检验科收到临床标本后，应尽快低速离心分离血清或血浆进行测定。45℃水浴10分钟，再3000r/min离心5分钟，即可使LDH、K等显著升高。对血液标本外观观察是判断标本质量的最直观的方法，外观异常有溶血、黄疸、脂血等情形，是引起测定误差最常见的因素。(1)标本的离心离心分离血清应选择相对离心力(RCF)为1000g～1200g，离心时间为5～10分钟。增加相对离心力或增加离心时间，都易引起溶血。(2)溶血标本的处理溶血可导致RBC内多种成分的释出，引起对测定方法的干扰，Hb≥0.2g/L，肉眼可见溶血。①间接干扰：Hb的释出，可引起间接的干扰，因Hb在波长为431nm和555nm处有光吸收，若被测物选用与之相近波长作比色分析时，可导致假性增高。处理方法：轻度溶血，同时作血清空白;严重溶血，重留样本。②直接干扰：RBC内含量高的血液化学成分溶血后，这些化学成分在血清中浓度就会增高，避免用溶血标本测定在RBC内含物高的化学成分。如钾、ALP、AST、Bil、CK、LD.ACP等。(3)乳糜标本的处理高脂血症的病人往往可导致乳糜血，为了不影响检测，应对乳糜血进行澄清。具体方法如下：血清和(或)血浆与氟利昂以1：1在玻璃试管中混合。氟利昂在血浆和(或)血清下，180℃颠倒试管3min，使充分混合。然后3000g离心6min.上清液为澄清的血清，中层含沉淀的脂蛋白，下层为多余的氟利昂，澄清过程可重复多次而不影响酶的活性和底物。(4)胆红素(黄疸)标本的处理胆红素的颜色对反应结果为黄色和红色化合物的比色分析有正向干扰，可用样品空白或动力学和双试剂消除。另外，胆红素不稳定，在碱性环境或强光线照射下，转变为胆绿素、胆褐素而褪色，如用碱性苦味酸法测定肌酐，黄疸标本常常会出现负数。另外胆红素还有还原性，对Trinder反应有负干扰，如氧化酶法测定葡萄糖、胆固醇、甘油三脂、尿酸等，可通过进行干扰试验消除恒定误差。

　　抗生素　　1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素　　1.1. 培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素　　1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。　　2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。　　3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制mycoplasma 生长。　　4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。　　5. 抗生素使用种类与浓度：工作浓度.     储存温度.    杀灭细菌 .

一．评价水质的常用指标有哪些？1、电阻率（electrical resistivity）：衡量实验室用水导电性能的指标，单位为MΩ-cm，随着水内无机离子的减少电阻加大则数值逐渐变大，实验室超纯水的标准:电阻率为18.2MΩ-cm。2、总有机碳（Total Organic Carbon ，TOC）：水中碳的浓度，反映水中氧化的有机化合物的含量，单位为ppm 或 ppb。3、内毒素（Endotoxin）：革兰氏阴性细菌的脂多糖细胞壁碎片，又称之为“热原”，单位cuf/ml。二．按照用途进行分类，实验室用水可以分为哪些种类？实验室常见的水的种类：1、蒸馏水（Distilled Water ）：实验室zui常用的一种纯水，虽设备便宜，但极其耗能和费水且速度慢，应用会逐渐减少。蒸馏水能去除自来水内大部分的污染物，但挥发性的杂质无法去除，如二氧化碳、氨、二氧化硅以及一些有机物。新鲜的蒸馏水是无菌的，但储存后细菌易繁殖；此外，储存的容器也很讲究，若是非惰性的物质，离子和容器的塑形物质会析出造成二次污染。2、去离子水（Deionized Water ）：应用离子交换树脂去除水中的阴离子和阳离子，但水中仍然存在可溶性的有机物，可以污染离子交换柱从而降低其功效，去离子水存放后也容易引起细菌的繁殖。3、反渗水（Reverse osmosis Water）：其生成的原理是水分子在压力的作用下，通过反渗透膜成为纯水，水中的杂质被反渗透膜截留排出。反渗水克服了蒸馏水和去离子水的许多缺点，利用反渗透技术可以有效的去除水中的溶解盐、胶体，细菌、病毒、细菌内毒素和大部分有机物等杂质，但不同厂家生产的反渗透膜对反渗水的质量影响很大。4、超纯水（Ultra-pure grade water）：其标准是水电阻率为18.2MΩ-cm。但超纯水在TOC、细菌、内毒素等指标方面并不相同，要根据实验的要求来确定，如细胞培养则对细菌和内毒素有要求，而HPLC则要求TOC低。三．按照GB6682-2008的标准，纯水水质分为哪几类？纯水水质按照GB6682-2008水标准进行分类，可以分为以下三类：（1）三级水标准，电阻率0.2 MΩ.cm @ 25℃；（2）二级水标准,电阻率≥1MΩ.cm @25℃； （3）一级水标准,电阻率≥18 .25MΩ.cm@2 5℃。具体技术指标如下：指标一级二级三级pH值范围（25℃）----5.0-7.5电导率（25℃），mS/m.                ≤0.010.100.50可氧化物质（以0计），mg/L           ＜--0.080.4吸光度（254nm,1cm光程）              ≤0.0010.01--蒸发残渣（105°±2℃），mg/L         ≤--1.02.0可溶性硅（以SiO2计）mg/L             ＜0.010.02--    四．不同级别纯水的应用领域各有哪些？应用领域纯水级别相关参数液相色谱（HPLC）气相色谱（GC）原子吸收（AA）电感耦合等离子体光谱（ICP）电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分子生物学实验和细胞培养等I级水电阻率(MΩ.cm)：>18.0TOC含量（ppb）：热原(Eu/ml)：颗粒（units/ml）：硅化物 (ppb)：细菌（clu/ml）：pH：NA制备常用试剂溶液制备缓冲液II级水电阻率(MΩ.cm)：>1.0TOC含量（ppb）：热原(Eu/ml)：颗粒（units/ml）：NA硅化物 (ppb)：细菌（clu/ml）：pH：NA冲洗玻璃器皿水浴用水III级水电阻率(MΩ.cm)：>0.05TOC含量（ppb）：热原(Eu/ml)：NA颗粒（units/ml）：NA硅化物 (ppb)：细菌（clu/ml）：pH：5.0-7.5

　　纯净水，指的是不含杂质的H2O。　　从学术角度讲，纯净水又称纯水、高纯水，是指化学纯度极高的水，其主要应用在生物、化学化工、冶金、宇航、电力等领域，但其对水质纯度要求相当高，所以一般应用zui普遍的还是电子工业。纯水和超纯水一般都没有统一的标准，通常水的纯度是以其电阻率（或电导率）来表证；也有根据用户的需求来规定。　　一般意义上讲纯水至少应该是去离子水，即水中大部分阴阳离子是应该被去除的。细菌、悬浮物等的含量也应是相当低的。　　目前水质要求zui高的超纯水是半导体行业，根据半导体芯片的大小和线径的不同水质要求也不一样，其超纯水的水质指标如下：电阻率大于18.2兆欧（25摄氏度）；TOC（总有机碳）小于1到10ppb，DO（溶解氧）小于1到10ppb；Particle（颗粒）：0.05微米小于200个/升；离子含量大部分是小于20到50ppt；细菌检测：无。但对于高纯水来说这是不确切的，应检测纯水中某项杂质的含量来表证。这是因为：影响高纯水电阻率的主要因素是PH，而不是ppt即10-11M级杂质，电阻率是衡量水中电解质总和的参数，不能表证某一单项杂质的含量，而对于高纯分析所关心的不是杂质的总含量，而是我们所要分析的某单项杂质该元素的含量，即空白值，这显然不能由电阻率给出的，总之，对于高纯水如果仍以电阻率衡量其水质，将会造成错觉。因此，我们以无焰原子吸收光谱法检查纯水的单项杂质含量来表证其水质，这样可确切地反映水的纯度。而高纯水的国家标准为：GB1146.1-89至GB1146.11-89[168]，目前我国高纯水的标准将电子级水分为五个级别：Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级和Ⅴ级，该标准是参照ASTM电子级标准而制定的。　　高纯水的水质标准中所规定的各项指标的主要依据有：　　1.微电子工艺对水质的要求；　　2.制水工艺的水平；　　3.检测技术的现状。

　　生化培养箱广泛应用于细菌、霉菌、微生物、组织细胞的培养保存以及水质分析与BOD测试，适合育种试验、植物栽培。是生物、遗传工程、医学、卫生防疫、环境保护、农林畜牧等行业的科研机构、大专院校、生产单位或部门实验室的重要试验设备。　　1.生化培养箱也叫BOD培养箱，是一种集加热、制冷功能于一体的实验室常用设备，主要用于水体分析的BOD测定；细菌、血清、微生物的培养、保存，植物栽培及育种试验；酶学及酶工程研究；生物、医用制品、疫苗、血液及各种标本的保存及老化试验及其他用途的恒温试验。　　2.霉菌培养箱具有加热、制冷、加湿、消毒功能的高精度实验室设备，广泛应用于各种霉菌、组织细胞、微生物、抗生物的培养，也可用于昆虫、小动物的饲养及其它用途的恒温试验。它比生化培养箱多一个消毒功能，一般都是带紫外杀菌灯，可以作为生化培养箱使用。也有部分霉菌培养箱在恒温，杀菌基础上增加了湿度控制，带湿度控制的霉菌培养箱也可以当做恒温恒湿培养箱使用。　　生化培养箱与霉菌培养箱联系：　　两者都具有双制式冷热控温。　　生化培养箱与霉菌培养箱区别：　　生化培养箱不带控湿和不带杀毒功能，而霉菌既有控湿有用杀毒功能。所以同体积的霉菌培养箱比生化培养箱略贵一些。　　补充说明：　　1.霉菌培养箱安装有灭菌灯，而生化培养箱无需安装；　　2.霉菌培养箱有加湿和不加湿两种选择，而生化培养箱没有加湿选择；它们都可用于细菌培养，如细菌培养无需制冷的话，也可以选择电热恒温培养箱。

　　菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是，经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。　　种子扩大培养的任务　　工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。因此，种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常常采用三级种子扩大培养。一般50 t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。而谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，一般采用二级发酵。　　种子制备的过程　　细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养温度大多数为37 ℃，少数为28 ℃，细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。　　霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。　　⒈ 孢子制备　　孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。　　⑴ 放线菌孢子的制备　　放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)，碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子的形成，氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ℃，少数为37 ℃，培养时间为5～14天。　　采用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。采用母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异，采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。菌种进入种子罐有两种方法。一种为孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐。此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。另一种方法为摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间。　　⑵ 霉菌孢子的制备　　霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25～28 ℃，培养时间为4～14天。　　⒉ 种子制备　　种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽、菌丝繁殖或菌体增殖。　　⑴ 摇瓶种子制备　　某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶相当于微缩了的种子罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。　　摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全，并易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。　　⑵ 种子罐种子制备　　种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子，把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子，将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。　　种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。种子制备的目的是要形成一定数量和质量的菌体。孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐内即可进行。发酵的目的是获得大量的发酵产物。产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生菌，其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。种子罐级数减少，有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。　　种子培养　　种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和培养方法，从而保证种子正常生长。工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型，静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。而通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性培养。　　⒈ 表面培养法　　表面培养法是一种好氧静置培养法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。　　⒉ 固体培养法　　固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称为曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。　　⒊ 液体深层培养　　液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。其特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。　　⑴ 深层培养基本操作的三个控制点　　① 灭菌　　发酵工业要求纯培养，因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。所以种子罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和种子罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于种子罐内。　　② 温度控制　　培养基灭菌后，冷却至培养温度进行种子培养，由于随着微生物的生长和繁殖会产生热量，搅拌也会产生热量，所以要维持温度恒定，需在夹套中或盘管中通冷却水循环。　　③ 通气、搅拌　　空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除增加溶解氧以外，可使培养液中的微生物均匀地分散在种子罐内，促进热传递，以及pH均充，并使加入的酸和碱均匀分散等。　　⑵ 几种深层培养法　　① 控制培养法　　根据罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物的最优培养条件。为此，用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境(培养条件)控制于给定的基准内。这就叫做电子计算机控制培养。目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。　　② 载体培养法　　载体培养法脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固体基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制。发酵结束，只要将菌体和培养基挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。　　③ 两步法　　在酶制剂的两步法液体深层培养中，每一步菌体相同而培养条件不同，因为微生物生长与产酶的最适条件有很大的差异。例如往培养基中添加葡萄糖能大大增加菌体或菌丝的生长，然而却严重阻碍许多种酶的合成。加强培养液的通气虽然能促进微生物的生长，可是在多数场合下反而抑制酶的合成。为了取得最大的高活力酶，必须制定一种调节方法，既要求细胞的单位酶活力高，又要求细胞数量多，也就是说，给菌体在各种生理时期创造不同的条件。两步法液体深层培养就是实现这种调节的具体措施之一。酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件(生长期)与产酶条件(生产期)区分开来。菌体先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分的利用。　　种子质量的控制　　种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。这就是说既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。　　㈠ 影响孢子质量的因素及其控制　　孢子质量与培养基、培养温度、湿度、培养时间、接种量等有关，这些因素相互联系、相互影响，因此必须全面考虑各种因素，认真加以控制。　　⒈ 培养基　　构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定的影响。生产过程中孢子质量不稳定的现象，常常是原材料质量不稳定所造成的。原材料产地、品种和加工方法的不同，会导致培养基中的微量元素和其他营养成分含量的变化。例如，由于生产蛋白胨所用的原材料及生产工艺的不同，蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸组分均有所不同，而这些营养成分对于菌体生长和孢子形成有重要作用。琼脂的牌号不同，对孢子质量也有影响，这是由于不同牌号的琼脂含有不同的无机离子造成的。　　此外，水质的影响也不能忽视。地区的不同、季节的变化和水源的污染，均可成为水质波动的原因。为了避免水质波动对孢子质量的影响，可在蒸馏水或无盐水中加入适量的无机盐，供配制培养基使用。例如在配制生产四环素的斜面培养基时，有时在无盐水内加入0.03％(NH4)2HPO4，0.028％KH2PO4及0.01％MgSO4，确保孢子质量，提高四环素发酵产量。　　为了保证孢子培养基的质量，斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用。制备培养基时要严格控制灭菌后的培养基质量。斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定的时间，使斜面无冷凝水呈现，水分适中有利于孢子生长。　　配制孢子培养基还应该考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，各种氨基酸对菌落的表现不同。氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。斜面培养基上用较单一的氮源，可抑制某些不正常型菌落的出现；而对分离筛选的平板培养基则需加入较复杂的氮源，使其多种菌落类型充分表现，以利筛选。因此在制备固体培养基时有两条经验：① 供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势；② 作为选种或分离用的平板培养基，则需采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。　　⒉ 培养温度和湿度　　微生物在一个较宽的温度范围内生长。但是，要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。一般来说，提高培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间，但是，菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的。因此，培养温度不同，菌的生理状态也不同，如果不是用最适温度培养的孢子，其生产能力就会下降。不同的菌株要求的最适温度不同，需经实践考察确定。例如，龟裂链霉菌斜面最适温度为36.5～37 ℃，如果高于37 ℃，则孢子成熟早，易老化，接入发酵罐后，就会出现菌丝对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升提前，发酵产量降低等现象。培养温度控制低一些，则有利于孢子的形成。龟裂链霉菌斜面先放在36.5 ℃培养3天，再放在28.5 ℃培养1天，所得的孢子数量比在36.5 ℃培养4天所得的孢子数量增加3～7倍。　　斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少；相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。例如，在我国北方干燥地区，冬季由于气候干燥，空气相对湿度偏低，斜面培养基内的水分蒸发的快，致使斜面下部含有一定水分，而上部易干瘪，这时孢子长得快，且从斜面下部向上长。夏季时空气相对湿度高，斜面内水分蒸发得慢，这时斜面孢子从上部往下长，下部常因积存冷凝水，致使孢子生长得慢或孢子不能生长。试验表明，在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在40％～45％，而在南方相对湿度控制在35％～42％，所得孢子质量较好。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。　　在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高培养箱内的相对湿度，为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长。现代化的培养箱是恒温、恒湿，并可换气，不用人工控制。　　最适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培养基组分不同，对微生物的最适温度会有影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微生物培养的最适相对湿度。　　⒊ 培养时间和冷藏时间　　丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段：① 孢子发芽和基内菌丝生长阶段；② 气生菌丝生长阶段；③ 孢子形成阶段；④ 孢子成熟阶段；⑤ 斜面衰老菌丝自溶阶段。　　⑴ 孢子的培养时间　　基内菌丝和气生菌丝内部的核物质和细胞质处于流动状态，如果把菌丝断开，各菌丝片断之间的内容是不同的，有的片断中含有核粒，有的片断中没有核粒，而核粒的多少亦不均匀，该阶段的菌丝不适宜于菌种保存和传代。而孢子本身是一个独立的遗传体，其遗传物质比较完整，因此孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。但是孢子本身亦有年轻与衰老的区别。一般来说衰老的孢子不如年轻孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。孢子的培养工艺一般选择在孢子成熟阶段时终止培养，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子，如果继续培养，则进入斜面衰老菌丝自溶阶段，表现为斜面外观变色、发暗或黄、菌层下陷、有时出现白色斑点或发黑。白斑表示孢子发芽长出第二代菌丝，黑色显示菌丝自溶。孢子的培养时间对孢子质量有重要影响，过于年轻的孢子经不起冷藏，如土霉素菌种斜面培养4.5天，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8天菌丝即开始自溶。而培养时间延长半天(即培养5天)，孢子完全成熟，可冷藏20天也不自溶。过于衰老的孢子会导致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。　　⑵ 孢子的冷藏时间　　斜面孢子的冷藏时间，对孢子质量也有影响，其影响随菌种不同而异，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。曾有报道，在链霉素生产中，斜面孢子在6 ℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月的低18％，冷藏3个月后则降低35％。　　⒋ 接种量　　制备孢子时的接种量要适中，接种量过大或过小均对孢子质量产生影响。因为接种量的大小影响到在一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状态。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种。接种量过小则斜面上长出的菌落稀疏，接种量过大则斜面上菌落密集一片。一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。一般一支高度为20 cm、直径为3 cm的试管斜面，丝状菌孢子数要求达到107以上。　　接入种子罐的孢子接种量对发酵生产也有影响。例如，青霉素产生菌之一的球状菌的孢子数量对青霉素发酵产量影响极大，若孢子数量过少，则进罐后长出的球状体过大，影响通气效果；若孢子数量过多，则进罐后不能很好地维持球状体。　　除了以上几个因素需加以控制之外，要获得高质量的孢子，还需要对菌种质量加以控制。用各种方法保存的菌种每过1年都应进行1次自然分离，从中选出形态、生产性能好的单菌落接种孢子培养基。制备好的斜面孢子，要经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于发酵生产。　　㈡ 影响种子质量的因素及其控制　　种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度以及糖氮代谢、pH值变化等为指标，符合要求方可进罐。　　种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。种子制备不仅是要提供一定数量的菌体，更为重要的是要为发酵生产提供适合发酵、具有一定生理状态的菌体。种子质量的控制，将以此为出发点。　　⒈ 培养基　　种子培养基的原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较容易适应发酵罐的培养条件。发酵的目的是为了获得尽可能多的发酵产物，其培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。种子培养基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。例如，种子培养基的pH值控制对四环素发酵有显著影响。　　⒉ 培养条件　　种子培养应选择最适温度，前面已有叙述。培养过程中通气搅拌的控制很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区别控制，一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。在青霉素生产的种子制备过程中，充足的通气量可以提高种子质量。例如，将通气充足和通气不足两种情况下得到的种子都接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但是，在土霉素发酵生产中，一级种子罐的通气量小一些却对发酵有利。通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象。生产过程中，有时种子培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。　　对青霉素生产的小罐种子，可采用补料工艺来提高种子质量，即在种子罐培养一定时间后，补入一定量的种子培养基，结果种子罐放罐体积增加，种子质量也有所提高，菌丝团明显减少，菌丝内积蓄物增多，菌丝粗壮，发酵单位增高。　　⒊ 种龄　　种子培养时间称为种龄。在种子罐内，随着培养时间延长，菌体量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度，由于营养物质消耗和代谢产物积累，菌体量不再继续增加，而是逐渐趋于老化。由于菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的控制就显得非常重要。在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。此时的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可大大缩短在发酵罐中的迟滞期（调整期），缩短在发酵罐中的非产物合成时间，提高发酵罐的利用率，节省动力消耗。如果种龄控制不适当，种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等等；而种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。在土霉素生产中，一级种子的种龄相差2～3 h，转入发酵罐后，菌体的代谢就会有明显的差异。　　最适种龄因菌种不同而有很大的差异。细菌的种龄一般为7～24 h，霉菌种龄一般为16～50 h，放线菌种龄一般为21～64 h。同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到的种子质量也不完全一致，因此最适的种龄应通过多次试验，特别要根据本批种子质量来确定。

　　冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。生物菌种冻干保存步骤，其操作流程如下：　　1、安瓿管准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。　　2、保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。　　3、冻干样品的准备　　在适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行))，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。　　4、预冻　　一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。　　5、冷冻干燥　　采用冻干机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。　　终止干燥时间应根据下列情况判断：　　安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；　　真空度接近空载时的最-高值；　　样品温度与管外温度接近；　　选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结；　　选用一个安瓿管，装1-2%氯-化钴，如变深兰色，可视为干燥完结；　　冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。　　6、真空封口及真空检验　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。　　7、保藏　　安瓿管应低温避光保藏。　　8、质量检查　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

蛋白酶K是一种从白色念 珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高 的比活性，是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)均有活性，用于质粒或基因组 DNA、RNA的分离。在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使 DNA游离在溶液中，随后用不同方法进行抽提，除去杂质，收集DNA。EDTA等螯 合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。蛋白酶K贮存液一般为10mg/ml或20mg/ml。 贮存于一20°C。蛋白酶K溶液为无色透明， 如出现沉淀就不能再使用。蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。一、作用：蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核 的消失，从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。蛋白酶K的应用比较广泛，它可以消化包围靶DNA蛋白，因此使用蛋白酶K能够增加探针 与靶核酸结合的机会增强杂交信号，但在使用蛋白酶K时要主要使用的浓度，过高或者过低都会破坏细胞的结构、核消失等影响试验结果。二、保存方法：保存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时；理想孵育时间为2小时。三、蛋白酶K配制标准：20mg/ml蛋白酶K配制标准(proteinase K)：将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。四、蛋白酶K跟蛋白酶有什么区别：蛋白酶是所有能够催化分解蛋白质的酶类的统称,而蛋白酶K则是特指一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,用于生物样品中蛋白质的降解,比如在提取DNA时溶解DNA的水中就有一定量的蛋白酶K.所以它们不属于同一个产品。

蛋白示踪上样缓冲液（还原，5×）适用于还原型SDS-PAGE 电泳前的蛋白样品处理。本产品含有两种示踪染料，分别是蓝色的溴酚蓝和红色的派洛宁γ，可实时监控蛋白样品的电泳进程。同时，在凝胶上显现的红色条带可伴随蛋白样品转移至印迹膜上，因此本产品具有检测WesternBlotting 转膜效率的作用。使用本产品操作简单，用法与普通上样缓冲液相同。注意事项 1.  为避免产品的反复冻融，建议分装后保存。产品在使用中，可保存在2-8℃条件下，时间不宜过久。 2.  本产品在不同的胶浓度中，红色染料与溴酚蓝泳动的前后顺序会略有不同。 3.  本产品仅用于科研，不能用于人体实验或人体治疗。操作步骤 1. 将蛋白示踪上样缓冲液（还原，5x）与蛋白样品按照1：4 的比例混匀。 2. 将蛋白样品置于沸水浴中加热3-5 分钟。 3. 待蛋白样品充分变性后冷却至室温，离心30 秒。 4. 离心后，以微量进样器取适量上清，直接加入SDS-PAGE 凝胶加样孔内。 5. 进行常规电泳，当染料到达距离凝胶底端0.5cm-1cm 处即可停止电泳。生化试剂的种类与等级说明：（1）免疫试剂包括抗体及抗血清、正常血清及补体、抗原、免疫组织化学研究用试剂、细胞培养用试剂、细胞分离试剂、凝胶内扩散法及电泳试剂等。（2）基因工程用试剂包括基因表达与基因重组、人工合成蛋白、激素、核酸合成试剂、核酸制剂、内切酶等。（3）诱变剂和致癌物质主要供测定工作场所与生活环境中的毒物质的致癌性与化学毒物的致突变性。（4）临床诊断试剂主要供医疗系统中的临床病理诊断、生化诊断、液晶诊断、同位素诊断与一般化学诊断等诊断检查中所用的一大类化学试剂。（5）工业用化学品包括试制开发的工业用化学品，有四千种以上，还在不断增加。

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。1. 收到抗体和重组蛋白后的操作收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋白是溶液态），请务必在 4℃，12000rpm，离心 3 分钟，再打开管盖进行分装、溶解和保存（如果抗体和重组蛋白体积小于 50?l，请延长离心时间至 5 分钟，以保证全部抗体和重组蛋白均离心下来，干粉状态的同样适用）。抗体和重组蛋白使用特制的储存管，只有在 12000rpm 离心 3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体和重组蛋白全部离心下来（即使是在 10000rpm 离心也会离心不完全，导致出现抗体和重组蛋白的量不足的现象）。请详细阅读说明书，并按照推荐的保存条件正确保存和使用抗体和重组蛋白。2. 抗体和重组蛋白的长期保存对于 大部分抗体和重组蛋白，比较合适的保存方式是：抗体分装后保存在 -20℃，重组蛋白分装后保存在 -80℃。（1）分装可以-大程度的降低反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体和重组蛋白造成的污染可能性。（2）分装的量以一次实验用完为好，少不能少于 10 ?l 每份。因为分装体积越小，抗体和重组蛋白的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。（3）复融后的分装抗体和重组蛋白如果一次用不完，将剩余母液保存在 4℃，避免再冻起来。（4）抗体和重组蛋白工作液应该当天配制当天用完，4℃ 保存尽量不要超过 1 天。（5）绝-对避免将抗体和重组蛋白保存在自动除霜冰箱中，将抗体和重组蛋白保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。3. 抗体和重组蛋白的短期保存大部分 的抗体和重组蛋白收到后 4℃ 短暂保存 1~2 周，对抗体和重组蛋白活性没有影响。如果抗体和重组蛋白很快会使用（1~2 周内），推荐在 4℃ 保存，这是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害。关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体和重组蛋白。4. 抗体和重组蛋白的运输条件一般的运输过程需要 1~2 周的时间，所以是在低温 4℃ 的条件下来完成的。4℃ 运输主要的目的是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体和重组蛋白是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中一般避免干冰运输。5. 抗体和重组蛋白的稳定性（1）抗体的稳定性是自然界长期进化的结果，抗体是免疫系统中重要的分子之一，其稳定性是自然进化筛选的结果，在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳定的结构。（2）抗体的高Tm值，在室温下，甚至短时间温度达到 50~60℃，抗体分子都能维持正确折叠，保持其应有的活性。（3）抗体和重组蛋白的纯度。 采用先进的抗体和重组蛋白纯化技术，确保抗体和重组蛋白产品的高纯度，保障其抗体和重组蛋白产品的稳定性。（4）抗体和重组蛋白的浓度。高浓度的抗体和重组蛋白产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓度的抗体和重组蛋白稳定性更好。 大部分抗体和重组蛋白浓度为 1mg/ml，抗体和重组蛋白纯度高，特异性好，效价更高。6. 重组蛋白的特性重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在 -80℃ 条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。（1）原核细胞表达的重组蛋白。 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白 100?g，用 86?l 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。

一、生物大分子色谱纯化方法的选择思路通常在做纯化前对自己的目标物质特性了解越多对纯化将会越有利，如果不太了解，也可以通过电泳知道目标物质和杂质的情况，找到一种简单的鉴定方法，此外在纯化前必须先建立可靠的活性测定的方法。如果是未知的蛋白，那么通常可以有几种简单的摸索：1. 凝胶过滤色谱。这个方法很常用，但是效率不高，对低浓度的样品没有富集作用，上样量小。2. 离子交换色谱。此法很常用，但是样品必须没有高浓度的盐。3. 疏水色谱。此法较好，它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。4. 亲和色谱。是最有效的手段，关键了解目标物质的特性以便选择合适的亲和色谱填料。二、主要用途介绍1. 去除内毒素内毒素也叫热源，一般是磷脂 A ，糖类和蛋白，在中性条件下带有负电荷。内毒素的磷脂部分有很强的疏水性，一般的在高盐情况下它们会聚合，所以不能用疏水色谱，如果蛋白本身的疏水性强，可以选择把目标蛋白结合到疏水色谱填料（苯基琼脂糖凝胶 FF ，丁基琼脂糖凝胶 FF ）上和内毒素分离。内毒素因为带有很强负电荷，如果目标蛋白带阳电荷，用 DEAE 琼脂糖凝胶 FF 或Q 琼脂糖凝胶 FF 把内毒素吸附，达到去除内毒素的目的。如果目标蛋白带阴电荷，可以尝试用阶段或梯度洗脱的方法把它们分离。其中最有效而特异的方法是用亲和色谱填料去除内毒素，为此专门开发了两种专门去除内毒素的色谱填料，去内毒素琼脂糖凝胶 FF 和高效去内毒素琼脂糖凝胶 FF可以很方便去除内毒素，其应用简单，效果明显，样品回收率高。方法是把适量的色谱填料加到样品中 4 度震荡 40h 左右无菌过滤就可以得到热源符合要求的样品，或者直接装柱然后循环上样 8 小时左右即可。2. 去除核酸大量的核酸会使样品的粘度增加，影响传质从而影响分离效果，此外在药品检验中也对核酸的含量有严格的规定，所以去除核酸非常重要。核酸带有阴性的电荷，可用阴离子交换色谱填料 DEAE 琼脂糖凝胶 FF 或 Q 琼脂糖凝胶 FF 去除，也可用阳离子色谱填料： SP 琼脂糖凝胶 FF 或 CM 琼脂糖凝胶FF 直接把目标蛋白吸附而去除核酸。在 2M 硫酸铵的条件下， RNA 和 DNA 都可以被苯基琼脂糖凝胶 FF 吸附。此外也可以用核酸酶处理样品，把核酸降解成小片段，用凝胶过滤就可以去除。此外也可以本公司的 DNA 纯化琼脂糖凝胶 FF 去除。3. 纯化硫酸铵沉淀样品硫酸铵沉淀是很常用的初分离的手段，这样沉淀后的样品可直接用苯基琼脂糖凝胶FF 或者是丁基琼脂糖凝胶 FF 分离，不用除盐，非常方便。疏水色谱已经得到大规模的推广和应用，是很好的纯化的手段。此外疏水色谱也可以用于天然产物的分离纯化，包括多肽、色素等各种物质的分离纯化，它的分离原理和反相色谱相同，但是不同于硅胶色谱填料的是它对样品几乎没有死吸附，所以回收率高。4. 糖蛋白的纯化偶联各种凝集素的琼脂糖凝胶 FF 的亲和色谱填料可以分离各种糖蛋白，例如 Con A 琼脂糖凝胶 FF 可以纯化糖基化的蛋白，或者膜组分，甚至细胞等物质。此外硼酸琼脂糖凝胶 FF 也用来分离各种多糖和糖蛋白，其原理是苯硼酸类似于凝集素可以和各种糖基上的邻二羟基发生亲和作用。5. 膜蛋白分离有比较强的疏水性，可以用苯基或丁基琼脂糖凝胶 FF 疏水色谱分离，如果是有糖基结构或者受体等，也可以用亲和色谱的方法。6. 纯化抗体和抗原蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 可以用于分离纯化各种来源的抗体，包括抗血清、培养液以及腹水等样品。蛋白 A 可以特异吸附 IgG 的 Fc 区，所以它也适合分离酶解后的Fc 片段，把 Fab 片段和 Fc 段分离。同时蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 也可用于血清中IgG 的分离，得到不含抗体的血清，蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 有很好的稳定性，能耐受 37 度 3-5 天而对柱子的性能没有影响，是分离抗体的最佳选择。疏水色谱色谱填料苯基琼脂糖凝胶 FF 以及 DEAE 琼脂糖凝胶 FF 也场用于抗体的分离，只是特异性不如重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 好。纯化 IgG 抗原最有效的办法是免疫亲和，具体的方法是把抗抗原的 IgG 直接偶联到环氧活化琼脂糖凝胶 FF 上，然后直接高 pH 吸附，低 pH 洗脱就可以得到需要的抗原。对于高亲和力的抗体筛选，特别是小分子的半抗原，我们建议可以把半抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶 FF ，把只和抗原结合的 IgG 分离，得到高亲和力的抗体，非常方便和实用，此外也可以选择氨基化琼脂糖凝胶 FF 或羧基化化琼脂糖凝胶 FF偶联半抗原，特别是对那些不适合用环氧活化琼脂糖凝胶 FF 偶联的半抗原。如果要偶联的是小分子的物质，需要用 11 个碳原子亲和手臂的活化好的填料，这样才能克服空间位阻得到最佳分离效果，如果是大分子的物质，那最好用 3 个碳原子亲和手臂的活化好填料就可以，这样栽量高，效果好。IgM 和 IgY 可用吡啶琼脂糖凝胶 FF 亲和的方法把它们和杂蛋白分离。7. 纯化重组蛋白重组蛋白构建已经考虑到纯化的问题，大大简化了纯化的步骤，但还是会遇到些实际的问题，所以需要详细阅读使用说明和注意事项。( 一 )HIS 标签重组蛋白可以很方便用镍琼脂糖凝胶 FF 分离，色谱填料已经螯合好了镍离子，使用非常方便，吸附载量更高，特异性更强，可以选择多种洗脱方式，是纯化这类融合蛋白的最佳工具。( 二 )ST 融合蛋白在表达时同时表达了谷胱甘肽 s 转酶，很方便用 GST 琼脂糖凝胶 FF 分离，然后再用肠激酶或凝血酶等酶解就得到表达的产物。而凝血酶可以用肝素琼脂糖凝胶 FF 或苯甲脒琼脂糖凝胶 FF 分离。( 三 ) 蛋白 A 融合蛋白可以用 IgG 琼脂糖凝胶 FF 分离。( 四 ) 涵体蛋白的色谱复性 : 离子交换和疏水色谱都在包涵体复性中有很好的效果，金属螯合色谱填料等亲和色谱填料也常用于带 HIS 标签融合蛋白的色谱复性。

一、基本知识和种类电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动，只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素。1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂，价格昂贵难于普及。1940年左右，以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。电泳技术以支持物分，可分为：纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；用高压电泳和层析结合研究核酸的一级结构。凝胶龟泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。二、影响电泳的因素不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。影响泳动度的主要因素有：1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。2、电场强度电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特，则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳，前者的电压在100-500伏特，电场强度一般是2-10伏特/厘米；后者电压可高达500-1000伏特，电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。3、溶液的pH值溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电泳速度越快；反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋 白β球蛋白>γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。同 时，为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。4、溶液的离子强度溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散，高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄细的电泳区带。离子强度很高时要用低电压，避免过多产热，这样又导致长的电泳时间，以致增加变性和区带分离困难。5、电渗作用在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在pH8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时，γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用 小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。

培养基的灭菌及使用1.每次配置时，要注意其生产日期是否在保质期内，查看其开瓶日期及瓶口密封性，保证其未变质，并且未吸潮。2.培养基配置时，称量要准确，包括盐水的分装要准确。3.一定要保证现配制现灭菌，未灭菌的配好培养基不能长时间放置，更不可隔夜。4.灭菌时要保证恒温、恒压，同时要保证有效灭菌时间。5.灭菌过的培养基要冰箱保存，可保存一周，一般不超过 3 天。而且要遵循“先入先出”原则，先配制的要先使用。6.在使用时，要根据当班次的使用量，用水浴锅先将培养基溶化为液态，然后及时调低水域温度（先化好的可从水域取出，放在水浴锅锅盖上）待用，千万不可长时间使培养基处于高温状态。7.做产品微生物检测时，倾倒培养基温度在 45℃左右，不可过烫，避免将菌烫死；也不可过凉，化好的培养基又结块凝固，不便于观察结果。8.每瓶培养基均要做空白。9.尽量集中做样，避免频繁打开同一瓶培养基瓶塞，增大培养基的污染几率，出现误差结果。10.培养基剩余过少时，可先将其倾倒成空白用板。做样环境的维持一、大环境（房间）1.做样时，窗户和空调要关闭，或用酒精对房间进行喷雾消毒，避免房间内空气流通影响超净台内部环境（最好在有通排风系统的恒温恒湿无菌间进行操作）。2.如果在原来的原料微生物检测室进行做样，要定期开启紫外灯，对房间进行杀菌。二、小环境（超净台）1.定期清洁初效过滤器，要及时更换。2.做样前，将超净台内部进行清洁，用 75%酒精进行擦拭消毒，并提前半小时将超净台紫外灯打开，对超净台内部环境进行杀菌。3.关紫外灯，开风机，调整合适进风量，风量不可过低。4.每次做样后，要对超净台内部进行清理、清洁，并用 75%酒精进行擦拭消毒。5.紫外灯根据其使用寿命要及时更换。6.做样同时，要做上相应菌落检测的环境空白。7.做样区域的选择：①一般在距离超净台外沿的 1/3-2/3 区域进行无菌操作；②要在酒精灯火焰的外焰保护区域进行操作。工器具的洁净度1.玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌。2.做样用剪刀、勺子等物品要做到做样专用，不可与其它操作器具混用，使用时，先用75%酒精消毒，再采用灼烧方式进行灭菌。3.接种针（环）采用灼烧方式进行灭菌，但要注意做样时要先将接种针（环）进行冷却。样品的采集及检测一、保证采样器具的无菌性1.玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌，保证恒温、时间足够（但不可时间过长，导致玻璃器皿易裂纹而报废）。2.取样筐：使用前要用 75%酒精进行喷洒消毒3.取样勺、浓奶取样提子：要保证其清洁消毒，清洁后用 75%酒精进行擦拭消毒。4.取样袋：可现用酒精进行擦拭消毒，再在超净台用紫外灯照射消毒，（包装车间要在传递窗用紫外灯照射消毒）。5.电子称表面用 75%酒精消毒。二、人员操作1.保证手部的清洗、消毒：取样前及做样前都要先洗手再消毒。2.取样要具有代表性（随机样、目的样、综合样）且要标示清楚。3.取样完毕，不可在车间逗留，要及时将样品放入超净台，对其外表面进行紫外灯照射消毒。4.在要求的做样区域进行操作。5.做样前，要用 75%酒精棉球对样品袋口部进行擦拭消毒，再开口。6.往盐水瓶加样品时，要注意勺子或袋子尽量不接触瓶口。7.样品计量要准确，稀释倍数也要准确（1mL 吸管不允许将管口敲掉），进行 100 倍稀释时，1mL 吸管要伸入盐水中，不可以将样品管壁流下去，同时要避免将管底部捅破。8.盐水温度以 40℃左右为宜，不能过热，将部分微生物烫死，也不能温度太低，不能将奶粉溶解完全。9.进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性。10.倾倒平皿时，要注意培养基瓶口不要接触到平皿；倾倒的培养基要适量，不可以太少，在培养过程中干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右为宜。11.做大肠菌群样时，要提前将乳糖胆盐培养基培养管按需要量备好，放入超净台对外表面进行紫外线灭菌。12.接二步时，要注意先将接种针（环）进行冷却，避免出现接不上菌落的情况发生，导致无法判断、确认。13.做样完毕，及时放入相应培养箱进行培养，并清理清洁超净台。微生物检测时的一些注意事项！微生物的培养1.在培养过程中，要随时监控培养箱温度，保证其在适宜的温度进行培养。2.要按照《微生物检验规范》要求及时观察结果，出现异常，要及时分析原因进行反馈。

DNA的不同提取方法及比较传统的DNA提取方法传统的DNA 提取与纯化,如 CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯/酚氯/仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。 CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯/仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、lv仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的应用受到一定的局限性。DNA提取新方法近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA 。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将CTAB 液提取和氯/仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g 。张博等用硅珠(SiO2) 颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品 。黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和PCR 扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,还有高通量的DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301 ,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48 个甚至192 个。美国应用生物系统公司6100 型核酸提取仪,可用于RNA、DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96 个样品。

细菌培养的基本条件：细菌实验室是检验主管技师/考试辅导的部分内容，以下是远慕生物的整理，希望对大家有所帮助：细菌实验室是进行细菌学实验的场所。标本的接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。所以细菌室应该符合一定的条件。1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min.对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。

实验概要速冻，是将样品快速用干冰或液氮保存于-70°C或更低的温度中。速冻能够达到和缓慢控速冷冻相同的目的，效果大约为  -10-1000°C/min，但达不到-1°C  /分钟。用CoolRack?液速冻样本能够保持样本体积的稳定、组织结构完整、恒定的冻结参数，快速免提样本是能避免丢失或污染的样品。在预冷CoolRack的前提下进行速冻，这能确保传热快。这种方法可以提供优良的标本的完整性和各类分析选择，包括在研究和诊断中蛋白质、DNA和RNA的提取。本实验提供长时间冷冻细菌的常规方法。主要试剂细菌样品冷冻保护剂TrueCoolTM冷冻管主要设备CoolBoxTM CFT30CoolRack? CFT30CoolRack?的CFCryolabels和/或cryomarkersThermalTrayHP平台（可选）CoolSinkTM BX50（可选）37℃水浴锅-80℃冷冻冰箱 实验步骤细菌样品的准备遵照细菌的生长和制备实验室的方法。参照CDC（疾病控制和预防中心）的指导方针，特定病原体利用BSL标准（生物安全等级）。病原体具有传染性，应在一个可控和安全的环境中操作。细菌冻结1．一般规则情况下，将制备的样品保持在4°C。2．将准备好的细菌样品中加入无菌甘油，使得样品中甘油浓度为15-50％V/V。然后取1mL（或所需体积）分装于预先标记的TrueCool冻存管中。为了避免降低滴度，减少滴度将冻存管保持在CoolBox里CoolRackCFT30中，维持4°C。  CoolRackCFT30能降低由于单手开关瓶盖，造成的污染和泄漏事故。3．当细菌样品在CoolRackCFT30维持4°C时，将 CoolRackCF于干冰上平衡10分钟。4．将冷冻样品转移到一个储物盒，并放置在-80°C冰箱长期存放。细菌解冻1．将冷冻样品从-80℃冰箱中拿出，放置于-12°C 的CoolBoxCFT30冷冻墨盒里，这样可以保持合适的温度和安全的传递样品。2．将冻存管放置在37℃水浴瓶中，慢慢幌动小瓶，使其冻融。在整个液体完全解冻前，将冻存管从37°C水浴瓶中拿出放在一个已经在冰上平衡过的CoolRackCFT30上。样品准备好可供实验。

　　常用标准溶液(水溶液)的配制和标定　　1 标准溶液的标定　　用优级纯以上的酸、碱或强溶解性的相应盐类等基准物质,用双重蒸馏去离子水溶解于容量瓶中,并定容至所需的贮备溶液,浓度为(mol/L),并按要求选取洁净容器盛装,贴好标签,按规范要求贮存。　　2 标定物质　　应选用基准物质的纯试剂作为标定物质,标定前应干燥至恒重,并准确称取。　　3 标定过程　　标准溶液在标定过程中,严格执行2人双平行标定,用精确的标定物,对标准溶液进行标定、计算,在误差很小,数据又相当接近的情况下,则取平均值为该标准溶液的浓度。　　4 标定时间　　常温下1.000mol/L及以上浓度贮备液,应每2a标定1次；0.5000mol/L浓度贮备液,应每1a标定1次；0.1000mol/L浓度贮备液,应每6个月标定1次；低于0.1000mol/L浓度的应用液,应每3个月标定1次。　　注意事项　　自配制的标准溶液作为工作标准溶液的,一般用于日常检验分析,不用于其他具有法律效应的检测结果。除非能够证明其作为测量参考标准的性质不会失效。有机溶液的标准物质在贮存过程中,应避免标准溶液与塑料胶木瓶盖直接接触。对使用量较大的自配的标准贮备原液,必要时与有证的、并在有效期内的标准物质进行比对,避免发生化学变化,以确保自配标准溶液量值的准确性。

想要研究蛋白质，首先要得到高度纯化且具有生物活性的目的物质，因此，蛋白样品的制备是重要前提。蛋白提取的质量和效果对后续的研究分析有重要影响。不同种类的样本在制备过程中，存在一些差异，要根据样本特征调整实验方案和操作细节。基本原则样品处理尽量简单，减少蛋白损失；尽量避免蛋白的降解；尽可能提高样品蛋白的溶解度；防止溶液介质中对蛋白质的人为修饰；去除非蛋白杂质。制备过程蛋白质的制备一般要经过以下四个阶段：选择材料和预处理，材料的破碎，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。由于蛋白种类繁多，性质差异较大，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。根据性质进行分类，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。制备原理蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、 pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。①温度：多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。②pH：蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的 pH值应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。③离子强度：稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCl 等中性盐，一般以 0.15 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用 0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。制备方法破碎的方法有许多种，可归纳为：机械法（超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法和玻璃珠破碎法），化学法（去污剂法、酶裂解法、），物理法（循环冻融法、渗透法、高压法）。这些方法有不同的应用范围，基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性，这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。而常用的方法有：超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法、盐析、沉淀法。其中，有机溶剂沉淀法使用较为普遍，常用的有机溶剂有丙酮、苯酚等。冷丙酮沉淀丙酮和苯酚沉淀法注意事项：1.冷丙酮沉淀的时间与温度。常温或升温时，蛋白立体结构展开，丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结舍导致蛋白变性，所以我们通常预冷丙酮并且低温操作。2.超声功率和时间，重在观察超声后样品溶性的均匀度。3.一般和三氯乙酸一起使用，效果更好。4.还原烷基化。苯酚提取1.各种试剂的正确及精确配制。（如：煎糖提取液）2.加入饱和酚后要充分震荡和离心。（使蛋白充分与酚、色素H键结合，让其分三层）3.需纯化蛋白。（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等杂质）注意事项1.在蛋白质制备过程中使组织始终置于冰上，离心机、离心管等仪器设备要提前预冷，以防蛋白质的降解。2. 要加入适量的裂解液，裂解一定要充分，均匀。3. 植物和动物组织样本一般采用研磨或匀浆机破碎处理，细胞和菌体样本一般采用超声破碎，破碎过程中要避免材料的融化。4. 对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存（－80℃），对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。5. 对于样本量需求少的研究，且组织样品本身非常细小，可直接裂解，减少蛋白损失。

分析其实也属于技术的一部分，且在蛋白质组学研究中显得尤为重要，因为蛋白质组学研究提供的数据是生物学上最庞大的，而且蛋白质组比基因组具有更大的复杂性，因此蛋白质组信息学更有挑战性。今天小编先抛砖引玉地介绍几个常用的分析方法和软件。蛋白质定性分析蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。目前，bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。根据使用仪器可分为：MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS根据样本类型可分为：蛋白质全谱分析（即shotgun分析） 、蛋白质胶条/混合液分析、蛋白质胶点分析蛋白质全谱分析定义：蛋白质全谱分析也可称为质谱shotgun分析，是指组分分析，能够鉴定出尽可能多的肽和蛋白质分子。原理：将溶液内蛋白质分子或SDS-PAGE条带的复杂混合物酶解成肽段混合物，通过液相色谱分离。串联质谱测试，最后用相应的数据库进行检索匹配，可同时鉴定成百上千种蛋白质。主要应用于某一生理状态下组织、细胞或者细胞器中所有表达蛋白质的鉴定。蛋白质胶条/混合液鉴定定义：利用LC-ESI-MS/MS蛋白鉴定技术对胶条样本（即SDS-PAGE样本）、IP、Co-IP、Pull-down等纯化溶液等中等复杂样本进行蛋白鉴定。原理：利用电喷雾（ESI）技术将样品以离子化的方式从液滴表面蒸发，进入质量分析器。主要应用于蛋白质或多肽鉴定。蛋白质胶点鉴定定义：利用MALDI-TOF/TOF蛋白鉴定技术对考/银染的2D或DIGE胶点样本或者较纯的蛋白样本进行蛋白鉴定。原理： MALDI-TOF/TOF（Matrix – Assisted Laser Desorptiob/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）MALDI的原理是将样品均匀包埋在基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，从而检测离子。 也主要应用于蛋白质或多肽鉴定。蛋白质相对定量分析相对定量的目的是测定目的蛋白在两个或多个样本中的表达量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的表达量。例如，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的蛋白浓度为100%，经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的蛋白含量相对于未处理样品的百分比。蛋白质绝对定量分析目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学研究主要是指靶向蛋白质组学。靶向蛋白质组学分析，是指对目标蛋白质（或修饰肽段）进行定性和/或定量分析，或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法，由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势，在相关研究领域已逐渐受到越来越多的关注和应用。其技术方法经历了从传统的SRM/MRM（选择性/多反应监视，selected / multiple reaction monitoring）到PRM（平行反应监视，parallel reaction monitoring）的发展历程。绝对定量蛋白质组学应用方向： 验证定量蛋白质组学结果、验证翻译后修饰蛋白质组学结果、 目标蛋白质绝对/相对定量分析、诊断标志物靶向筛选、诊断标志物验证与绝对定量、验证基因表达产物。PRM定义：PRM是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行绝对定量。原理：首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中（Q1）选择性地检测目标肽段的母离子信息；随后在collision cell中对母离子进行碎裂；最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。蛋白质翻译后修饰分析翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程，通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，可以改变蛋白质的理化性质，进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用。许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制，更重要的是受到时空特异性和翻译后修饰的调控，揭示翻译后修饰的发生规律是解析蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。常见的翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等等。修饰蛋白质组学：质谱是鉴定蛋白质翻译后修饰的重要方法，其原理是利用蛋白质发生修饰后的质量偏移来实现翻译后修饰位点的鉴定；同时，由于翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广，检测前需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集，然后再进行质谱鉴定。蛋白质组学生物信息学主要内容：蛋白功能注释：亚细胞结构定位、GO分类、KEGG通路途径、蛋白结构域、KOG/COG分类、FunCate2分类。功能富集分析：使用费歇尔确切检验方法，描述特定属性蛋白群体（差异表达的蛋白、发生修饰的蛋白等）潜在调控的生理过程。分析包含：GO分类富集、KEGG通路富集、蛋白结构域富集、蛋白复合物富集。功能富集聚类分析：使用分层聚类的方法，研究不同实验处理条件下对特定属性全蛋白群体调控生理过程的影响。表达模式聚类分析：使用Mfuzz聚类方法对蛋白在不同处理条件（不同处理时间或药物浓度）下表达谱的聚类分析。直观的反应出处理时间或药物浓度与蛋白表 达水平的关系。对得到的不同表达模式分类可以做进一步的功能富集聚类分析，揭示药物潜在作用的蛋白与生理功能。修饰位点motif分析：分析翻译后修饰位点附近氨基酸分布情况，预测潜在与该种修饰类型相关的保守序列区间。通过与蛋白结构域的联系，为研究该种修饰类型作用和调控机制研究提供参考依据。

目的研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT- PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。主要试剂Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。1. Trizol试剂含有苯/酚，具有毒性和刺激性，注意操作。2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意配带手套，样品尽可能盖严；3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。2-8℃ 避光保存一年。准备工作RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴2.手套RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。处理的步骤如下：在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为 0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中 37℃ 或室温下处理过夜。将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸 汽灭菌至少30分钟。灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。（2）玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。DEPC(二乙基焦碳酸酯)DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨/水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。实验步骤如下：1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。2. 将匀浆室温放置5 min。3. 加入200 μl 氯仿,剧烈震荡混匀 30s，冰上静置3 min。4. 12000 rpm，4℃ 离心15 min。5. 将上清液小心转移到新的 1.5 ml离心管中（取400 μl ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）6. 12000 rpm， 4℃ 离心15 min 。7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。8. 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700 μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）9. 8000 rpm，室温离心10min。10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。11. 真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68 ℃处理10 min。13. RNA检测(1) 测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280 在1.8-2.0 。(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。低得率 A．样品裂解或匀浆处理不彻底B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A280 A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而 是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。B．样品匀浆时加的试剂量太少。C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。D．水相中混有有机相。E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解 A．组织取出后没有马上处理或冷冻B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存。C．细胞在胰酶处理时被破坏。D．溶液或离心管未经RNase去除处理。

实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯/酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯/酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯/酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。试剂和器材一、试剂0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨/水；0.1M硝酸/银。酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。三氯/化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯/化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl。苔黑酚(3,5-二羟基甲/苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。定磷试剂：17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。二、材料干酵母粉。三、器材移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴锅；离心机。操作方法一、酵母RNA提取称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入 10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。再用乙mi洗涤沉淀一次后，用乙mi将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：二、RNA组份鉴定取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1．嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨/水。然后加入1mL 0.1M硝酸/银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。2．核糖：取水解液1mL，三氯/化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。3．磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

　　做ELISA实验，有几种常见的实验方法，他们分别是竞争法、捕获法、间接法、夹心法、而夹心法又可以分为双抗体夹心法和双抗原夹心法！在今天的文章中，远慕生物将详细得跟大家讲述竞争法的实验原理！　　竞争法一般分为直接竞争法和间接竞争法，这里我们以直接竞争法为例进行原理讲解。直接竞争法，其基本原理是：将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品（样本）和生物素标记的抗原物质进行竞争结合，经合适的温度和一定时间的孵育，洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素进行反应，TMB显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。　　该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质，当然，这种方法也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。这种方法在检测抗体时，可能由于两种竞争的抗体来源不一，导致两种抗体趋同性不高，就使得检测结果的可靠性不高。　　当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。　　实验步骤　　以稀释液将待检标本做适当稀释（预试中确定）加入包被有已知抗原的酶标板中（50ul/孔），加封口胶带于37℃作用30min。　　2.  弃反应液，以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。　　3.  加入酶标抗体（浓度在预试中确定）。加封口胶带后于37℃作用30min。　　4.  重复第2步。　　5.  加底物（浓度在预试中确定），加封口胶带后于室温下避光作用5-60 min，其间不时观察，显色满意后加终止液50ul/孔。　　6.  于酶标仪测定OD值，OPD用492nm测定，TMB用450nm测定。　　注意事项　　每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照（以PBS代替标本），后者为本底值，在分析实验结果时应扣除本底值，阳性对照　　2.  一般认为小分子抗原宜用本法检测，而大分子抗原则宜采用夹心法检测，但具体宜采用哪种方法应根据试验决定，本发与夹心法相比在操作上减少一步。包被抗体与酶标抗体如果分别采用单克隆抗体和多克隆抗体时，宜用单克隆抗体作为包被抗体，以多克隆抗体作为酶标抗体。　　3.  血清标本中抗原浓度一般较低，故一般用原倍标本进行检测，必要时可进行稀释测定，但应重新摸索酶标抗原的浓度，以确保方法的灵敏性。　　4.  以酶标记抗原的方法同酶标记抗体。　　5.  其它注意事项同酶联免疫间接法。

对培养的NK细胞不满意，是培养基的问题，还是试剂盒的问题？关于NK细胞培养的问题，不能只认为培养基不好或试剂盒不好，很多客户在培养过程中遇到接种密度的问题、补液程序的问题、血浆问题以及样本的问题，所以影响NK细胞培养效果的因素非常之多，下面远慕生物为大家进行排查。1、血液样本问题首先确认样本的状态，理论上来讲外周血样本应在抽取的6个小时内进行细胞分离，这个时段细胞是处于最好的状态，所以培养前请确认样本是否新鲜，以及血液是否出现溶血现象血液样本保存时间过长，会导致单核细胞无法成功诱导激活。血液如在运送过程中溶血，则可能导致血浆分离出现问题，无法后期培养添加。如用冻存的单个核细胞复苏培养，请确认复苏单个核细胞的活率及状态。2、接种密度问题请确保接种的密度在1.5-2x106cells/m L，过低密度会导致细胞前期增殖缓慢，无法达到补液要求。3、血浆的处理及添加方式（1）血浆必须要56℃灭活30min，除去多余的纤维蛋白，如有可能冷冻后离心，保证细胞培养时添加的血浆不会有纤维蛋白析出粘连正常细胞。（2）如有可能有更多剩余的血浆，可在后期补入，对于有些状态较差的样本会有更好的培养效果。4、补液原则问题NK培养受样本差异性影响会很大，所以没有一个固定的补液程序可以指导各种不同的样本。有的样本激活迅速，生长快速，补液就相对容易，也更好扩增，可有的样本前期就长的较慢，如遇到肿瘤患者晚期年老的病人，更是难上加难，所以针对不同的样本，我们应该有不同的应对原则：（1）首先7天以后的补液原则是补液后细胞密度应在0.5-0.8x106cells/m L，如密度达不到，请延迟一天后再进行补液，否则当你细胞补液密度过低时，好的样本可以长起来，那差的样本就会逐渐凋亡，无法继续培养。（2）对于差的样本，适当增加血浆的添加次数，可以得到更好的效果，比如标准程序需要加3-4次血浆，那么有可能的话你可以加到5次。5、操作原因（1）补液培养基的温度培养基补液前应提前预温，过冷的培养基会导致细胞应激反应，出现絮状物；（2）培养箱环境的剧烈变化培养箱异常，温度及二氧化碳浓度变化较大会导致细胞死亡，出现絮状物；（3）细菌、真菌、支原体污染受到细菌、真菌、支原体污染的细胞生长非常缓慢，甚至不生长；（4）因子试剂盒经过了反复的冻融反复冻融会大大降低因子的活性，激活、诱导、扩增等环节都会出现问题，达不到最优的效果。

⒈光合菌群： EM菌液中的光合菌群（好氧性和厌氧性）属于独立营养微生物，它能利用土壤接受太阳热能或以紫外线为能源，将土壤中的硫化氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸、维生素类、氮素化合物和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。光合菌的代谢物质或者被植物直接吸收，或者成为其它微生物繁殖的养分，光合细菌如果能够增殖，其它的有益微生物也会增殖。⒉乳酸菌群： 乳酸菌（厌氧型） , 它以摄取光合细菌酵母菌产生的糖类等物质为基础，产生乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质转化成对动植物有效的养分。乳酸菌还能有效抑制连作障碍产生的致病菌增殖。⒊酵母菌群： 酵母菌（好氧型）利用氨基酸、糖类及其它有机物质，通过发酵，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌在 EM 集团军中对于促进其它的有效微生物增殖所需要的基质（食物）的生产提供重要的营养保障。此外，酵母菌生产的单细胞蛋白是动物不可缺少的有效养分。⒋革兰氏阳性放线菌群（好气性）。 它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、 维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和 VA 菌根菌增殖。⒌发酵系的丝状菌群（嫌气性）。 以发酵酒精时使用的曲霉菌属为主体，它能和其他微生物共存，尤其对土壤中酯的生成有良好效果。因为酒精生成力强，能防止蛆和其他害虫的发生，并可以消除恶臭。由上可见，各类微生物都各自发挥着重要作用，核心作用是光合细菌和嗜酸性乳杆菌为主导，其合成能力支撑着其他微生物的活动，同时也利用其他微生物产生的物质，形成共生共荣的关系，保证 EM菌液状态稳定，功能齐全 ，发挥出集团军作战的强大能量。 EM菌液的主要功能是造就良性生态。只要施用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，清除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，形成适于动植物生长的良好环境，同时，它还产生大量易为动植物吸收的有益物质，如氨基酸、有机酸、多醣类、各种维生素、各种生化酶、促生长因子、抗生素和抗病毒物质等，提高动植物的免疫功能，促进健康生长，从而在减轻劳动、降低成本、提高产量、改善品质，提前上市，使人们吃（用）上无污染的高质量产品的前提下，提高全社会的生产水平和生活质量，保护地球环境和人类美好的家园。

　　原代细胞因它可以模仿人体的新陈代谢逐日成为科研学者青睐的研究工具，但是原代细胞曾是出了名的难培养，需要耗费大量的时间、成本和资源。即使细胞捱过了极其严苛的解离步骤，但污染仍然是一个隐患，有可能让几天的成果化为乌有。此外还存在其他细胞污染、生长缓慢以及数量有限的问题。　　细胞系因容易培养且产量可观而成为研究首-选。然而，它们并不完-美。细胞系会不断突变。连续传代导致它们的基因型和表型发生变化。有时候，它们已经变得面目全非。一个研究小组曾经发现，HEK293细胞系的腺病毒转化产生的细胞更接近未成熟神经元，而不是人胚肾细胞。　　于是hTERT、PSC和iPSC来源的永生化细胞应运而生，他们 并不是真正的原代细胞，但是他们却能表达出大部分原代细胞应有的特性例如：强制表达hTERT让原代细胞能维持足够的端粒长度，避免增殖性衰老。hTERT诱导的原代细胞不但具有连续传代的能力，而且没有染色体不稳定性。这种细胞可以扩增，也可以冷冻、保存和解冻，以适应实验的时间安排，但是它只是延缓了细胞的衰老，增加了传代的次数，并不是表示细胞可以像hela一样“长生不老”。　　PSC和IPSC也是一样的，PSC的真正价值在于能够从一种细胞分化成多种细胞类型。iPSC让研究人员能够采集轻松获取的细胞，并将它们转变为不易获取的细胞，但是预实验和验证实验结果一般建议使用原代细胞，因为没有经任何修饰的细胞才能得到实验最为精确的数据。

液相色谱对于很多人来说都是很好上手的仪器了，是属于“易学难用”的仪器，有些经验丰富，用了好几年的分析员们也会习惯于一些错误操作，引发出一些仪器的故障。液相色谱最常见的故障就是“堵”和“漏”，那么接下来远慕就以这两点来分别说明。堵“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，最主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。“堵”的原因1、配制流动相时细菌污染首先，我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。这里有两种方式推荐：（1）最理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。唯1的缺点就是价格不菲。（2）成箱购买市售品牌纯净水，如，500mL一支的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌/平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可，也很方便。每次成本2元左右。这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到最后有一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。原因有以下三点：（1）流动相过滤在理论上有好处，但是，实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。（2）流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。最主要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本。（3）流动相过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗，晾干的过程，至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。（4）在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6年时间没有做过流动相过滤的工作，但是和国内同行相比较，在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。2、使用流动相时的细菌污染流动相刚开始没有长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。让我们举个例子：50％的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好的实验效果。但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌（很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是优质肥料，细菌长得更迅速），一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，我建议用10％的甲醇水代替纯水溶液（以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5％就基本可以抑菌，在10％及以上就可以完全杀菌了），这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。3、不适当操作：（1）在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。（2）样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形成阻塞不畅。（3）在使用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成了死堵，压力快速升高超过警戒值。（4）在使用金属管路作出废液管时，应当注意最好废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且实验使用较高浓度的缓冲盐溶液，在停机时可能在出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。漏液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生了漏液，那就是故障所在。漏液的原因分两种：（1）接触硬件不当在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选用PEEK接头是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松；另一种不当就是致命的错误：滑丝，这是往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。（2）使用仪器不当如果是输送泵漏液，最常见的原因就是在活塞位置缓冲盐析出造成。析出的原因有两个，一是使用缓冲盐溶液时突然加入了纯甲醇而析出，这种错误很容易避免，这是尽量不要用纯的甲醇和纯水。只要互相有10％的比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲盐溶液（不论甲醇含量有多少）作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。 

细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术。细菌在自然界中分布极广，数量大，种类多，它可以造福人类，也可以成为致病的原因。大多数细菌可用人工方法培养，即将其接种于培养基上，使其生长繁殖。培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。细菌培养是一个复杂的技术。一、培养条件编辑培养时应根据细菌种类和目的等选择培养方法、培养基，制定培养条件（温度、pH值、时间，对氧的需求与否等）。一般操作步骤为先将标本接种于固体培养基上，做分离培养。再进一步对所得单个菌落进行形态、生化及血清学反应鉴定。培养基常用牛肉汤、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、血液等和某些细菌所需的特殊物质配制成液体、半固体、固体等。一般细菌可在有氧条件下，37℃中放18～24小时生长。厌氧菌则需在无氧环境中放2～3天后生长。个别细菌如结核菌要培养1个月之久。二、注意点由于细菌无处不在，因此从制备培养基时开始，整个培养过程必须按无菌操作要求进行，否则外界细菌污染标本，会导致错误结果；而培养的致病菌一旦污染环境，就会引起交叉感染。以疾病诊断为目的进行的培养，要选择合适的标本（血、尿、便、脓液、分泌物等），并应结合临床情况解释所得结果。三、具体培养步骤以光合细菌培养方法为例。光合细菌培养的方法，按次序分为容器、工具的消毒，培养基的制备，接种和培养管理四个步骤。（一）容器、工具的消毒。（二）培养基的制备1．培养用水如果培养的光合细菌是淡水种，菌种培养可用蒸馏水，生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制。如果培养的光合细菌是海水种，则用天然海水配制培养基，注意在海水中加入磷元素时，不能用磷酸氢二钾，应用磷酸二氢钾，不然会产生大量沉淀。2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌。小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用。3．培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方。按培养基配方把所需物质称量，逐一溶解，混合，配成培养基。也可先配成母液，使用时按比例加入一定的量即可。（三）接种培养基配好后，应立即进行接种。光合细菌生产性培养的按种量比较高，一般为20%～50%，即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4～1∶1，不应低于20%，尤其是微气培养，接种量更应高些，否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势，影响培养的最终产量和质量。（四）培养管理光合细菌的培养过程中，管理工作包括日常管理操作和测试，生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面。4、日常管理和测试（1）搅拌和充气：光合细菌培养过程中必须充气或搅拌，作用是帮助沉淀的光合细菌上浮获得光照，保持菌细胞的良好生长。小型厌气培养常用人工摇动培养容器的方法使菌细胞上浮，每天至少摇动三次，定时进行。大型厌气培养则用机械搅拌器或使用小水泵使水缓慢循环运转，保持菌体悬浮。微气培养是通过充气帮助菌体上浮，因为培养液中溶解氧含量增加，光合细菌繁殖受到抑制，产量下降，所以必须严格控制充气量。一般采用定时断续充气，充气量控制在1～1.5升/（升·h）之间，溶解氧量保持在1×10-6以下。（2）调节光照度：培养光合细菌需要连续进行照明。在日常管理工作中，应根据需要经常调整光照度。白天可利用太阳光培养，晚上则需要人工光源照明，或完全利用人工光源培养。人工光源一般使用碘钨灯或白炽灯泡。不同的培养方式所要求的光照强度有所不同。一般培养光照强度应控制在2000～5000lx之间。如果光合细菌生长繁殖快，细胞密度高，则光照强度应提高到5000～10000lx。光照强度可通过调整培养容器与光源的距离或使用可控电源箱调节。（3）调节温度：光合细菌对温度的适应范围很广，一船在23～39℃的范围内均能正常生长繁殖，可不必调整温度。在常温下培养也可通过调整，将温度控制在光合细菌生长繁殖最适宜的范围内，使光合细菌更好地生长。（4）酸碱度的测定和调整：在培养光合细菌的过程中，必须注意酸碱度的变化。由于光合细菌的大量繁殖，菌液的pH值上升，这意味着光合细菌正处于指数生长期。但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时，光合细菌的生长达到顶点，随后生长下降。如果能及时调整菌液的酸碱度，使pH值保持在最适范围，则光合细菌能继续生长繁殖。为了延长光合细菌的指数生长期，提高培养基的利用率和单位水体的产量，测定和调整PH值是非常重要的。一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度，醋酸、乳酸和盐酸部可使用，最常用的是醋酸。在日常的管理工作中，必须每天或隔天测定菌液的pH值，当pH值上升超出最适范围，即加酸调整。如果在培养过程中不测定、调整酸碱度，当光合细菌的生长达到一定密度后pH值也上升到9以上，细菌生长受阻，此时应采收或再扩大培养。在培养过程中不调整PH值，获得的最终产量低。5、培养成败的标准编辑生长情况的观察和检查光合细菌生长情况的好坏是培养成败的标准。在培养过程中，可以通过观察菌液的颜色及其变化来了解光合细菌生长繁殖的大体情况，菌液的颜色是否正常，接种后颜色是否由浅变深，均反映光合细菌是否正常生长繁殖以及繁殖速度的快慢。必要时可通过显微镜检查，了解情况。6、问题的分析和处理编辑通过日常管理、检测、检查，了解光合细菌的生长情况，就可以结合当时环境条件的变化进行分析，找出影响光合细菌生长繁殖的原因，采取相应的措施。影响光合细菌生长的原因很多，内因是菌种是否优良，外因是光照、温度、营养、敌害和厌气程度等。温度、光照和pH值都能影响着光合细菌的生长，而且温度、光照和pH值之间是互相制约的，温度与光照的强弱是对立统一的，所以光合细菌生长的最适条件应是互应的，即温度高，光照应弱；温度低，光照应强。如果是温度高，光照强，pH值就会迅速升高，培养基产生沉淀，抑制光台细菌的生长；如果温度低，光照弱，光合细菌得不到最佳能源，生长速度也慢。经试验得出光合细菌生长的最适条件是：①温度15～20℃时，光照30000～50000lx，培养基pH值为7.0；②温度25～30℃时，光照为3000～5000lx，培养基的pH值为7.0。

在讨论无菌取样的原因和采集方法之前，必须要理解“无菌的”的这一术语， “无菌”一般用于取样中，意味着取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。无菌样品的采集基本是为了支持、针对工厂的卫生条件状况的检查结果。检验前的准备工作1．包装无菌取样的工具：拥有正确的采取产品或加工过程的无菌取样器械工具是至关重要的。除非使用合适的采集工具，否则样品的完整性会被怀疑，甚至样品毫无意义。为了避免没有合适的取样工具，建议建立一个无菌取样的分析清单，来收集取样工具。如果可能盛样品的容器在最初进入加工区之前应当被预先标识，像样品号、取样日期、取样人等。这样可以使在不同的工厂条件下的样品取样更为方便一些。附加样品号码一般在样品采集中被正式确定下来，因此不用预先标明。人员的工具设施，象工作服、发网或消毒处理过的清洁的鞋靴必须具备有助于证明采集者没有污染到食物产品或样品。2．生产线样品 In-Line Samples：生产线样品一般是指原材料，原料生产用水、包装材料或其他任何使用在生产线的材料。生产线样品的采集一般用来确定细菌污染源是否来自于原材料或加工序中的某些地方。3．环境样品：环境样品用细菌拭子，（注：细菌拭子样品不能给出/测出微生物的定时结果，因为样品非常小，显著微生物会经常丢失），棉拭子的取样部位一般来自于食品接触面，地板喷溅物。墙壁、顶部管道和检验中考察的其他潜在污染源程序，并且记录可能的联系，在环境样品来源和食物产品的污染方面，可以使样品具有意义，并且是提倡这样做的，例如：地面喷溅水：工人从有地面污水的地方走过后又回到加工区域吗？墙壁：墙壁上面和在制品上面有昆害虫吗？天花板：冷凝物或喷漆有无掉落到产品上或被发现与产品相接触？4．某些准备干冰：（有的称为 gel backs）如果使样品在贮运过程中保持冷却，一些种类的制冷剂是必需的。检查观看干冰袋子是否有接触，如果泄漏可能污染样品，你也可以用湿冰，湿冰可以由工厂提供，然而取样前必须清楚这一点，如果想保持样品冷冻，干冰应在检验前获得。盒子或制冷皿：检验员需要贮藏、运输他们的样品，如果样品不需冷冻，那么用一个盒子即可，但如果样品需要冷却，一个标准的制冷皿或保温箱是必须使用的，一般来讲制冷皿随带着一个塑料袋，样品可以放还袋子里，制冷剂象干冰，等可以放置在袋外，这样样品被冰污染的可能性就被避免了。灭菌容器：从塑料袋到灭菌的加仑漆桶，可以用于有锐利边面的产品如蟹、虾等。取样工具：取样工具包括：茶匙、角匙、尖嘴钳、fovceps tongs 量筒和烧杯，工具的类型一般由取样产品来决定。所有取样设施和容器的灭菌日期应当被检查、灭菌时间应当在仪器设施的标签和包装上标明，一些仪器设施可以在当地实验室灭菌处理或购买灭菌仪器，在当地实验室灭菌的仪器设施一般可以保持至少两个月，过期后设施必须重新灭菌。灭菌手套：灭菌手套在采样中并非必须启用，如果一个产品在样品收集过程中必须被接触，那么最好让工厂生产线的工人来做（加工处理产品的工人），将样品放入收集容器中，既然工人在生产过程中处理接触产品，那么我们就不能认为他们对产品又有附加的污染。当用手套时必须用一种避免污染的方式戴上，手套的大小必须适合工作的需要。无菌棉拭子：一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域，使用棉拭子一般有一个正确的程序，打开棉拭子剥掉表皮，然后必须小心的放在试管头上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取样的部位，像案板头或顶部管道，然后从试管头上小心翼翼地将拭子放入——将其全部堆入直到试管中部。灭菌全包装袋：袋子必须购买灭菌的，使用时只需撕掉封头，用提供的地方张开袋子，将样品放入，然后将袋子顶端卷起，用线绳扎实牢；底部应当折叠两次，以便线绳不会穿透塑料袋，导致样品泄露。当样品收集时，样品采集时的条件例如产品的温度、地点等，连同扦样样品号唛头，一并记录入检验员的注释说明中，取样的样品可以从样品号、采集日期、附加样品号，最初调查人和其他鉴别信息事区分。当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。

柱层析就是通常所说的过柱子，又叫柱色谱，属于色谱法中使用最广泛的一种方法。对于含有多种有机物的混合样品，用重结晶无法提纯时，柱层析法可以说是有机实验中最有效的分离手段。实验室中常用的是以硅胶和氧化铝做固定相的吸附柱。硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。远慕生物为大家总结了在使用柱层析时的几个技巧，好好学习，化学实验中分离与提纯的痛苦，将在这里终结！硅胶的使用初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大量的硅胶剩余，浪费硅胶，这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。柱层析用的硅胶一般是100-200 目，100 毫升硅胶的质量在47克左右，如果装一个直径是2.8 厘米的柱子，可以装 18 厘米高。为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量筒量出100毫升干硅胶，直接倒入各种规格的柱子中，敲实，用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称30~70倍于上样量，如果极难分，也可以用100倍量以上的硅胶。洗脱剂的使用洗脱剂的极性可用薄层层析来确定，一般以待分离样品Rf 值为0.2-0.3为宜。选择的洗脱剂应该使两相邻物质 Rf 值之差最大化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好，如果 Rf 在 0.6，即使相差 0.2 也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的过程，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3） 的三次方或四次方大。有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时，可用采梯度洗脱的方法，即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯、石油醚系统；极性较大的用甲醇、氯仿系统；极性大的用甲醇、水、正丁醇、醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯、石油醚系统和二氯甲烷、石油醚系统， 在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯、石油醚系统。另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。装柱子的技巧柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单，使用也最普遍，就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧，然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。用漏斗将活好的固定相倒入柱子中，打开底部活塞，将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打，将固定相敲实，做到密实均匀无气泡即可。很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中，然后用油泵抽柱子底部，相当于减压过柱，直到柱子变得很结实，再用淋洗剂“走柱子” 。干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后，由于溶剂和固定相之间的吸附放热，所以柱子容易变花，影响分离效果。解决的方法是：（1）固定相一定要添加结实；（2）一定要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。上样的技巧上样也有湿法和干法之分：湿法一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。在不用海沙的情况下，尽量不要破坏硅胶面。加样后，打开柱底活塞，让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会析出，这就需要先重结晶样品，得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。如果不能重结晶也没关系，直接过柱就行，样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解，最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF，DMSO等， 会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1：1 的量混合，硅胶使用的量也可以少一些，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中，加入洗脱剂洗脱。过柱的技巧柱层析按过柱时的压力可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，例如一些天然化合物的分离，有时一个柱子过几个月也有可能。减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发，有时会在柱子外面有水汽凝结，另外有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气，噪音大，时间长，所以减压过柱用得比较少。加压过柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（用鱼缸供气的加压泵就行）。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高，分离效果较好，所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡，使柱子变花，利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题，而且可以使柱子很快装实。随着科技的发展，色谱法的技术也日新月异，但柱层析实验技术还是比较简单和实用的，每个科研工作者在使用柱层析时，可以根据自己的实际情况来不断地摸索，不断地总结和提高柱层析的实验技术

非标准方法是指国际标准、区域标准或国家标准发布的方法以外的检测方法。起草一个非标方法，在非标方法中至少应该包含如下内容：1、方法适当的标识；2、方法范围；3、被检测或校准物品类型的描述；4、被测定的参数或量和范围；5、仪器和设备，包括技术性能要求；6、所需的参考标准和标准物质（参考物质）；7、要求的环境条件和所需的稳定周期；8、操作程序的描述，包括：1）物品的附加识别标志、处置、运输、存储和准备；2）工作开始前所进行的检查；3）检查设备工作是否正常，需要时，在每次使用之前对设备进行校准和调整；4）观察和结果的记录方法；5）需遵循的安全措施；9、方法接受（或拒绝）的准则和/或要求；10、需记录的数据以及分析和表达的方法；11、不确定度或评定不确定度的程序。在新版CNAS-CL01:2018准则7.2.2.1中明确要求“实验室应对非标准方法、实验室制定的方法、超出预定范围使用的标准方法、或其他修改的标准方法进行确认。”实验室日常检测活动中，时常出现以下情况：1）检测对象与标准方法不一致；2）操作方法与标准方法不一致；3）仪器配置与标准方法不一致；4）标准样品等与标准方法规定不一致。实验室要对以上这些不一致情况进行判断，如果是常态，则为非标准方法，按照非标的要求要求进行方法确认。