损失不可估量，最主要的是平常都要做好细胞房的管理和消毒工作。防止污染的发生。

一、样品的运输样品从采集结束至送达实验室整个过程的运输应保证样品本身变化最小及其中的微生物数量变化最低，尽量维持样品采样时的各种最初外界条件（如储存温度、是否需要冷藏或冷冻、避光等）。样品应避免破损或漏撒，产品标签应注明是否需要冰箱保存，不需要冷藏或冷冻的样品应放置于强度较高可以避免外界破坏的合适容器内。需注意：若容器内需要加入冰袋来进行保温时，冰袋绝不可以直接接触样品。以下是各类样品建议的运输温度：（1）固体样品：样品周围温度应≤40℃。（2）冷冻或深度冷冻样品：样品周围温度应低于-15℃，最好低于-18℃。（3）其他非固体类样品：样品周围温度应在1℃~8℃。（4）拭子取样型样品：参见ISO 18593《食品与动物饲料的微生物学 用接触板和抹布对表面取样的水平方法》和ISO 17604《食品与动物饲料的微生物学 微生物分析用胴体取样》。样品周围温度应在1℃~4℃，样品运输时间最好不要超过4h。二、样品接收接收样品时应仔细检查样品的状态，如果样品性状异常或样品数量不够，实验室应拒绝接受此样品。在特殊情况下，和客户进行沟通说明达成一致意见之后，实验室才可以进行检测。在这种情况下，实验室出具的检测报告应记录样品的情况。实验室接收的样品应建立样品档案，对样品检测的整个过程都应有相应的原始记录，样品的编号必须能追溯至实验室工作的每个环节。如果有需要的话，盛纳样品的容器的外表面应用适宜的消毒剂进行消毒，同时仔细检查容器外表面是否有明显的物理损伤。样品标签记录信息应包括以下内容：（1）接收日期（如果需要更加准确，可以加上接收时间）。（2）抽样详细信息（抽样日期和时间，样品状态）。（3）客户姓名和地址。如果是易腐败样品，样品的标签上还应注明运输时的温度和保鲜温度。接受完样品后应立刻检测样品，最好不要超过24h。或者经过实验室工作人员一起商议决定检测时间。对于特别容易腐败的样品（如贝类），抽样后应在24h内进行检测，其他易腐败样品（如鱼肉、生牛奶），检测时间应在抽样后36h内进行。如果上述检测时间时限因各种原因无法实现时，样品应冷冻置于-15℃以下，最好-18℃以下保存，使样品中所要检测的目标微生物尽量不要受到损害，并将这种因检测时限造成的影响降到最低。三、样品储存样品储存的外界条件应满足使样品内现有的微生物的数量和种类引起变化的可能性降至最低。建议各类样品的储存温度如下：（1）固体样品：样品周围温度为18℃~27℃。（2）冷冻或深度冷冻样品：样品周围温度为-15℃以下，最好是-18℃以下。冷冻食品应在45℃以下不超过15min，或2℃~5℃不超过18h解冻后进行检测。（3）其他非固态（包括易腐样品）：样品周围温度3℃±2℃。（4）拭子取样型样品：参见ISO 18593《食品与动物饲料的微生物学 用接触板和抹布对表面取样的水平方法》和ISO 17604《食品与动物饲料的微生物学 微生物分析用胴体取样》。样品周围温度应在1℃~4℃。实验室应尽快进行检测，时间不要超过24h。四、验余样品验余样品要放置在样品初始状态的温度下保存。检验结果报告后，被检样品才能处理。检出致病菌的样品必须要经过无害化处理。检验结果报告后，剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检。

冻干粉针基本存在的现象如下：现象一：含水量超标冻干粉针剂质量标准中规定的含水量较低。造成其含水量超过标准的主要原因是：装入容器的药液过多，药液层过厚；干燥过程中供热不足，使其蒸发量减少；真空度不够，水蒸气不能顺利排出；冷凝室温度偏高，不能有效地将水蒸气捕集下来；冻干时间较短；真空干燥箱的空气湿度高；出箱时制品温度低于室温而出现制品吸湿等。措施：生产人员须针对不同原因采取相应的解决方法。如按药液体积调整西林瓶规格，减少装液厚度，一般应控制在10~15mm；加强热量供给，促进水分蒸发；检查真空度不高的原因，排除泄漏点或真空系统的异常；降低冷凝器温度在-60℃以下；重新试制冻干曲线，确保冻干制品含水量合格；对放入箱内的气体要进行除菌及脱水干燥处理，尤其是易吸潮的制品更要注意；制品出箱时的温度要略高于生产环境温度。现象二：喷瓶喷瓶是由于预冻时温度没有达到制品共熔点以下，制品冻结不实；或升华干燥时升温过快，局部过热，部分制品溶化成液体，在高真空度条件下，少量液体从已干燥固体表面穿过孔隙喷出而形成。措施：为了防止喷瓶，应严格控制预冻温度在共熔点以下10℃~20℃，并保持2小时以上，使药品冻实后再升温。同时升华干燥时的供热量要控制好，适当放慢升温速度，且控制温度不超过共熔点。这样可以克服喷瓶现象。现象三：外观不合格冻干粉针的正常外观应是颜色均匀，孔隙致密，保持冻干前的体积、形状基本不变，形成块状或海绵状团块结构。但是，如果溶液重量浓度大于30%，则制品易出现萎缩、塌陷、不饱满的情况。另外，干燥时冻结的表面最/先脱水形成结构致密的干燥外壳，下面升华的水蒸气从已干燥表层的分子之间的间隙逸出。这时如果溶液浓度太高，分子之间的间隙小、通气性差，水蒸气穿过阻力较大，大量水分子来不及逸出，在干燥层停滞时间长，使部分已干燥药物逐渐潮解，会使制品体积收缩，外形不饱满或塌陷。如果药液重量浓度低于4%，在抽真空时，药物会随水蒸气一起飞散；或在干燥后变成绒毛状的松散结构，在解除真空后，这种结构的物质会消散，使制品成空洞状。还有一种情况是药液浓度太低，使制品疏松易引湿，同时由于比表面积过大，使制品容易萎缩，干燥的成品机械强度过低，一经振动即分散成粉末而粘附于瓶壁。在冻干工艺方面，如果药液厚度大于20mm，干燥时间延长，也会造成产品外观不合格。另外，在开始冻结时降温速度快，使制品形成细结晶，密度大，升华受到阻力较大，水分不易蒸发掉，制品会逐渐潮解致使体积收缩而造成外形不饱满或形成团状。如果冻结速度过慢，冰晶成长时间较长，则易发生浓缩，致使药物与溶剂分离、成品结构不均匀。措施：合理设计冻干溶液的配方。一般重量浓度在4%~25%之间为宜，最佳浓度在10%~15%。若浓度低于4%，可适当添加赋形剂(如甘露醇、右旋糖酐、乳糖等)。若浓度较高时，则必须控制冻干制品厚度，或降低浓度，改用大的容器灌装药液。冻干过程中降温速度应控制在每小时降低5℃~6℃。在一期升华干燥阶段，制品温度应低于共熔点，升温不宜快，控制在每小时5℃左右。如果加热过快，在制品有大量水分时，温度超过其共熔点，就会导致制品溶化，外观出现缺陷。在二期升华阶段，虽然此时制品中含水量已较低，升温速度可以适当提高，但要将温度控制在安全温度以下，否则会有结块。另外，制品包装的气密性不好，在有效期内也会出现外观不合格甚至内在质量不合格。现象四：制品冷爆脱底其主要原因是预冻阶段没有将制品冻结实。如果在制品尚没有完全冻结实的情况下，系统就开始对箱体抽真空，这样当压力达到某一数值时，尚没有冻结好的部分就开始蒸发沸腾，产生放热现象，而其本身温度急剧下降，到达共晶点温度时，产品冻结，随之开始出现爆瓶脱底现象。随着压力的继续下降，温度也相应下降。一般冻干机的真空泵能达到0.1毫巴以下，这就是说箱内的药品温度达到-40℃左右。由于西林瓶底与下部的板层没有以上的蒸发冷冻特性，故在短时间内西林瓶承受不了如此大的温度差而导致西林瓶冷爆脱底。措施：解决冷爆脱底问题需要生产人员严格执行预冻参数，确认将制品冻结实后再抽真空。