化学试剂变质的原因和措施 1试剂变质的原因引发和促使化学试剂发生变化的原因，大致可归纳如下。1、挥发2、 升华3、 潮解4、风化5、浓缩和析晶6、水解7、分解8、氧化和还原9、非氧化——还原反应10、 聚合和缩合11、 光化学反应12、霉变 2如何预防化学试剂变质a. 密封这是最普遍通用的方法。试剂瓶的材料和密封程度应根据试剂性质而定。如：强腐蚀的“三酸”和液溴，可用带磨口玻璃的试剂瓶，或是有塑料衬垫的螺旋盖的玻璃瓶，氢氟酸则应密封贮藏在银制或塑料制容器内，等等。密封适用于易挥发、升华、潮解、稀释、风化、水解和氧化还原、霉变的所有化学试剂对于极易 分解产生气体的试剂，远慕提醒，一般不完/全密封，要适当留有余地，否则可能使容器破裂。除了一般密封外，可再加蜡封，或用自制硝罗酊封口，如：三氯化铝、五氧化二磷等。 b.隔离能和空气、水作用的试剂，如：很活泼的金属和非金属应隔离存放在对试剂相对而言稳定的液体或惰气之中，钾、钠、钙浸没在机油中，黄磷则浸没在水中贮放。这种隔离方法也称液封法，前者叫油封，后者叫水封。远慕提醒，水封存也可使某些容易挥发的试剂减少损耗。如：在装有液态溴、二硫化碳的试剂中加一薄层水，就能大大减少挥发损失和空气污染。实验室中无机、有机试剂种类繁多，性质各异，应注意合理分类存放。有机物、无机物分开，普通药品和危险的分开，氧化剂和易燃物、还原剂分解、易挥发性酸和碱分开。做到这几个分开，一可避免药品间的不良影响，二则即使有意外事故发生，也能免除药品的相互作用，而产生更大的隐患。 c. 避光通常采用遮光性能较好的深棕色试剂瓶。将试剂放在暗处或遮光的专用试剂柜中。也可用照相纸的黑色厚纸包裹试剂瓶，如：浓硝酸、碘化钾、碘/化钠、氯/化汞的贮存就是如此 d. 低温普通挥发性试剂常放置在阴冷处，如：浓硝酸、浓盐酸、氨水等。某些特殊的生化试剂则要贮放在水箱或冰箱之中，如：酶试剂等。 e. 通风尽管装化学试剂的容器一般都处于密封状态，但也难免有跑、冒、漏、泄发生，在夏季高温天气，更易形成爆炸性混合气体，因此，贮藏室必须通风良好，应安装专用排风扇，并经常开启，使空气流通。 f. 适时这是根据某些试剂的特性，特别是一些极易变质失效的试剂应采取适当措施，应做到适时配制、适时使用和及时处理。如：极易氧化的氢硫酸溶液、氯水、溴水、碘水最/好适时制备及时使用；做银镜反应的硝酸银溶液、氨水、乙醛溶液配好后，应及时使用才不致影响效果；硫酸亚铁溶液配好后应加些还原铁粉才能使其不被氧化；淀粉、蔗糖、蛋白质的溶液在使用后应及时清洗试剂瓶，以防霉变。

根据其材质的不同总体可以分为塑料和玻璃的，塑料的离心管用的较多，又可以分为PP、PC、PS等，根据不同需要，生产厂家会选择不同的塑料材料来进行制作。根据其大小，又分为1.5mL、2mL、5mL、10mL、15mL、50mL等，国产的离心管一般就是这几个规格，用的较多的也就是10mL和50mL的。如果您的离心机是配30mL或者其他规格的离心管时，就要考虑进口的了。另外，离心管还有圆底和尖底，以及螺旋盖和插盖之分。螺旋盖的离心管带有较精细的刻度，插盖的只有一个总体的容量标示。实验室常用的离心管有塑料的和玻璃的，一般塑料的用的较多，因为玻璃的离心管不能用在高速或者超速离心机上。塑料的离心管又有PP（聚丙烯）、PC (聚碳酸酯)，PE (聚乙/烯)等材质。PP的管子性能相对来说比较好。塑料的离心管透明或者半透明，可以直观的看到样品离心情况，但是比较容易变形，抗有机溶剂的腐蚀性较差，所以使用寿命较短。因此，实验室一般会经常购买离心管。下面远慕就对各种材质分别介绍一下。PP（聚丙烯）：半透明，化学及温度稳定性较好，但是在低温下会变脆，所以在离心时不要在4℃以下。PC (聚碳酸酯)：透明度较好，硬度大，可以高温消毒，但不耐强酸强碱以及一些有机溶剂如酒精之类。主要用于5万转以上的超高速离心。PE（聚乙/烯）：不透明。和丙酮、醋酸、盐酸等不反应，较为稳定，高温下容易变软。PA（聚酰胺）：这种材质是PP和PE材质的聚合物，半透明，化学性质非常稳定，单不耐高温。PS（聚苯乙/烯）：透明，硬度大，对大多数的水溶液稳定，但是会被多种有机物腐蚀，多用于低速离心，而且一般是一次性使用。PF（聚氟）：半透明，可以低温使用，如果是-100℃-140℃下的实验环境，就可以用这种材质的离心管。CAB（醋酸丁酯纤维素）：透明，可用于较稀的酸、碱、盐，以及酒精、蔗糖的梯度测定。

 内标法是结合了峰面积归一法和外标法的优点的一种方法，它在加入内标物后，按峰面积归一法的分析方法进行分析，这就避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差。因而，它的分析精密度也是比较高的，是一种比较理想的定量分析方法。内标法的优缺点内标法对进样量不严格要求，测定的结果也较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了进样量、仪器不稳定等变化所引起的误差，只对欲分析的组分峰做校正。不过内标法必须加一个组分进到样品，易增加面积测量误差。操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。内标物的选择原则采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的已知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化合物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。对于内标法定量分析来说，内标物的选择必须满足如下的条件：1、内标物与被分析物质的物理化学性质要相似（如：沸点、极性、化学结构等）；2、内标物应是该试样中不存在的纯物质；3、它必须完全溶于被测样品（或溶剂）中，且不与被测样品起化学反应；并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；4、能加入内标物的量应接近于被测组分；5、色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。且又不共溢出，目的是为了避免仪器的不稳定性所造成的灵敏度的差异；6、选择合适的内标物加入量，使得内标物和被分析物质二者峰面积的匹配性大于75%，以免由于它们处在不同响应值区域而导致的灵敏度偏差。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，可以使用在这过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。内标法的操作将已知量的内标样加入标准样品，制成混合标样，并配制一系列的已知浓度的工作标样。混合标样中标样与内标样的摩尔比不变。注入色谱柱，以（标样峰面积/内标样峰面积）为响应值。根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。将已知量的内标样加入未知样品，注入色谱柱，得到欲测组分的响应值。根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。制作内标标准曲线在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。远慕小结：内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 

 液相操作中，有一些小细节上的误操作在精益求精的实验室人看来是要尽可能避免的，细节虽小，影响很大。远慕生物这就带各位小伙伴们看一看，这些错误你们有犯过吗？犯过不怕，记得改正哦~加入有机相之后再测量流动相的PH值作为液相色谱的基础，流动相的各项参数是保障实验质量的重中之重，特别是PH值。通常情况下对流动相PH值的测量是测量水相中的PH值参数，而在加入有机相后PH测量的PH值是会产生误差的。因为每一次加入的有机相并不能保证完全的同质同量，从而影响实验的准确度。测量流动相的PH值，是测量水相中的PH值参数。有机相加入之后PH值参数的测量就和之前有误差。缓冲盐使用不当在流动相中，加入缓冲盐可以控制和修正流动相中的PH值变化。样品的机制，空气中的CO2等气体以及水中的杂质都能够造成流动相PH值变化进而影响样品的保留、峰形、峰面积参数。而每一种缓冲盐都只能在一定的PH值范围内提供了最佳的pH稳定性。而在这个范围外，该缓冲盐在抵抗pH值变化方面是无效的。所以需要在流动相中加入合适的缓冲盐，要么在正确的范围内使用缓冲盐，要么选择一个能够完全覆盖所需pH值的缓冲盐。最后，缓冲盐的添加也是具有一定的要求的，如果将水相的缓冲溶液加入到有机相中，会大大增加缓冲盐析出的风险。缓冲盐的析出在初期可能并不明显，但会对仪器的各个部件都会产生一定影响。长此以往不仅会导致实验结果不准确，更会有可能导致仪器损伤甚至损坏。直接用纯有机溶剂冲系统如果之前的方法在B通道使用缓冲溶液，而这次没有经过调查就直接在B通道使用了纯的有机溶剂，那么就会造成该通道缓冲盐析出、出现堵塞等风险。仅使用超声来给流动相脱气超声脱气有一定的脱气作用，但完全脱气的效果并不理想。所以在此建议使用真空脱气机进行在线脱气。梯度洗脱时从流动相比例从0%开始现在的液相色谱能够非常高效的进行在线脱气和流动相混合。但是将梯度洗脱比例从0%开始，会有比较大的出现气泡和沉淀的风险。

　　做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很苦逼的，1 个月做 100 个克隆那都是 小 case，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较稀有的基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面远慕生物和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人！　　1. 准备工作　　俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。 推荐两个工具，一个是 oligo 软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是 DNAstar 软件，工具极强大，一款全面的生物医学软件，用作 DNA 和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。　　2. 设计引物　　1) 注重要：看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来 结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1 质粒，注意阅读框，要是移码了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！　　其他需要注意：　　*设计酶切位点时要加保护碱基（大家要用 T 载体就当我没说）;　　*酶切位点设计原则：尽量用粘性末端，实在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算 TM 值的时候要减去这些不匹配的序列；　　*注意 KOZAK 序列的问题，很多质粒没有提供 KOZAK 序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。　　*擅用 Gene Overlap，比方说加个 flag 标签，his 标签，my 标签之类的，直接设计三引物 overlap 一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（两步法），尤其是对 GC 比高的序列，有时候引物不长 PCR 根本不出结果，注意如果 GC 比较高，这个时候 Gene Overlap 就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。　　*没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧。　　3. PCR 扩增　　如果没有现成的质粒可供酶切，PCR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可选择的 PCR 酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的 taq 酶都能满足需求。但如果遇到难 PCR 的高 GC 基因，可以换不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，实在不行可以考虑 Clontech 的 2 GC rich kit，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化 PCR 产物， 去除一些非特异性条带。　　4. 酶切　　强烈推荐 NEB 的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用 NEB 的酶，切个七十二小时仍旧一切 OK，尤其现在 NEB 还推出了 HF 的内切酶，没有星活性而且统一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也还可以。　　5. 连接　　常用的是 NEB 的 T4 连接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反复冻融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分装，10uL/管，一次性使用。　　载体总量：一般来说，载体浓度在 20-100ng/uL 较好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从 50-100ng 就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用 10-15uL。　　载体和插入片段比例：载体和插入片段比例一般是 1:7，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高片段浓度，同时加大比例 1:10。　　6. 转化　　按照 SOP 做就行，话说实验室原来从 takara 买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高（protocol 免费索取）。要注意的是 LB 必须无菌而且没有抗生素。　　7. 鉴定　　想要快速鉴定，建议用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定讲究的，很多人做菌液 PCR 鉴定假阳性特多，为什么？因为你 PCR 引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR 方法鉴定是极其准确的，数百次菌液 PCR 经验。PCR 鉴定做起来也很简单， 拿个 2mL tube，装 0.5mL 加入相应抗生素的 LB，摇个三小时左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不错，效果一样。　　8. 测序　　拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。

　　首先，TA 克隆是用于 PCR 产物的克隆和测序。原理是利用 Taq 酶能够在 PCR 产物的 3’末端 加上一个非模板依赖的 A，而 T 载体是一种带有 3’T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中。　　那么在你做 TA 克隆时，需要准备的前期工作是什么呢？　　1 、设计引物 P 出你的目的基因　　不管你是手动设计还是软件设计或是直接引用别人已经发表文章用到的引物，只要能 P 出 来目的片段就行，在 PCR 的结果中需要注重 P 出来的浓度，要达到浓度高的要求一方面是在前期的样本准备本身就得到高浓度。　　比如要 P 出一种病毒的某部分基因，那么在病毒的 RNA 提取时，就必须保证该病毒的病变效果明显，才有可能得到高浓度的 RNA，继而或者逆转录得到高浓度的 cDNA。　　另一方面是在 PCR 的条件时对于退火温度等的条件把握，如果有一些引物二聚体存在，那么可以尝试提高退火温度，延长一点延伸时间，但具体如何使得 PCR 跑出来又亮又单一，还是需要摸摸条件。　　2 、切胶回收产物　　在紫外仪下切下目的产物，注意一定要快准狠，尽快切下，并尽可能少的切下多余的胶，回收利用的试剂盒一般严格按照试剂盒操作应该没有什么问题。回收之后测浓度，准备下一步。　　3 、连接　　这一步骤就直接按照选择的 T 载体说明书来操作了，需要注意的是，在上一步测完回收浓度后，如果浓度较低，建议在试剂加量上尽量加大 DNA 的用量。　　一般来说回收之后就赶紧地进行连接，但是由于有时候可能中间时间耽误了，没能及时连接， 那么在这之前可以补加两个步骤，一是加 A 尾，二是纯化回收的产物。　　但是在长期的尝试中，我发现纯化与否和手动加 A 尾并不怎么影响连接效果。　　4 、转化铺板　　这个步骤用来筛选重组子，长出来的菌多不是好事，菌少也不是坏事，也许就只长两个单克隆菌，但这两个都是阳性重组子，反正只要挑到正确的就行。　　5 、菌液 PCR 鉴定　　一般挑菌之后在 EP 管中摇个 3 到 5 个小时就可以进行菌液 PCR 了，一般来说这样的摇菌时间能最保证接近真实的阳性结果，菌液 PCR 之前有人建议说要煮沸几分钟再 P，但其实直接取摇菌的 1ul 作为模板，进行 PCR 就可以了，条件与之前 P 产物的条件一致。　　6 、酶切鉴定　　酶切位点的选择必须要确保目的基因中没有这个位点，而载体与目的基因连接附近有位点。在进行酶切的时候是要摸酶切时间的，是否已经切开跑一个电泳看看。　　7 、测序鉴定　　如果实在是觉得上面两个鉴定都拿不准，那也可以尝试测序，如果测序结果与目的基因能够完全比对匹配上，那么也说明就是连接上了。　　其实 TA 克隆是非常简单的克隆，先天的条件 A 和 T 都已经具备了，除非你手实在不顺，连个 2500bp 以下的都是没什么问题的。

　　近年来，细菌感染性疾病严重威胁着人类的健康，抗生素的合理使用是治疗和控制此类疾病的有效手段，抗生素体外药敏试验结果的正确与否对抗生素的选择至关重要，药敏试验的结果受到诸多因素的影响，如培养基、试纸片以及菌液的浓度等。　　1、培养基　　细菌药敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO组织统一要求的M-H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此进行的药敏试验效果较好。此外，还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到触媒的作用。但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加5％羊血的巧克力M-H琼脂；肺炎链球菌的药敏实验用M-H琼脂加5％的脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。　　细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca2+、Mg2+等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。　　2、试纸片　　试纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对药物保存无太大影响。然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的试纸片药物有较大的影响。药敏纸片的PH值一般要求为中性，这样才适合药的活度。药敏纸片的厚度要求大约1mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏纸片的直径在6.00～6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。　　含药纸片的片间差和质量好坏是做药敏试验的关键。一些药敏纸片买来时就有抑菌环偏大或偏小的问题，纸片之间又存在很大的片间差。因此，纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意纸片的保存，因为有的纸片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。因此，纸片应放低温下(-10℃)保存，同时要避免潮湿，以保持抗菌药物的活性。盛纸片小瓶自低温处取出应在室温平衡至少10min后再打开，避免冷凝水影响药效。　　3、细菌　　由于各种菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果菌种不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1．5亿/ml左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，来确定菌液浓度。国家细菌耐药性监测网的三级甲等医院，其微生物实验室大多数用此法来确定药敏试验的菌液浓度。　　药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴药敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时，每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口，避免药敏纸片之间相互混淆，以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根据一种药物抑菌圈的有无或者大小，只能判断出该药对细菌有没有效果，但其敏感性的高低需要通过科学严谨的实验来确定。药物的敏感程度需要根据药敏试验的结果，并结合以上因素做综合分析，才能得出科学的结论，而片面地根据药敏圈的大小来决定敏感与否，结果不够准确。　　综上所述，造成药敏试验的结果可能与实际效果不符，对药敏试验要具体情况进行相应的分析，再根据药物的代谢过程和原理综合论证，药敏试验的指导意义还是很大的。而且上述因素并不是在我们临床做药敏试验过程中都能遇到，对此，我们需要认真执行标准化的试验方法，认真执行CLSI质控要求，做好室内质控与室间质评，以提高试验的准确性。严格控制药敏试验用培养基和药敏纸片，做到保证质量。

　　（一）原 理　　DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。　　细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。　　分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。　　当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。　　DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。　　大分子DNA的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。　　生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷冻保存。　　DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。　　（二）试剂及器材　　（1） 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液：称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 · 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1 000ml。　　（2） 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1 000ml。　　（3） 5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。　　（4） 氯仿– 异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。　　（5） pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/L Tris–HCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。　　（6） 95％（V/V）乙醇1 000ml。　　（7） 75％（V/V）乙醇1 000ml。　　（8） 组织捣碎机。　　（9） 玻璃匀浆器。　　（10） 冷冻离心机。　　（11） 冰、粗盐。　　（三）操作　　（1） 本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验前应将兔饥饿24h以上，以避免糖原的干扰。　　（2） 用烧杯（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。　　（3） 将经过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约10g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。　　（4） 将洗净的组织剪成碎块。先加入20m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次，使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol–L柠檬酸钠溶液至50ml。　　（5） 匀浆液在4℃ 6 000r／min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作2～3次，尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀。　　（6） 将沉淀物（约5m1）悬浮于5倍体积的pH8.0，0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2溶液中，搅匀，而后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最终浓度达1%为止（应加多少毫升?），此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做，然后，加入固体NaCl使最终浓度达l mol/L。继续搅拌30～45min，以确保NaCl全部溶解，此时可见溶液由稠变稀薄。　　（7） 将上述混合溶液倒于一个300ml的带塞三角瓶中，加入等体积的氯仿– 异戊醇，振荡10min。在室温3 000r/min离心10min（为什么可以在室温操作?），此时可见离心液分为3层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿– 异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入三角瓶中，向水相中，再加入等体积氯仿– 异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提2–3次，除净蛋白质。　　（8） 最后1次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），记录体积，放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，并能逐步缠绕于玻璃棒上，此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。　　（9） 将所得的DNA从玻璃棒上取下，用75%乙醇洗2次，置于干燥器中抽干，称取重量，计算产率。　　（10） 按200μg/ml的浓度称取一定量DNA，溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE缓冲液中（干燥DNA不易溶解，应在测定前几天预先溶解）。

　　溶菌酶,全称为1,4-β-N-溶菌酶,又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,属于α-乳白蛋白家族。人们对溶菌酶的研究始于上世纪初,英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶；此后人们在微生物、植物、无脊椎动物和高等动物中也发现了溶菌酶的存在。其中鸡蛋清溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛。另外随着基因工程技术的发展，通过人工合成基因，用微生物发酵生产人溶菌酶的研究也正在深入进行之中。　　鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白,单一肽链，分子量为14388，分子内含有4对二硫键。由于其含的碱性氨基酸残基比酸性氨基酸残基多，所以它的等电点高达11左右，等电点约为10.5~11，zui适温度为50℃，zui适pH为6~7左右。鸡蛋清中的溶菌酶的含量约占蛋白质总量的3.4%~3.5%。　　溶菌酶既是药品又是保健品，还是生化药物中理想的药物酶，国外已经开始利用于药物制剂、食品和饮料的添加剂、生化试剂和医学诊断剂等。溶菌酶在医药、食品防腐和生物工程中应用非常广泛。溶菌酶是一种糖苷水解酶，具抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等多种药理作用，临床上常用于五官科各种炎症、扁平疣、传染性软疣、寻常性疣等各种皮肤病的治疗，还可用于预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎和急性肝炎的效果较为显著。另外人体溶菌酶还可作为多种疾病的诊断指标。　　实验试剂　　固体硫酸铵；10%硫酸铵；1mol/L HCl；1mol/L NaOH； 聚乙二醇；0.15mol/L pH 6.5的磷酸缓冲液；0.1mol/L HCl；0.025mol/L KCl-0.1mol/L HAc；30% Acr/Bis；10% SDS；1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)；0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)；TEMED；10%过硫酸铵；5*Tris-Gly(pH=8.3)电泳缓冲液；2*样品处理液；染色液；脱色液　　实验设备　　精密pH试纸；布氏漏斗；磁力搅拌器；离心机；透析袋；玻璃层析柱Bio-Rad层析系统；Bio-Rad垂直电泳系统　　实验材料　　新鲜鸡蛋若干只；724型酸性阳离子交换树脂；Sephadex G-50 ；蓝色葡聚糖-2000　　实验步骤　　1 实验方法与步骤：　　本实验主要采用了724型酸性阳离子树脂交换吸附，（NH4）2SO4盐析、ph调节等电点去除杂蛋白，凝胶层吸分离纯化，zui后用SDS-PAGE鉴定纯化产物等方法。　　1.1 溶菌酶的制备　　以蛋清为原料制备溶菌酶，采用树脂吸附法提取溶菌酶。因溶菌酶为碱性蛋白，在近中性环境中被阳离子交换树脂所吸附。利用该性质，可将它与鸡蛋中其他蛋白分离，然后再经（NH4）2SO4盐析、pH调节等电点去除杂蛋白纯化处理，所得到的溶菌酶即可结晶。　　1、用1mol/L HCl浸泡树脂2h，用去离子水洗至近中性；　　2、用1mol/L NaOH浸泡树脂2h, 用去离子水洗至近中性；　　3、用0.15mol/L pH=6.5的磷酸缓冲液浸泡过夜，滤后备用；　　4、将2-3枚新鲜的鸡蛋洗净，空干水，敲破鸡蛋小头，再在大头打一小孔进气，收集蛋清；　　5、用灭菌的纱布过滤蛋清，称量重量，置4℃冰箱预冷1h以上；　　6、在不断搅拌下，将蛋清加入处理好的树脂中（取相当于蛋清1/4重量的树脂）；　　7、大力搅拌（冰浴中）吸附2.5h，4℃静置；　　8、次日，3000rpm离心15min，收集树脂，回收蛋清；　　9、树脂先用去离子水洗至洗液无混浊；　　10、再用等体积的0.15mol/L pH6.5的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min(冰浴中)，重复处理1次，zui后一次滤除树脂水分；　　11、树脂用等体积10%的（NH4）2SO4浸泡，搅拌洗脱，每次搅拌30min，抽干，收集洗脱液。再重复洗脱一次，合并洗脱液；　　12、每83mL洗脱液中加32g磨细的固体（NH4）2SO4，在搅拌下缓慢加入，待（NH4）2SO4完全溶解后，4℃放置过夜；　　13、次日，1000rpm离心15min，收集沉淀；　　14、将上述沉淀用1mL蒸馏水分两次洗下，装入透析袋中；　　15、置于4℃冰箱，用蒸馏水透析24h以上，其间多次换水；　　16、取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl调整pH至4.6，离心，收集上清液；　　17、其沉淀加少量蒸馏水搅拌；　　18、用1mol/L NaOH调整pH到5.5，离心，弃沉淀，收集纯化液；　　19、将纯化液装入透析袋，用研细的聚乙二醇脱水浓缩；　　1.2凝胶层析分离溶菌酶　　凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。　　对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子zui后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离目的。　　20、用1mol/L NaOH调整pH到5.5，离心，弃沉淀，收集纯化液；　　21、将纯化液装入透析袋，用研细的聚乙二醇脱水浓缩；　　22、取一定量的Sephadex G-50于250mL烧杯中加入洗脱液120mL，置于室温溶胀2-3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去处凝胶空隙中的空气；　　23、取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上，在距柱上端约3cm处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降低至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水，读出的体积即为柱床体积Vt；　　24、在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1-2cm高度后打开出水口，流速一般用3-6mL/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1-2倍柱床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定；　　25、吸取柱上端的洗脱液（注意不要搅乱液面），打开出水口，使残余液体降至于胶面相切（足以不要干胶），关闭出水口，用细滴管吸取0.5mL（2mg/mL）蓝色葡聚糖-2000，小心的绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口，等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用3mL/10min的速度开始洗脱。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度zui高点的洗脱液体积即为外水体积。蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（1-2倍柱床体积）继续平衡一段时间；　　26、按22的操作方法加入溶菌酶样品溶液（0.5-1mL），以5min收集1.5mL/管的速度洗脱并收集洗脱液；　　27、用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，进行洗脱，记录仪记录实验时检测到的洗脱液在A280处的吸光值，直接描绘出洗脱曲线。合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液，-20℃保存备用；　　1.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离产物　　SDS聚丙烯酰胺凝胶采用不连续缓冲系统，利用浓缩胶和分离胶浓度不同从而使分子量大小不同的蛋白质得以筛选。　　SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度，凝胶的筛分特性取决于它的孔径，反过来孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺浓度的函数。　　28、确定所需凝胶溶液的体积，配置一定体积的分离胶溶液；　　29、迅速在两玻璃板间的空隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子的齿长再加0.5）。再在胶液面上面小心的注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液；　　30、分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸洗尽残留水；　　31、配制浓缩胶，在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，将凝胶垂直放在室温下；　　32、在等待浓缩胶聚合时，可对溶菌酶样品进行处理，在样品中按1：1体积比加入样品处理液，在100℃加热5min后置于冰上，12000rpm离心3min，取10uL上清点样；　　33、待浓缩胶聚合完全后，小心取出梳子，把凝胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-Gly电极缓冲液；　　34、将电泳装置与电源相接，调节电压为200V，电泳直至溴酚兰到达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源；　　35、从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板，必要时可切角作标记；　　36、用染色液体对胶进行染色1-2h；　　37、用脱色液对胶脱色1h，必要时更换多次脱色液至背景清楚，条带清晰；　　38、脱色后，可以将凝胶浸入水中保存，或对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥擦成胶片；　　39、测量并计算溶菌酶分子量。　　注意事项　　要注意的具体事项和解决的问题很多，下面按照实验步骤顺序加以汇总：　　第3步：磷酸缓冲液浸泡过夜时，大烧杯应加盖手套，可以防止蒸发。　　第5步：纱布过滤前，先用玻璃棒搅匀蛋清，可以节省过滤时间。　　第6步：树脂要先经布氏漏斗抽滤处理，得到干树脂加入蛋清。　　第11、12步：直接合并洗脱液，测量体积，不要过滤。　　第17-19步：去除杂蛋白时，pH测量要准确，调节要精细，因为多个收集管合并后，会因pH差异造成沉淀并产生不必要的电荷差异。　　第23步：A)层析系统管道要用洗脱液先润洗1-2遍。　　B)洗脱液上柱前先要减压抽气，并提前准备。　　C)加入洗脱液后，要随时观察液面变化，防止干胶。　　第25步：溶菌酶上样时，吸取洗脱液到凝胶面处于干湿之间为。　　第26步：层析系统使用完毕，管道用20%的乙醇溶液润洗干净，日后备用。　　第34步：电泳完毕，剥胶时可切一角作标记。　　其他方面：　　1.去除杂蛋白，调节pH至5.5时，NaOH使用0.1mol/L，这样调节起来比较精细，不会产生较大的pH波动。　　2.利用凝胶上样平衡的1-2小时里，校正收集管体积，即调节Fix Size,如使1.55ml=1.00ml。　　3.收集洗脱液时，可以每管1.5-2.0ml，以便于在紫外分光光度计上测量。（补充：如果要缩短洗脱时间，可以每管小于1ml，搜集完毕后从各管吸取250μl到96孔板中，用酶标仪一次测量完毕。）

　　1mg或是几mg的标准品怎么称量?有人说，要用百万分之一天平，用十万分之一的达不到要求，误差太大。还有人说，在称几个mg的标准品时，最好还是用减量法称量，减量法会更准确。但是，少量标准品一般用分析天平称好溶解后，再一步步稀释得到，而不用一步称到位，再溶解。我们都知道，有些标准品非常昂贵，厂商只能以非常小的包装提供给客户，如1mg\5mg\10mg等，所以，如何高效称量，需要好好判断好再行动哦。　　标准品的分级　　国际标准化委员会将标准品(参考物)的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质，并将其分成三级。　　⒈一级标准品一级标准品(原级参考物)是已经确定的稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量。它可用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为“二级标准品”定值。一级标准品都有证书，在美国由国家标准局(NBS)发给合格证书，并指明它的性质和有关数据。　　⒉二级标准品二级标准品(次级标准品)或是纯溶液(水或有机溶剂的溶液)，或存在于相似基质中。这类标准品可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定，主要用于常规方法的标化或为控制物定值。　　⒊控制物控制物有冻干的或溶液，可以用适当的标准品(一级或二级)以参考方法定值，用于质量控制，不用于标化(除经准确定值者)。　　标准品相关定义　　参考值：该值为标准样品研制单位提出，但未经验证或只确定的数值。　　不确定度：测定结果表达式中说明数值范围的那一部分，表示真值以给定的概率落在此范围内。　　不确定度的含义是指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度。反过来，也表明该结果的可信赖程度。它是测量结果质量的指标。不确定度愈小，所述结果与被测量的真值愈接近，质量越高，水平越高，其使用价值越高;不确定度越大，测量结果的质量越低，水平越低，其使用价值也越低。　　准确度：测定值和真值之间的符合程度。　　标准品称量方法　　请根据您需要称量的重量和容许误差选择合适的天平。如称量少于10mg的产品，建议使用十万分之一的分析天平。在购买产品时也请注意产品的重量能否满足您的需求。一般采用增量法或减量法进行称量，以下是一些建议供您参考：　　a.称量前：建议将产品直立放置一段时间，使产品全部集中至底部，便于取用。尤其是粘稠状物质，可以倾斜至与竖直方向呈45度，使产品集中在瓶底边缘。如果当心瓶盖上有粘附，可以在未打开瓶盖前甩动瓶身，使产品集中至瓶底。　　b.粉末或晶体：建议采用增量法称量，准备合适的干燥容器，归零后将产品倾倒在容器内，得出容器中用于配制标准溶液的物质重量。　　c.粘稠状或液体：建议采用减量法称量，先称量原产品连瓶一起的重量，再用适当器具移取所需样品至配制容器中，称量移取后的产品连瓶重量，其差值为实际用于配制标准溶液的重量。　　d.如果瓶盖上粘有物质，可以在减量法称量时连瓶盖一起称量，移取产品时注意使用干燥的器具。　　瓶内少量标准品的称量和溶解　　请根据已有的方法或者物质的相关理化性质选择合适溶剂。不适当的溶剂可能造成无法溶解或者产品降解。　　1.当样品量非常少时，如何从瓶子中获取所有的纯物质呢?有些标准品非常昂贵，厂商只能以非常小的包装提供给客户，如1mg\5mg\10mg等，拿到产品时可能会觉得瓶子是空的，这种情况是由于粉末状的物质会分散在瓶壁和盖子上，而液体状物质会在瓶壁形成一层可能看不见的液层。可根据具体的实际情况，按照以下操作来获取瓶内所有产品：　　1、擦拭瓶外壁和盖子，等其晾干。　　2、称量整个瓶子，记录数据，精确至0.1mg。　　3、用合适的溶剂将瓶内的产品转移到容量瓶中。荡洗瓶盖和瓶内壁数次并都转移到此容量瓶中。　　4、中等加热或者氮吹使瓶外壁和内壁干燥。　　5、在同一台天平上称量空瓶连盖的重量，精确至0.1mg。　　6、两次称量差值即为容量瓶内溶解的产品量。　　7、用溶剂定容至容量瓶刻度，即可计算所配溶液的浓度。　　2.能否直接将溶剂加入标准品的瓶子中进行溶解，再转移到容量瓶中定容?不能。一般除非特别指明，所有标准品厂商给出的产品质量和体积都不是精确数值，比如10mg的标准品，其瓶中的产品重量可能大于10mg，如10.5mg或11mg。如果产品的重量为精确数值，厂家一般会特别注明，如CDDD-SC494-10MG，其在证书中有说明。所以请务必先对产品进行称量，在标准曲线浓度计算中使用实际称量数值。　　注意事项　　产品的保质期：厂家的标签或分析证书上一般有保质期限，其含义是当产品未打开使用并按照厂家注明的条件进行保存时，厂家对产品的纯度与分析证书上的纯度的一致性负责。由于分析中会有一定的误差，所以产品的纯度一般有一个不确定度或误差范围。有一些产品，由于物质性质比较特殊，厂家对产品不标明具体的保质期限，而是保证在出厂或者客户收到产品的一定时间范围内有效，即在此时间限度内厂家对产品的纯度与分析证书上的纯度的一致性负责。　　产品打开使用后：产品打开使用后，纯品型的标准品，一般在适当储存条件下还是比较稳定的，厂家给出的产品保质期也是可以参考的，少数挥发性物质如乙醛等除外。而对于溶液型的标准品，建议客户打开后尽快使用，物质降解和溶剂挥发等原因都有可能对溶液的浓度产生影响。　　标准溶液的稳定性：对于购买的溶液型标准品和自己用纯品型配制的标准溶液，在初次使用后请在适当条件下保存。一段时间后如需再次使用，请通过与之前的数据对比对溶液的浓度进行确证再使用。

　　1.什么是pH标准缓冲溶液？它有哪些特点？　　pH缓冲溶液是一种能使pH值保持稳定的溶液。如果向这种溶液中加入少量的酸或碱，或者在溶液中的化学反应产生少量的酸或碱，以及将溶液适当稀释，这个溶液的pH值基本上稳定不变，这种能对抗少量酸碱或大或稀释，而使pH值不变化的溶液就称为缓冲溶液。　　pH标准缓冲液有以下特点：　　（1）标准溶液的pH值是已知的，并达到规定的准确度；　　（2）标准溶液的pH值有良好的复现性和稳定性，具有较大的缓冲容量，较小的稀释值和较小的温度系数；　　（3）溶液的制备方法简单；　　2.如何配制pH标准缓冲溶液？　　对于一般pH测量，可使用成套的pH组冲试剂（可配制250mL），配制溶液时，应使用去离子水，并预先煮沸15～30分钟，以除去溶解的二氧化碳。剪开塑料袋将试剂倒入烧杯中，用适量去离子水使之溶解，并冲洗包装袋，再倒入250mL容量瓶中，稀释至刻度，充分摇匀即可。　　3.如何正确保存和使用pH缓冲溶液？　　缓冲溶液配制后，应装在玻璃瓶或聚乙烯瓶中（碱性pH缓冲液，如，pH=9.18、pH=10.01、pH=12.46等，应装在聚乙烯瓶中）瓶盖严密盖紧，在冰箱中低温(5～10℃)保存，一般可使用六个月左右，如发现有混频器浊，发霉或沉淀现象，不能继续使用。使用时，应准备几个50mL的聚乙烯小瓶，将大瓶中的组冲溶液倒入小瓶中，并在环境温度下放置1～2个小时，等温度平衡后再使用。使用后不得再倒入大瓶中，以免污染，瓶中的缓冲溶液在＞10℃的环境条件下可以使用2～3天，一般pH=7.00、pH=6.86、pH=14.00三种溶液使用时间可以长一些，pH=9.18和pH=10.01溶液由于吸收空气中的二氧化碳，其pH值比较容易变化。　　4.pH缓冲溶液有何用途？　　（1）pH测量前标定校准pH计。　　（2）用以检定pH计的准确性，例如，用pH=6.86和pH=14.00，标定pH计后，将pH电极插入pH=9.18溶液中，检查仪器显示值和标准溶液的pH值是否一致。　　（3）在一般精度测量时检pH计是否需要重新标定。pH计标定并使用后也许会产生漂移或变化，因此在测试前将电极插入与被测溶液比较接近的标准缓冲液中，根据误差大小确定是否需要重新标定。　　（4）检测pH电极的性能。

　　一、无菌操作要求　　1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。　　2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间， 工作前经紫外线消毒后使用。　　3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。　　4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。　　5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。　　6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取 出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。　　7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆 的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。　　8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。　　二、无菌间使用要求　　1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌 间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7平方米的小窗，以备进入无菌间后传递物品。　　2、无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。　　3、无菌间使用前后应将门关紧， 打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。　　4、处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。　　5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。　　三、消毒灭菌要求　　微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。　　（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法　　1、灭菌前准备　　（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如 用金属筒应将上面通气孔打开。　　（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包 好。　　2、装放　　（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。　　（2）大型高压蒸气锅：：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能 过挤。　　3、设备检查　　（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。　　（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：　　①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水 量补足，水变混浊需更换）.　　②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。　　③盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气（水沸腾后排气10-15min）。　　④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。　　⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至 60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。　　（3）卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：　　①关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。　　② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。　　③待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定。　　④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。　　⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按 动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。　　5、灭菌温度与时间　　（1）干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。　　（2）压力蒸气灭菌 锅灭菌温度与时间。　　（二）间歇灭菌方法　　1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。　　（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。　　（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。　　（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。　　2、血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营 养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。　　（1）在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。　　（2）将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。　　3、煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2%石/炭酸煮沸5 min，加入0.02%甲醛，80℃煮60 min均可达到灭菌目的， 但选用 煮沸消毒的增消剂时， 应注意对物品的腐蚀性。　　4、灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。　　（1）物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。　　（2）取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。　　（3）培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。　　（4）启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。　　（5）取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无 菌物品使用。　　（6）取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。　　（7）凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。　　（8）每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。　　四、有毒有菌污物处理要求　　微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。　　1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。　　2、经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。　　3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石/炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。　　4、涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯 中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。　　5、打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石/炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。　　污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。　　五、培养基制备要求　　培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：　　1、根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药 品应进行质量检验。　　2、PH 测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基 PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可 影响一些培养基的 PH 降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基 的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。　　3、培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉 花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。　　4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。　　5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。　　6、每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养 基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。　　7、目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。　　8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。　　六、样品采集及处理要求　　1、所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。　　2、根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。　　3、采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤 酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。　　4、样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。　　5、检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。　　（1）样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。　　（2）瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。　　（3）按规定采样数量不足者。　　对送检符合要求的样品， 检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。　　6、样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。　　（1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。　　（2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml 灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。　　（3）瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。　　七、记录和报告的要求　　1、检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验， 检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。　　2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

　　微生物活性检测的技术原理是通过准确测量微生物细胞内的三磷酸腺苷（ATP）浓度，来判断微生物的活性。微生物细胞内的ATP和荧光酶混合后会反应发光，通过测量发光的亮度RLU来计算ATP浓度，然后再根据经验公式将ATP浓度转化为微生物浓度。　　微生物活性检测的几大影响要素分析：　　1.营养物质的比例　　B：N：P。另外还需要一些微量元素，如铁、锌、锰等。　　2.温度　　50-70℃；-5-0℃；是微生物无法适应，直接死亡的危险温度。处理污水的各类微生物适宜在20-35℃。　　在适宜的温度范围内，温度越高，微生物的活性越强，处理效果也越好；反之则相反。　　3.PH　　水解酸化微生物可在PH 3.5-10范围内生存，PH为：5.5-6.5。　　硝化微生物在PH 8-9范围内强，小于6.5要加碱；　　反硝化微生物在PH 8-9范围内能进行正常反应，在6.5-8的范围内，小于6.5时要加碱；　　除磷微生物在6.5-8内能正常进行，如小于6.5时要加碱。　　一般应将PH控制在6.5-8或6.5-9的范围内。　　微生物活性检测设备作为便携现场工具，可以协助运营人员快速诊断问题以及指导工艺调试。预警污泥膨胀以及检测附着状态下（mbbr，生物膜，生物滤池）的微生物活性，表征生物膜上、填料上微生物的生长情况。

标准品实际上就是大家所说的标准物品，它所充当的角色就是衡量标准，专门用做药物方面对照品的一种衡量标准，即为含量测定中的标准含量。标准品种类也是多式多样的，常见的有冶金标准品、化学计量标准品和药检标准品等。虽然标准品与对照品有一定的区别，但是标准品或对照品混用的现象是司空见惯的，这就带来了一定的麻烦。那么，为什么会出现标准品或对照品混用的情况呢?下面远慕生物来给大家简单分析一下其原因。为什么会出现标准品或对照品混用的情况呢：(1)卫生部提供的对照品使用说明书不够详尽，极其关键部分并没有做一个详尽的介绍，大多无对照品质量要求及标定方法，这就使得人们在使用标准品和对照品的时候出现了纰漏。(2)使用者们对标准品或者对照品，甚至是两者的正确使用方法知识相当的缺乏，正所谓要使用一个东西就必须对其有一个充分的了解，所以在不了解的情况下出现错误是情理之中的。(3)日常科研中极难找到相应的对照品，所以科研人员就只好用标准品代替对照品，久而久之大家就搞混了两者的区别。(4)中国药典正文中也常存在对照品混用的问题，如常将含量测定用的标准品或对照品用于溶出度检查，而含量测定方法与溶出度分析方法又不同，故极易引起混用。总而言之，上述所介绍的四点就是标准品和对照品常常出现混用情况的原因，希望大家在彻底了解了其相关原因之后，能够竭尽所能的改正自己常常犯的错误，在使用标准品或者对照品的时候，大家首先务必要认真检测自己是否拿错了，接着看看标准品和对照品的说明书，然后在正确将其投入使用中。

常见的规范品的保存办法有：1，常温保存：一般用于化学性质比较安稳的规范品，主张保存于干燥阴凉的当地。2，+4度冷藏：用于常温下不是很安稳的物质，保存于冰箱冷藏室。3，-20度冷冻：用于化学性质不安稳，常温下容易分化的物质。4，-80度保存：一些具有生物活性的物质，需求保存于特定的-80度的冰箱。运送条件：相关于长时刻保存的条件，运送进程因为时刻比较短，所以运送条件相对来说要求没有保存条件那么严格。长时刻保存条件为常温和+4度的规范品都可以在常温条件下运送，-20度保存的规范品在运送时可以放入冰袋来下降温度，而-80度保存的物质则需求在运送时参加干冰。但是干冰的有用时刻只能保持1天左右，所以这类型的物质不适合于长途运送。分为两种：一，是所购买的规范品有无失效，一般说来规范品都会有规范证书，只要按规范品证书上的条件进行保存即可通过时刻来认定其有用与否；二，是所配制的规范溶液是否失效。严格说来应该通过期间核查来承认，即用新配制的规范溶液来测定前一段时刻配制的规范溶液是否在差错的范围之内来认定其有用与否。（这个差错范围定在5%以内可行）关于配制成溶液的规范品在保存的时候还需求注意：除非产品标签指明放入冰箱冷藏或冷冻，不然最好放在阴凉干燥的当地室温保存即可。因为低温的时候物质确实不容易分化，但低温使得化合物的溶解度下降，因此导致常温下就难溶解的化合物在低温下长时刻放置时分出晶体，并且一旦分出晶体很难再溶解。规范品也要期间核查？规范品存放时刻，这其实在实验室认可中有清晰的要求，便是所谓的规范品的期间核查。关于已经打开运用的规范品溶液型的产品最好一次性运用完，假如不能运用完，请尽量转移到一个可以避免溶液蒸发的容器中，依照产品的标签进行保存。但在保存进程中，还是有很大可能性因为溶液蒸发导致成分的值与COA不符合。

LC-MS可以通过采集质谱得到总离子色谱图。由于电喷雾是一种软电离源,通常很少或没有碎片,谱图中只有准分子离子，因而只能提供未知化合物的分子量信息，不能提供结构信息。很难用来做定性分析，可以用来定量分析。但单级MS如果不用软电离源，而是EI之类的话，就有碎片峰，可以提供分子结构信息。LC-MS/MS采用串联质谱，既能得到分子离子峰，又有碎片离子峰，因而可以用来进行定性和定量分析。一个基本相似之处是：他们的应用领域都适用于液相适用的领域。质谱的最大特点是：它本身是有质量信息的，是可以靠这个质量信息定性或提供定性的一些依据的（还需要其它的一些定性仪器）。其次，质谱本身也有一个分离作用，就是按照质量的分离，如果液相分离了一次，那LC－MS就分离了两次，而LC-MS/MS就分离了三次，LC-MS3就分离了四次....（3级以上是离子阱质谱的特点）。LC-MS和LC-MS/MS（或MSn）的最大区别是：如果你关心的结果是你样品中的主成分，而且是你已经知道的目标物，比如质控、有机合成后看一下纯品、部分的农药全分析工作、药物合成中前导化合物的指导（合成一锅就打一针看看合成得对不对）等等，都可以用LC-MS。因为它很便宜，操作也很简单。即时有些东西液相没分开，但只要你关心的是主成分，影响都不大。通过调整一下液相条件，或做完扫描图直接看提取离子图，或做SIM都可以。这些领域用LC-MS/MS是大材小用，花这么多钱是浪费。而如果你关心的结果是：（1）未知的东西，打一针LC-MS无法定性，需要更多的碎片信息；（2）是混合物中的痕量成分。那你必须用LC-MS/MS：LC-MS/MS可以给出需要更多的碎片信息，帮助你来定性；LC-MS/MS可以降低背景噪音，让痕量组分的谱图不受丰量物质的干扰；LC-MS/MS可以降低很多背景噪音，使你的化合物的灵敏度大幅提高，定量结果变好。1.LC-MS-MS如何用内内标定量分析？Q：本人现在用三重四级杆LCMSMS定量分析目标物，但是没有标准品。内标法该具体怎么操作呢？资料说先配制一定重量比的待测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线，如果这样的话，没有标准品怎么办？方法一：1、内标法进行定量分析，同样需要待测物标准品。如果没有待测物标准品就不能准确测量其含量，因为无法绘制标准曲线。2、没有待测物标准品不能准确测量其含量，但可以通过加入内标的方法测量待测物的相对含量，可以比较待测物在各样品中的多少及相差倍数。3、用LC-MS-MS做定量一般都采用MRM的扫描方式，你没有待测物标准品，就无法建立和优化MRM扫描的质谱参数，这样你只能使用FULL SCAN或SIM的扫描方法。没有待测物标准品，你也无法准确得到待测物在LC上的保留时间，如果你的样品中有与待测物相似质量数的化合物，你得到的色谱峰就不会很纯净，会对你判定那个是你的待测化合物产生干扰。方法二：没有标准品，就只用面积相对定量。然后选用LCMSMS的SIM模式（样品杂质比较少，选择同位素丰度为100%的分子量，上下增减0.2）。考察因素导致的量的改变比较微量，选择一种物质为回收率指示物（反应液前处理前加入），一种物质为内标物（前处理后、液相小瓶中进样测试前，在待测样品中加入定量的内标物，然后进行测试）。2.LC-MS可以进行定量分析吗？LC-MS如何进行定量分析？请问液质联用中质谱跑出来用于定性的图谱是什么样的，既然是用质谱来进行定量的话，那色谱本身配置的紫外检测器跑出来的图谱用于何用？液质联用有SIM和全扫描的，那么一般在药物代谢动力学试验中一般用哪一种呢？尤其是在对体内药物分析时，内标法用于定量的质谱图是什么样的？质谱定量分析，使用的一般是LC-MS/MS,不使用LC-MS, 看一下质荷比，推测下分子量。UV可以用来定量，但是在有紫外吸收的干扰峰的时候，定量是不准的。LC-MS/MS使用母离子/子离子来进行定量，相对来说，干扰要少的多，也比较准确，在PK/TK的应用很广泛。这里只有LC-MS/MS定量的谱图，仅供参考！183.1/141.3 通道的是内标，其他的两个是化合物。质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯1的断裂。合并特异的母离子质量和唯1的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。3.LC-MS-MS如何进行定量分析？我想用LC-Q-TOF-MS 来做代谢组学，因为是样品是体液含有多种化合物，想加入内标后先进行一个相对的定量来判断含量发生变化的化合物，怎样去定量？用总离子流图好像不合适，如果利用峰面积进行相对定量的话，用哪个图比较合适？必须得用标准品才能定性吗？LC-MS-MS定量分析使用SIM 或MRM模式。公认的MRM更为准确。SIM使用Q选择性的滤过选中的分子量。但是分子量相同的化合物很多，所以，如果样品稍微复杂的话，SIM基本不合适。MRM选择母离子和子离子。使用Q过滤母离子，q 轰击母离子，TOF过滤子离子，使子离子被检测器检测到。分子量相同，轰击后产生的子离子不一样的干扰离子就被排除了。所以，MRM模式是更为可靠的LC-MS定量分析方法。MRM检测是离子对。内标的选择原理是结构基本和待测化合物类似。结构相同或类似，主要是为了满足被离子化的效率与样品类似。这就是为什么很多都选择使用该化合物或此类化合物的氘代化合物。内标的选择还要求其分子量与待测物质不重合(还需要尽量避开化合物的isotopic peak的m/z)，并且可以和待测物质分开。如果使用MRM, 样品被分开的话，那么理论上来说总离子流图上的每个峰都是代表一种物质。同时使用MRM模式，如果样品们的分子量与子离子不重叠，那么，即使在柱子中不被分开的化合物，也是可以认为在MS中被分开了。文献报道的液质中几个峰，MRM检测到几十个物质就是多个物质在同一时间从色谱柱跑出来了。虽然出峰时间一样，但是每个化合物的peak应该是软件中可以显示出来的，只不过报道中由于篇幅有限，会被简略掉。定性的话，需要标品，retention time 需要一致。定量的话，需要先作标准曲线。peak area ration vs concentration.

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。在接种的过程中需要注意哪些问题呢？（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。（5）恒温培养箱应经常清洁消毒。说到这个恒温培养箱，跟大家多说几点，恒温培养箱供大专院校、生物、农业、科研等部门作储藏菌种、生物培养，进行科研的必须设备。要想做好微生物接种实验，就要选喆图生产的专用微生物接种培养箱，能保证实验更顺利的完成。 

　　蛋白质工程是开发有用或有价值的蛋白质的过程。它是一门年轻的学科，正在对蛋白质折叠的理解和蛋白质设计原理的识别方面进行大量研究。它也是一个产品和服务市场，到2017年估计价值为1,680亿美元。　　蛋白质工程有两种通用策略：合理的蛋白质设计和定向进化。这些方法不是互斥的。研究人员经常会同时使用这两种方法。将来，对蛋白质结构和功能的更详细了解以及高通量筛选的进步可能会xxx扩展蛋白质工程的能力。最终，甚至可以通过较新的方法（包括扩展的遗传密码）包括非天然氨基酸，该方法允许以遗传密码编码新氨基酸。　　一旦蛋白质经历了定向进化，定量设计或半定量设计，就必须筛选突变体蛋白的文库，以确定哪些突变体显示出增强的特性。噬菌体展示方法是筛选蛋白质的一种选择。该方法涉及将编码变体多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合。通过在体外与固定的靶标结合来选择在噬菌体表面表达的蛋白质变体。然后在细菌中扩增具有选定蛋白质变体的噬菌体，然后通过酶联免疫吸附测定法鉴定阳性克隆。然后将这些选择的噬菌体进行DNA测序。　　细胞表面展示系统也可用于筛选突变多肽文库。将文库突变基因掺入表达载体中，然后将其转化成合适的宿主细胞。对这些宿主细胞进行进一步的高通量筛选方法，以鉴定具有所需表型的细胞。　　已经开发了无细胞展示系统以利用体外蛋白质翻译或无细胞翻译。这些方法包括mRNA展示，核糖体展示，共价和非共价DNA展示以及体外区室化。

　　琼脂扩散试验包括琼脂双向单扩散试验和琼脂双向双扩散试验，后者是最常用的琼脂扩散试验，一般用于抗体或抗原的定性检测，其原理是可溶性抗原与相应的抗体（抗血清）在琼脂凝胶中向四周自由扩散，如果抗原和抗体相对应，则在二者比例适当处形成肉眼可见的白色沉淀线，反之则不会出现沉淀线。常用已知抗原检测未知的血清样本，也可用已知抗血清检测未知抗原样本。　　1 琼脂扩散试验的影响因素　　1.1 琼脂板的制备　　琼脂板的质量、浓度、黏度、厚度、湿度等都会影响琼脂扩散试验的结果，琼脂浓度越低，则孔径越大，扩散速度也会越快；如果琼脂浓度越大，那么琼脂的黏度也会随之增大，扩散速度会相对减慢，建议使用较好的琼脂（琼脂糖），最适浓度为1%，厚度约2.5毫米，注意倒热融化琼脂液时不要产生气泡，而且空气中的湿度很低，琼脂中的水分容易蒸发，待琼脂冷凝后加盖，把平皿倒置，放在装有湿纱布的搪瓷盘中，防止水分蒸发，保证湿度。　　1.2 打孔　　打孔是琼脂扩散试验中的关键，反应孔应现用现打，放在4℃冰箱中过夜后再使用。实验室常用梅花打孔器，然后用针头挑出内容物。用此种方法在打孔的过程中，注意挑出空内容物时避免将凝胶划破，否则可造成孔与孔之间产生裂痕，产生错误的实验结果。如果试验检测的样品数量不是很多，还可以将若干梅花打孔器先放在空平皿中，孔口朝下，向平皿中倒入稍冷却的热融化琼脂液，之后迅速并平稳地放入4℃冰箱中，冷却后取出平皿，逐个轻轻拔出打孔器，根据实验需要重复此操作。打孔后用酒精灯轻烤平皿底部进行封底时，在酒精灯上来回几次，以平皿不烫手（微热即可）为宜，若是塑料平皿要注意烤的时间不要过长，以免变形，待琼脂刚刚融化为止，防止琼脂板与平皿底部脱离导致阳性血清、被检血清及抗原相互串通，避免出现模糊的沉淀环，影响实验结果。　　1.3 加样　　在加样之前，首先在琼脂板上标记好实验日期及样品编号，加样过程中小心谨慎，每个样品加完后都要换枪头，避免产生小气泡，需要注意的是每孔会因受人工操作的影响在封底时各孔的容积不同，在加样时注意不要让样品溢出导致液体混合。如果大批量检测样品，必须将被检血清、阳性血清和抗原先后加入一个梅花孔后再加入下一个梅花孔，防止加入的时间间隔太长而扩散的时间不同进而影响抗原抗体结合及沉淀线的产生。　　1.4 判定结果　　当标准阳性血清和抗原孔之间只有一条明显致密线时，被检血清与抗原孔形成沉淀线，或阳性血清的沉淀线向相邻的被检血清的抗原侧偏弯，则被检血清为阳性。如果被检血清没有出现任何沉淀带，或出现的沉淀带与阳性对照沉淀带完全交叉者判为阴性。观察时需借助强光源，调整角度、方位直到阳性血清和抗原孔之间出现清晰白色沉淀线则试验成立，否则应重做。　　2 注意事项　　2.1 温度　　温度对整个试验也会有影响，制备琼脂板时融化琼脂时需在水浴中进行，注意防止在加热过程中由于水分的蒸发而影响溶液的浓度，在琼脂中加入0.01%的硫柳汞防止细菌污染，避免腐败。在一定条件下，温度越高扩散越快，通常反应在0～37℃下进行，在试验中为保证沉淀线清晰度防止沉淀线变形，可在37℃下形成沉淀线，然后置于4℃条件下。　　2.2 时间　　扩散时注意时间，时间过短不能出现沉淀线，时间太长会导致沉淀线解离或散开出现假阴性而影响实验结果，沉淀线的形成一般在24小时、48小时、72小时观察并记录，过久会出现沉淀线消失。　　2.3 其他因素　　不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、打孔时孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、抗原抗体浓度不同、孵育时平皿未放平等等，所以在做琼脂扩散试验时一定要设立对照，以免出现假阳性。

酶切的原理：DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA段(如Sma Ⅰ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言， 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。实验过程：实验材料 ：λDNA; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液; HindⅢ酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)。实验试剂：5×TBE电泳缓冲液：6×电泳载样缓冲液：0.%溴粉蓝，40%(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。溴化乙锭(EB溶液母液:将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于 室温即可。实验步骤：1、 DNA酶切反应1) 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl。2) 将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。3) 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。2、 DNA分子量标准的制备采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为 0.5mg/ml，酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段，长度分别为23.1， 9.4， 6.6， 4.4， 2.3， 2.0， 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段，长度 分别为21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9和2.5kb。3、 琼脂糖凝胶电泳1) 胶板的制备（参见琼脂糖凝胶电泳详细说明）。2) 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3) 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。4) 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。5) 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。6) DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。7) DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根据迁移距离直接查出DNA段的大小)。反之，若已知DNA段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。

免疫标记分析技术主要包括：放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记和金标记方法。1 放射物标记分析：用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)是美国科学Yalow和Berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法。该技术利用核素标记物的放大效应,改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。2 荧光标记分析：以荧光标记的荧光免疫分析(fluorescein immunoassay, FIA)是由Conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高,但荧光素常会产生生物学毒性,导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降3.酶标记分析技术：是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique)，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall Van Weemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。4.发光标记分析20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。狭义的发光免疫分析( luminescence immunoassay,LIA )主要是指化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)。另外,还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析( electrochemiluminescence immunoassay , ECLIA)。CLIA是Sohrocler和Halman在20世纪70年代末期建立的,该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反应的特异性。其基本原理同酶标记分析法,是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体,标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定。5 超顺磁微粒标记分析以磁性粒子标记的磁性免疫分析技术(Magnetic Immuno Chromatofraphic Tes,tMICT)是现代物理学与生物技术结合研发生产的磁性分析检测技术,最早应用于基础医学领域[13,14]。与其它标记技术不同,该技术一个显著的优点就是用磁性粒子标记不受有色杂质干扰,可用于直接测量血液、食品、污水等有色样品。其原理是利用超顺磁性纳米微粒作为标记物,由高灵敏度磁性检测仪器测定结合在免疫复合物上的磁性微粒所产生的局部磁场效应,从而得出所测分析物的定量结果。

在免疫学实验中，通常使用封闭剂来减少非特异性结合。常用的封闭剂有脱脂奶粉，BSA，血清以及 Fab 片段单链二抗等。根据不同的平台选择相应的封闭剂。脱脂奶粉作用原理：脱脂奶粉含有多种蛋白，可以封闭未吸附蛋白的固相载体（WB 膜、ELISA 板等）位点，减少抗体与之结合的概率，避免非特异性结合带来的高背景。优点：价格便宜，因含多种不同分子量的蛋白，故封闭起来更全面。缺点：成分复杂，适用范围窄。不适用于生物素和碱性磷酸酶标记的抗体系统。且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的生产中较少应用。牛血清白蛋白BSA作用原理：同脱脂奶粉，封闭未吸附蛋白的固相载体位点。优点：成分单一，适用于 ELISA 实验，生物素、碱性磷酸酶系统的免疫学检测实验或者其他对特异性要求较高的实验。缺点：大部分 BSA 中有少量的抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，造成一定背景。动物血清作用原理：1、待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，血清和 BSA 没有明显区别；2、待检样本中可能会有 Fc 受体，可以和抗体恒定区结合，而封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本 Fc 受体之间结合。BSA 则无法封闭 Fc 受体。优点：因为血清可以封闭 Fc 受体及减少抗体间的非特异性结合，故在免疫组化、免疫荧光实验中有广泛应用。缺点：某些封闭血清中可能含有叠氮钠，因此不适用于 HRP 酶标的检测体系。Fab 片段单链二抗作用原理：由于二价的抗体（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有两个结合位点，不能用来封闭。而 Fab 片段单链二抗只有一个结合位点，因此可完全封闭免疫球蛋白。应用：在 IHC 或 IF 双标/多标实验中，封闭样本表面的免疫球蛋白，封闭组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白，并可解决两个一抗来自同一种属的麻烦。无蛋白封闭剂---新型高效封闭剂Blocker 无蛋白封闭剂，该封闭剂是通过化学合成高亲水性化合物，不存在生物封闭剂所担心的生物安全性、质量、批间差等问题。主要特点：1）与微球表面活化的羧基偶联形成稳定的共价键2）纯化学合成，批间差小，纯度高3）空间结构简单，更充分的封闭微球表面，降低微球非特异性吸附，减少基质干扰4）提高试剂灵敏度5）含大量亲水基团，有利于提高试剂稳定性应用领域：乳胶免疫比浊试剂/ 化学发光试剂 ，代替 BSA 作为封闭剂或与 BSA 联合封闭。免疫试剂稳定液免疫试剂稳定液主要用于免疫分析检测试剂/抗原/抗体/蛋白的保存.  该产品属于即用型，无需稀释，使用简单方便，将待保存物质溶于稳定液中后置于冰箱即可。免疫试剂稳定   液有利于维持蛋白的三维结构，保持蛋白的生物活性，可延长免疫分析试剂及蛋白的使用期限，确保产品的性能。应用领域:1）免疫分析试剂保存, 如免疫比浊检测试剂/化学发光检测试剂2）蛋白质保存，如抗原/抗体/酶类等

很多小伙伴在对胶片印迹进行短暂曝光后，检测不到目的蛋白。可从以下几个方面来优化实验步骤：1、裂解物制备每道全细胞提取物的 20–30 ?g 总蛋白，通常足够用来检测。如果靶标蛋白的基础水平，或蛋白质修饰程度低，可能需要通过化学刺激剂来诱导表达或修饰。你可能要调查备选细胞系或组织，其所含的目的蛋白含量更高。应将样品溶解于适当的缓冲液中，该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂。应务必对裂解物进行超声处理，以确保有效的染色质和膜结合靶标的蛋白质提取。请查看我们网站上的对照物表，获得推荐的阳性对照物和处理方法。2、一抗稀释和/或孵育使用推荐的封闭剂（5% BSA 或 5% 脱脂奶粉），以推荐的稀释度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，过夜孵育一抗。使用备选封闭剂，如明胶、血清、无蛋白封闭剂、酪蛋白、或混合封闭剂，可能降低靶标信号强度。如需单个抗体的优化结果，请查询产品数据表找到推荐的稀释缓冲液。3、SDS-PAGE 凝胶选择一般来说，推荐采用 Tris-Glycine 凝胶。但是，对于高分子量蛋白质，我们推荐采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。蛋白质从 1 毫米凝胶转移比从 1.5 毫米凝胶转移更有效。使用更厚的凝胶，可能会导致高分子量蛋白质的转移不完全，所以我们推荐监测转移效率，根据目的靶标蛋白质分子量大小，优化转移条件。4、转移和膜可通过延长转移时间或使用更高的电压，可改善转膜不完全。一般来说，我们建议在转移缓冲液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 电压下进行为时 2 小时的湿转。对于高分子量蛋白质，我们建议减少转移缓冲液中的甲醇至 5%，以提高转移效率并避免大分子蛋白质在凝胶基质中固定，并且在 70 V 电压下延长转移时间至 3 小时。检测较小的蛋白质时，可能在转膜期间出现过度转移（过膜蛋白质转移）问题。对于小蛋白质分子，使用孔隙大小为 0.2 ?m 的膜并在 70 V 电压下进行为时 1.5 小时的湿转，而不是使用孔隙大小为 0.45 ?m 的膜或进行过夜转移，这样做很重要，因为后者可能会导致过度转移和丢失小蛋白质分子信号。5、封闭膜封闭时间过长可能会掩盖抗原表位，并阻止抗体结合。在室温下仅封闭 1 小时。6、洗涤洗涤时间超过推荐的三次 5 分钟是一个常见问题，可能会导致减少信号。我们推荐计时洗涤，以确保准确性。TBST 应包含 0.1% Tween? 20。这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。此外，我们建议在 TBST 中洗涤，因为已有数据显示在 PBST 中洗涤会导致减少信号。7、二抗稀释和/或孵育可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释，以优化二抗浓度。务必在室温下，在含 5% 脱脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小时。避免在 HRP-偶联二抗的缓冲液中加入叠氮hua钠，因为叠氮化物会抑制 HRP 的活性。8、检测试剂采用能用抗-生物素-HRP 进行检测的生物素化分子量标准作为化学发光检测的阳性对照物。

区别：1、化学式不同。丙二醇：C3H8O2   丁二醇：C4H10O2   乙醇：C2H5OH2、状态不同。丙二醇和丁二醇均为无色粘稠状液体；乙醇为易燃易挥发的无色透明液体。3、气味不同。丙二醇近乎无味，细闻微甜；丁二醇无味；乙醇具有特殊香味，并略带刺激。4、用处不同。在化妆品中，丙二醇、丁二醇均可做保湿剂且具有一定的抑菌效果；乙醇不能做保湿剂。此外：丙二醇可用作不饱和聚酯树脂的原料.在化妆品、牙膏和香皂中可与甘油或山梨醇配合用作润湿剂。在染发剂中用作调湿、匀发剂，也用作防冻剂，还用于玻璃纸、增塑剂和制药工业。丁二醇可用于有机合成，是聚酯树酯、醇酸树脂的原料，增塑剂的原料，聚氨酯涂料的原料，湿润剂和柔软剂，医药、染料的中间体，表面活性剂，塑化剂，吸湿剂，偶合剂，溶剂，食品添加及香味剂。乙醇可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70%~75%的乙醇作消毒剂等，在国防化工、医疗卫生、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。乙醇：有机化合物的一大类，是脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子被羟基取代而成的化合物。一般所指的醇，羟基是与一个饱和的，sp3杂化的碳原子相连。若羟基与苯环相连，则是酚；若羟基与sp2杂化的烯类碳相连，则是烯醇。酚与烯醇与一般的醇性质上有较大差异。化学反应1、与金属反应因为乙醇可以电离出极少量的氢离子，所以其只能与少量金属（主要是碱金属）反应生成对应的有机盐以及氢气：结论：（1）乙醇可以与金属/钠反应产生氢气，但不如水与金属/钠反应剧烈。金属/钠与水反应剧烈，钠熔化，气泡猛烈，反应生成的热，可使钠燃烧；而乙醇与金属/钠的反应很缓慢，形状不怎么变化，气泡很缓慢，金属/钠沉在溶液底下。（2）活泼金属（钾、钙、钠等）可以将乙醇羟基里的氢取代出来。醇的金属盐遇水则迅速水解生成醇和碱。 2、酯化反应乙醇可以与乙酸在浓硫酸的催化并加热的情况下，发生酯化作用，生成乙酸乙酯（具有果香味；酒放得越久就越香就是因为乙醇被缓慢氧化成乙酸，然后发生酯化反应作用，生成乙酸乙酯）。反应为可逆反应：反应中酸脱去羟基，醇脱去羟基上的氢，即“酸脱羟基醇脱氢”。 3、取代反应乙醇可以和卤化氢发生取代反应，生成卤代烃和水。通式：（X为卤素）注意：通常用溴化钠和中等浓度的硫酸的混合物与乙醇加热进行该反应，故常有红棕色气体（溴单质）产生。

一、物质不同1、1,3-丙二醇1,3-丙二醇是一种化学物质，分子式是C?H?O?。可以发生氧化，酯化反应，可以与水混溶，可以混溶于乙醇、乙醚。在工业生产中作为有机溶剂被广泛应用。2、甘油丙三醇，能从空气中吸收潮气，也能吸收硫化氢、氰化氢和二氧化硫。难溶于苯、氯仿、四氯化碳、二硫化碳、石油醚和油类。 丙三醇是甘油三酯分子的骨架成分。相对密度1.26362。熔点17.8℃。沸点290.0℃（分解）。折光率1.4746。闪点（开杯）176℃。急性毒性：LD50：31500 mg/kg(大鼠经口)。二、性质不同1、1,3-丙二醇外观与性状： 无色、无臭，具咸味、吸湿性的粘稠液体。(纯品)熔点(℃)： -27沸点(℃)： 210-211相对密度(水=1)： 1.05(25℃)相对蒸气密度(空气=1)： 2.62、甘油性状：无色无臭的黏稠状液体，有甜味。沸点（℃,101.3kPa）：290，182（2666pa）熔点（℃,流动点）：20相对密度（g/mL,15/15?C）：1.26526相对密度（g/mL,20/20?C）：1.2613三、作用不同1、1,3-丙二醇可用于多种药物、新型聚酯PTT、医药中间体及新型抗氧剂的合成。2、甘油气相色谱固定液（最高使用温度75℃，溶剂为甲醇），分离分析低沸点含氧化合物、胺类化合物、氮或氧杂环化合物，能完全分离3-甲基吡啶（沸点144.14℃）和4-甲基吡啶（沸点145.36℃）。适用于水溶液的分析、溶剂、气量计及水压机缓震液、软化剂、抗生素发酵用营养剂、干燥剂、润滑剂、制药工业、化妆品配制、有机合成、塑化剂。可与水以任何比例溶解，低浓度丙三醇溶液可做润滑油对皮肤进行滋润（开塞露）。

【目的与原理]】掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白的含量。血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。用盐析法沉淀血清中球蛋白，用双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。血清球蛋白的量从两者的差值求得。【[试剂与器材】试剂：1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。保存于25℃以上的温度中。2、双缩脲试剂3、标准血清：市售或配制。4、乙mi器材：可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。【实验步骤】1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。以1ml刻度吸管吸取悬液1ml（相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。剩余的混悬液另加乙mi约2ml，揿住管口，在约20秒钟内颠倒混和40次，然后经每分钟2500转的速度离心沉淀5分钟。此时试管内分成三层：上层为乙mi，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白测定管”。在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”。2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。3、计算将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值：（1）总蛋白测定管光密度/ 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清总蛋白g/100ml（2）白蛋白测定管光密度/标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清白蛋白g/100ml（3）血清总蛋白—血清白蛋白=血清球蛋白g/100ml（4）血清白蛋白÷血清球蛋白=血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。【方法评估】本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。在25℃操作时，无结晶析出。用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。血清经盐析分离后，蛋白质的测定一般均用比色法。【应用意义】白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白>球蛋白，另一些鱼白蛋白【注意事项】1、某些用乙mi及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙mi，而用优质小张中速滤纸在37℃水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时可按1：20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在25℃以上的室温中进行。如受实验室条件限制，只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与本法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23%硫酸钠溶液（无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21%亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g，加蒸馏水到1L）。

　　牛血清白蛋白(BSA)，是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，分子量为66.446KDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用。　　是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着;α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着;转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。　　折叠多肽　　血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。　　牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分(38g/100ml)，分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在westernblot中作为Blockingagent。　　牛血清白蛋白的用途：　　1、在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。　　2、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。　　3、生化研究，遗传工程和药物研究。　　牛血清白蛋白的储备方式：　　每10克加100毫升水进行溶解，或用 PBS溶解也可，视用途而决定。然后分装成小支。若不使用防腐剂可贮存在零下20或30摄氏度的恒温柜中，若使用防腐剂则可贮存在零上4摄氏度的环境下。一般可存放数月不变质。防腐剂可能对牛血清白蛋白的效果造成影响，应慎用。　　在免疫试验中常用作封闭剂包括ELISA、WB（Western Blot）。作为载体蛋白，将其交联于半抗原和其他弱抗原可以使它们在抗体生产中具有更强的免疫原性。在限制性内切酶消化反应中，BSA常常被用作一些酶的反应稳定剂，并且能防止它粘附到管壁和枪头上。BSA也常用于生物制药的生产过程或者作为营养物用于细胞和微生物培养。除此之外，还作为蛋白定量检测的标准品使用。

实验概要可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。本文介绍了单向和双向两种琼脂扩散试验的操作流程。单向琼脂扩散试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量；双向琼脂扩散试验可用来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。实验原理1. 单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。2. 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。实验步骤1. 单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的测定   1) 材料IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器(10微升)、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。   2) 方法      a. 免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴比/妥缓冲液配成)，加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度)，混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。      b. 稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。      c. 加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。      d. 扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，(如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察)，必要时可以染色后观察。      e. 绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法：      Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散(＞48小时)的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。      Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。2. 双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)   1) 材料羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。   2) 方法      a. 用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。      b. 待琼脂凝固后，按右图用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。      c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。      d. 将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3 缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。(1)按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。(2)改用不依赖CO2培养液。(3)松开瓶盖1/4 圈。加HEPES 缓冲液至10 到25mM终浓度。(4)在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。(5)如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。

可能原因：1 细胞崩解了；2 培养基可能污染了，取部分培养基进行检菌试验细胞培养中常见的生物污染类型有7种,分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染.他们在细胞培养中污染的特点如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显.2、支原体：黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一.而且它不能用过滤的办法除去.支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去.3、黑胶虫：可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的.常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象.对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理.4、真菌：一般培养液清亮,不变色,镜下有丝状物,有些真菌开始很像死细胞碎片,只是它很多很多的小块很清楚,象珊瑚状,不象细胞碎片分不清,慢慢的会长出很细的黑色丝状物.真菌生长的比较慢,不象细菌那么容易被发现,但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了,也很难救活了5、原虫：培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮.他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养.这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,最终形成恶性循环.6.病毒：组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染.目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒.尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的.因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 。7、非同种细胞污染 ：即是细胞交叉污染,由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另一种细胞污染.目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效.非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致.