在分析工作中遇到所用试剂纯度和杂质含量达不到要求时,要采取对试剂进行提纯,尤其是用量较多的试剂如各种酸的提纯。本节只介绍蒸馏法提纯。①盐酸的提纯用硬质玻璃或石英蒸馏器,用高纯水(电阻率〉3MΩ?cm)将优级纯盐酸(或分析纯)按盐酸:水=1 : 1的比例将1.5L放入2L蒸馏器中,用可调变压器调节加热,流速 200mL/h,弃去前段150mL左右馏出液,取中段馏出液1L,蒸馏出盐酸的浓度为6mol/L,杂质含量很低,能满足微量分析的要求,如需要更高纯度,可进行二次蒸馏。如果盐酸中碑杂质含量高,可以在蒸馏器中加入少量的氧化剂.按体积加入2.5%硝酸或2.5%过氧化氢或高镒酸钾0.2g/L,控制流速100mL/h进行蒸馏,弃去前段馏出液150mL左右,取中段馏出液1L备用。碑的含量在1 X10-8以下。②硝酸的提纯操作与盐酸蒸馏提纯方法相同,以1.5L优级纯的硝酸加到2L的蒸馏器中,控制馏出液速度在200mL/h,收集中间一段馏出液1L备用。若需要更高纯度,则二次蒸馏。③高氯酸的提纯用减压蒸馏法提纯高氯酸。将300mL分析纯高氯酸(60%?65%)加入500mL硬质玻璃蒸馏器中,减压蒸馏的压力为2. 67?3. 33kPa,控制温度为140?150°C, 馏出液速度为40?50mL/h,收集中段馏出液200mL,保存在石英试剂瓶中。④氢氟酸的提纯氢氟酸蒸馏提纯用蒸馏器,以甘油浴加热,收集馏出液用聚乙烯瓶。因为一般分析实验室不具备铝蒸馏器,所以氢氟酸的提纯很少在实验室中进行。除了以上介绍的蒸馏法提纯最常用的几种酸之外,还可以利用等温扩散法提纯盐酸、硝酸、氢氟酸、氨水等。氨水的提取还可以利用蒸馏吸收法。各种盐类的提纯方法还有许多,如离子交换法、重结晶法、共沉淀重结晶法、活性炭吸附法、醇析法、萃取法等。⑤有机试剂的提纯用蒸馏法提纯甲醇、乙醇、正丁醇、异戊醇、甲酸、乙酸、乙酰、异丙醍、丙酮、四氯化碳、二氯乙烷、石油醍、苯、甲苯、二硫化碳、三氯甲烷、乙酸乙 酯等。用减压蒸馏法提纯甲异丁酮和环己酮、乙酸正丁酯、磷酸三丁酯等。此外,还有萃取法、重结晶法、活性炭吸附法、杂质沉淀法等提纯有机试剂的方法。

PBS是磷酸缓冲盐溶液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na ₂HPO ₄ 、KH₂PO ₄ 、NaCl和KCl。PBS缓冲液不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。由于Na₂HPO ₄ 和KH₂PO ₄ 它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。如有需要PBS还可以补加1 mmol/L CaCl₂和0.5 mmol/L MgCl₂，以提供双价阳离子。pbs缓冲液的配制方法含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：称取磷酸/二氢钾(KH2PO4)，磷酸/氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯/化钠(NaCl)，氯/化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。PBS:Phosphate Buffered SalinePBS 1L配方pH7.4：磷酸/二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸/氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯/化钠(NaCl)：8g，氯/化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1Lpbs缓冲液的作用PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首/选。　　PBS也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性。

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。（5）常用试剂的配制和使用。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。

免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。2、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。3、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。4、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。5、选择正确的二抗如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。6、使用合适的细胞密度选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。7、多重染色对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。8、降低背景高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。9、封片作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。10、数据分析观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。

肽-载体蛋白偶联多用于制备抗多肽类抗体，单独的多肽通常太小不足以激起充分的免疫反应，而带有很多抗原表位的载体蛋白有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应。请记住，免疫系统是将肽-蛋白作为一个整体来激起免疫反应的，因而产生的抗体中有针对多肽的，有针对链接剂的，也有针对载体蛋白的。 其中最常见的载体蛋白有如下几种:KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)，即血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量450000～130 000。由于KLH比BSA有更高的免疫原性，因而是最常被选用的载体蛋白。BSA (Bovine Serum Albumin)，即牛血清白蛋白，属于最稳定的和可溶的白蛋白。其分子量为67 x 103 Da （含有59个Lys）。大约有30-35个主要氨基可用于与链接剂发生共轭反应, 使得BSA成为一种很流行的弱抗原化合物载体蛋白。BSA的不利之处在于在很多实验中，它被当作封闭剂使用，如果多肽-BSA偶联物的抗血清用于这样的检测分析中，通常会出现假阳性，因为这些血清含有抗BSA的抗体。OVA (Ovalbumin)，即鸡卵白蛋白，分子量为45 x 103 Da。它可作为第二载体蛋白去验证抗体是否特异性地只针对多肽而并非载体蛋白(如BSA)。巯基修饰(通过Cys的侧链)用于与KLH、BSA或OVA发生共轭反应所有携带巯基反应的功能基团经修饰都可被用来发生共轭反应。其中最/常见的有以下几种:碘乙酰胺（Iodoacetamide）马来酰亚胺（Maleimide）烷基卤（Alkyl halide）

1. 多肽含量与多肽纯度有什么区别?一条多肽产品中除了多肽本身还包括生产过程中带入的水份及有机盐分等杂质，多肽纯度仅指多肽本身所含肽产品的含量及杂质的含量，不包括水份等杂质;而多肽含量则是指目标多肽在产品中的净含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法来检测;因此一条多肽即使纯度达到99%，因为产品中还包含水份及有机盐分等，它的含量可能也只有70-80%。2 如何溶解多肽?多肽样品在上制备柱前为什么需要进行前处理?有哪些前处理的方法?多数多肽都可以用超纯水溶解，对于一些难溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，对于酸性多肽，可先以小量碱性(如0.1%氨水)溶液溶解，然后稀释至所需浓度，对于碱性多肽，可先以小量酸性(如醋酸，三氟乙酸)溶液溶解，然后稀释至所需浓度，对于疏水性多肽，可用强极性有机溶剂溶解，如DMF，甲醇，丙醇，异丙醇，DMSO等。制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，因此有必要对样品进行前处理以有效延长制备柱的寿命。主要方法有5种：萃取、过滤、离心、上预柱、加在线过滤器。3. 为什么流动相中要加入三氟乙酸作为离子对试剂，还有哪些流动相体系或离子对试剂可用于多肽的分离纯化?目前常用的流动相体系是水加乙腈，以三氟乙酸(TFA)为离子对试剂，根据不同多肽以合适的梯度洗脱分离多肽。加入三氟乙酸能调节洗脱液的PH，同时作为离子对试剂与多肽相互作用，从而增强分离效果，明显改善峰形。其它可用于多肽分离纯化的流动相体系或离子对试剂包括醋酸体系，磷酸体系，盐酸体系，七氟丁酸等通过适当的调节PH都能取得很好的分离效果。4. 如何选择纯化过程中使用的色谱柱填料?不同序列的多肽理化性质及疏水性有很大的区别，多数情况分子量小于4000和亲水性多肽用C18柱分离效果最佳，分子量大于5000和极端疏水性的多肽以C4柱分离效果/最佳，而C8柱介于C18和C4柱之间，其应用效果与C18柱更相似;对一些特殊选择性的多肽，也可选择苯基柱和聚合物色谱柱。5. 在纯化过程中选择聚合物填料的原则是什么?需要使用高于正常pH或温度条件进行纯化时，可以使用pH范围极宽的聚合物色谱柱，它的优点就是在极端pH条件下不会降解，可以使用强酸和强碱作为流动相进行分离纯化。6. 影响多肽纯度检测结果的因素影响多肽纯度检测结果的因素很多，主要包括：流动相体系、色谱柱型号、柱温、波长及色谱仪的性能指标，每一项不同都可能造成结果产生误差。7. 在多肽检测过程中经常出现基线漂移的原因是什么?怎么解决?固定三氟乙酸浓度的梯度洗脱有时会在210-220nm检测处造成吸收基线的漂移，这是许多反相分离中基线漂移的原因。降低或消除由于三氟乙酸光谱吸收变化引起的基线漂移需要尽量使检测波长靠近215nm，并在溶剂B中比在溶剂A中少加15%的三氟乙酸补偿基线漂移。例如溶剂A中的三氟乙酸为0.1%时，溶剂B中可用0.085%。8. 反相色谱分离纯化后，怎样去除产品中流动相产品中的TFA，乙腈等杂质?冻干的办法应该可以除去大多数TFA和乙腈，只要不超过允许范围，这种办法是最简单、有效的。对TFA含量要求更高的一些药物肽冻干的方法一般无法完全达到要求，需要进行专门的转盐或脱盐。9. 多肽一般有哪几种盐的形式?通过什么方式转盐或脱盐?多数多肽都是在TFA体系下分离纯化的，所以多肽以TFA盐的形式最多，其次药物肽一般有醋酸盐及盐酸盐的形式，极少数药物肽会有一些特殊的盐形式。转盐方式多为离子交换法和HPLC法，而脱盐可用透析袋和超滤膜。10. TFA在缓冲液中是不是只起到调节PH的作用?TFA的浓度越高基线漂移越厉害，那是不是说TFA的浓度在缓冲液PH允许的情况下越低越好?(1)TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。(2)同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。(3)走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。

一、实验目的(1)掌握蛋白质盐析沉淀的基本原理与操作。(2)掌握蛋白质透析分离的基本操作。二、实验原理蛋白质是亲水胶体，借助水化膜和同性电荷(在pH7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷)相互排斥作用维持蛋白质胶体的稳定，向蛋白质溶液中加入中性盐可破坏这些稳定因素，使蛋白质沉淀析出，称为盐析。盐析所得到的蛋白质沉淀经透析或用水稀释以减低或除去盐后，蛋白质能再次溶解并恢复其天然结构和生物活性，称为透析。由于蛋白质分子量很大，其颗粒直径范围在1～100nm内，不能透过半透膜。选用合适孔径的半透膜可使小分子物质透过，而蛋白质不能透过半透膜，从而可以除去与蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质。蛋白质盐析常用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、NaCl等。蛋白质经盐析沉淀后，需脱盐才能获得纯品。脱盐最常用的方法为透析法。由于蛋白质分子量较大，不能透过半透膜，而无机盐及其他低分子物质可以透过，故利用透析法可将盐析得到的蛋白质进行纯化。将蛋白质溶液装入透析袋内，袋口用线扎紧，然后将其放进蒸馏水中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被截留在袋内，而小分子盐由于透析袋内外浓度差，可透过透析袋，通过不断更换袋外蒸馏水，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，为保证蛋白质不变性，透析宜在低温下进行。三、实验材料与试剂1.实验材料10%鸡蛋清溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液。2.主要实验试剂饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70～80℃下搅拌溶解，室温放置过夜，杯底析出白色晶体，上清液即为饱和硫酸铵溶液。硫酸铵晶体、1%硝酸银溶液等。四、实验步骤1.透析袋的预处理为防干裂，新透析袋出厂时常用10%甘油进行处理，并含少量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，需除去。将透析袋剪成100～120mm的小段，用50%乙醇煮沸1h，再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗3～5次(新透析袋如不作上述特殊处理，也可用沸水煮5～10min，再用蒸馏水洗净即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可用特殊的透析袋夹夹紧，从另一端灌满水，用手指稍加压，检查是否有渗漏，没有渗漏后方可使用。处理好的透析袋保存于蒸馏水中待用。2.蛋白质盐析取10%鸡蛋清溶液5mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋清蛋白质即可析出。如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出。取少量沉淀的蛋白质，加水稀释，观察沉淀是否会再次溶解。3.蛋白质的透析注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液5mL于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，并悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，开口端位于液面之上。10min后，自烧杯中取出1mL溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，则证明蒸馏水中有Cl-存在。再自烧杯中取出1mL溶液置于另一试管中，加入1mL10%氢氧化钠溶液，然后滴加1～2滴1%硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。每隔20min更换蒸馏水一次，数小时后可观察到透析袋内出现轻微混浊，此为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。实验记录透析完成所需的时间。五、注意事项蛋白质溶液用透析除盐时，正负离子透过半透膜的速度不相同，如(NH4)2SO4中的 透析速度快，而透析过程中膜内的 会生成H2SO4，使膜内蛋白质溶液呈酸性。因此，为避免蛋白质变性，用盐析法纯化蛋白质时，开始时应用0.1mol/L的NH4OH透析。此外，为了保证蛋白质在透析过程中不发生变性，可以将透析过程置于低温下进行。

1、检验方法验证的基本内容检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批，检测仪器的确认.适用性验证(包括准确度试验、精密度测定.线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个欠的方面。它的基本内容可以用下图表示。2、检验方法验证的基本步骤首先是制定验证方案，然后对大型精密仪器进行确认，最关键的一步是检验方法的适用性试验，最后是检验方法评价及批准。1)验证方案的制定检验方法的验证方案通常由质量验证小组提出。根据产品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有关资料，提出规格标准，确定检查项目，规定杂质限度，即为质量标准草案。根据质量标准草案确定检查和试验范围，对检验方法拟定具体操作步骤，最后经有关人员审批方可实施。2)大型精密仪器的确认分析测试中所用的检测仪器一般可分为三类(1)普通仪器：崩解仪，折光仪、分析天平、酸度计、溶点测定仪、电导仪等：(2)较精密仪器：旋光仪、永停滴定仪、费休氏水分测定仪、 自动滴定仪、药物溶出度仪、可见分光光度计、电泳仪等;(3)大型精密仪器：紫外分光光度计、红外分光光度计、气相色谱仪、高效液相色谱仪、薄层扫描仪等。为了保证分析测试数据准确可靠，每台检测仪器在投入正式使用之前都应进行确认。检测仪器的确认是检验方法验证的基础，应在其它验证试验开始之前首先完成。检测仪器确认工作内容应根据仪器类型。技术性能而定，通常包括：安装确认、校正、适用性预试验和再确认。校正校正是仪器确认及检验方法验证中的一个重要环节，应当在验证试验以前进行校正。紫外分光光度计校正包括波长校正、吸收度测试、准确度测试、杂散光检查。气相色谱仪与高效液相色谱仪均要求做系统适用性试验。在规定的色谱条件下测定色谱柱的最小理论塔板数。分离度和拖尾因子，并规定变异系数应不大于2%。对于化学检验中使用的计量仪器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均应校正。适用性预试验仪器的安装确认完成以后，-在其功能试验符合要求的情况下，应用标准品或对照品对其进行适用性检查，以确认仪器是否符合使用要求。例如对熔点测定仪的适用性预试验是采用已知溶点的甲硝唑做试验，测试结果与已知熔点比较。紫外分光光度计可用已知含量的某标准品试验，测得结果与已知数值对比，确定仪器是否符合使用要求。在完成上述各项试验工作的同时，应做好相应的文件记录等资料归档工作，每一台仪器均应有一套完整的档案资料。再确认为了确保仪器处于良好的使用状态，对于一台新购买的仪器在确认工作结束以后，应根据仪器的类别。确认的经验制定再确认的计划。再确认的时间间隔和内容要根据仪器类别和使用情况决定，一般是3个月、6个月或1年。仪器再确认的内容通常包括线路连接、附件备品消耗晶检查、清洁工作、功能试验、工作日记等，其中重点足安装确认中的功能试验。3、检验方法的适用性验证药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应的检测要求。在起草药品质量标准时，分析方法需经验证：在药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草或修订说明中。根据《中国药典》 (2010版)附录XIXA的原则要求，检验方法的验证可分为三种情况处理;(1)无需验证的方法。如药典(包括USP、EP、CP、JP等各国药典)的方法，一般只做系统适用性试验，以确认系统是否符合要求(主要指仪器稳定性及柱的分离度是否达标)。(2)对比法。已在参比实验室验证过的分析方法，可用对比试验的方法来确认方法的可靠性，即将本实验室与参比实验室用同一方法对同批样品所测数据进行比较(如至少取五个批号，每批重复测定五次)，判断方法在本实验室的可行性。如有差异需查明原因或设计方案，对方法进行再验证。(3)需进行系统验证的方法。4、检验方法的评价及批准安装确认及适用性试验结束后，应将试验数据资料进行汇总分析。对检验方法作出正确的评价，验证报告的说明及结论部分应简明扼要。试验中的主要偏差应有适当解释。然后，报主管领导审批。检验方法验证的最终产物是一个经过验证的方法—根据验证的结果制订的由有关领导批准的检验方法。

常用的检验方法有3种。但这些方法只能指示误差的存在，而不能证明没有误差。1.平行测定两份结果若相差很大，差值超过了允许误差范围，这就表明结果中至少有一个有误，应重新分析。两份结果如果很接近，可取平均值，但也不能说明结果正确无误。2.用标样对照在一批分析中同时带一个标准样品，，如果操作无误而标样分析结果与标样参考值一致，说明本批样品分析结果没有出现明显误差。3.用不同的分析方法对照这是比较可靠的检验方法。如两种分析方法的分析结果取得一致，则证明此结果是可靠的；反之，说明两种方法中至少有一种方法的测定结果不准确。常用的检验方法有3种。但这些方法只能指示误差的存在，而不能证明没有误差。1.平行测定两份结果若相差很大，差值超过了允许误差范围，这就表明结果中至少有一个有误，应重新分析。两份结果如果很接近，可取平均值，但也不能说明结果正确无误。2.用标样对照在一批分析中同时带一个标准样品，，如果操作无误而标样分析结果与标样参考值一致，说明本批样品分析结果没有出现明显误差。3.用不同的分析方法对照这是比较可靠的检验方法。如两种分析方法的分析结果取得一致，则证明此结果是可靠的；反之，说明两种方法中至少有一种方法的测定结果不准确。

　　检验方法的选择正确与否将直接影响到检验的结果和检验的效率, 正是从这个意义上说：掌握检验的各种分类标准至关重要。　　一、按照检验数量分类　　1、免检：免检是指如果可以得到由有资格的单位进行过检验的可靠性资料、如合格证、检验报告等，就可以不需要检验。　　免检的适用范围—生产过程稳定对后续生产无影响时可采用免检长期检验证明质量优良信誉很高的产品在交接中可采用免检、国家批准的免检产品或通过产品质量认证的产品可采用免检　　2、抽检：抽检是指按照一定的比例和取样方法抽取样品，通过逐个检验样品品质，判断总体合格与否的检验。　　3、全数检验(100%检验/产品筛选)：全数检验的含义—全数检验就是对全部产品逐个地进行测定，从而判定每个产品合格与否的检验。　　全数检验适用范围　　1、产品价值高但检验费用不高时应全数检验；　　2、关键质量特性和安全性指标应全数检验 ；　　3、生产批量不大质量又无可靠措施保证时应全数检验 ；　　4、产品质量不稳定时应全数检验 ；　　5、精度要求比较高或对下道工序加工影响比较大的质量特性要全数检验；　　6、手工操作比重大质量不稳定的加工工序所生产的产品要　　全数检验；　　7、用户退回的不合格交验品应全数重检筛选不合格产品。　　全数检验存在的问题　　1、需增加人员添置设备多设检验站点　　2、人力有限的条件下进行全检势必要缩短每个产品的检验　　时间或减少检验项目这将降低产品质量的保证程序　　特别提示：全数检验不能用于破坏性检测等一些试验费用昂贵的检验，对价值低、批量大的产品采用全检显得很不经济，全检也存在着错检、漏检。在一次全检中平均只能检出70%的不合格品，如果希望得到产品100%合格，必须重复多次进行全数检验才能接近100%合格，检验误差与批量大小、不合格率高低、检验技术水平、责任心强弱等因素有关。　　3.抽样检验：　　抽样检验的含义：抽样检验是按预先确定的抽样方案，从交验批中抽取规定数量的样品构成一个样本，通过对样本的检验推断产品批合格或产品批不合格。　　抽样检验适用范围　　1、量多值低且允许有不合格品混入的检验 ；　　2、检验项目较多时；　　3、希望检验费用较少时；　　4、生产批量大、产品质量比较稳定的情况；　　5、不易划分单位产品的连续产品、例如钢水、粉状产品等 ；　　6、带有破坏性检验项目的产品；　　7、生产效率高、检验时间长的产品；　　8、有少数产品不合格不会造成重大损失的情况；　　9、希望检验对供应商改进质量起促进作用，强调生产方风险的场合。　　抽样检验的缺点　　经抽检合格的产品批中混杂一定数量的不合格品、抽检存在一个错判风险抽检所提供的质量情报比全检少。　　二、按照生产过程的顺序分类　　按生产过程的顺序分有进料检验、过程检验、最终检验、最终检验又包括半成品成品检验　　三、按照检验地点分类　　1.集中检验：把被检验的产品集中在一个固定的场所进行检验：如检验站等一般半成品、成品的入库检验采用集中检验的方式　　2.就地检验：就地检验也称为现场检验，是指在生产现场或产品存放地进行检验，在线检验是就地检验的一种方式，产品的生产一般要经过很多工序，在生产过程中设定几个检验工序称为在线检验　　四、按数据性质分类　　1.计量值检验：计量值检验需要测量和记录质量特性的具体数值取得计量值数据并根据数据值与标准对比，判断产品是否合格。　　2.计数值检验：为了提高生产效率常采用界限量规、塞规、卡规、通止规进行检验所获得的质量数据为合格品数、不合格品数，能取得具体的质量特性数值。　　五、按照检验手段分类　　1.理化检验：理化检验就是以机械电子或化学量具为手段对产品的物理化学特性进行测定以确定其是否符合规定要求的检验方法　　2.感官检验：依靠人的感觉器官进行有关质量特性或特征的评价判定的活动称为感官检验如对产品表面的颜色光泽伤痕的检查一般采用感官检验　　3.量值界限检验：如通止规的检验　　4.试验性使用鉴别：试验性使用鉴别是指对产品进行实际使用效果的检验　　六、按检验目的分类　　1.接收检验(验收检验)：接收检验又称验收检验，指的是组织对供方供应商提供的产品进行的检验。　　2.控制检验：控制检验指在产品形成的整个过程中的适当阶段所进行的检验。　　3.监督检验：监督检验是指各级政府主管部门授权的独立检验机构，按计划从市场或企业抽取产品所进行的市场抽查监督检验，监督检验的目的是为了对投入市场的产品质量进行宏观控制。　　4.验证性检验：验证性检验指的是以验证为目的的检验　　5.仲裁检验：仲裁检验指当供需双方因产品质量发生争议时由各级政府主管部门所授权的独立检验机构抽取样品进行检验，提供仲裁机构作为裁决的技术依据。　　七、按检验周期分类　　1.逐批检验：逐批检验是指对生产过程所生产的每一批产品逐批进行检验，逐批检验的目的在于判断批产品的合格与否。　　2.周期检验：周期检验是指按规定的时间间隔从逐批检验合格的某批或若干批中抽样进行的检验。　　3.按人员分类：　　(1)自检：自检是指由工作的完成者依据规定的规则对该工作进行的检验，自检的结果可用于过程控制。　　(2)互检：互检就是操作者之间对加工的产品零部件和完成的工作进行的相互检验。　　(3)专检：专检是专职检验员对产品质量进行的检验。

液相操作中，有一些小细节上的误操作在精益求精的实验室人看来是要尽可能避免的，细节虽小，影响很大。这就带各位小伙伴们看一看，这些错误你们有犯过吗？犯过不怕，记得改正哦~加入有机相之后再测量流动相的PH值作为液相色谱的基础，流动相的各项参数是保障实验质量的重中之重，特别是PH值。通常情况下对流动相PH值的测量是测量水相中的PH值参数，而在加入有机相后PH测量的PH值是会产生误差的。因为每一次加入的有机相并不能保证完全的同质同量，从而影响实验的准确度。测量流动相的PH值，是测量水相中的PH值参数。有机相加入之后PH值参数的测量就和之前有误差。缓冲盐使用不当在流动相中，加入缓冲盐可以控制和修正流动相中的PH值变化。样品的机制，空气中的CO2等气体以及水中的杂质都能够造成流动相PH值变化进而影响样品的保留、峰形、峰面积参数。而每一种缓冲盐都只能在一定的PH值范围内提供了最佳的pH稳定性。而在这个范围外，该缓冲盐在抵抗pH值变化方面是无效的。所以需要在流动相中加入合适的缓冲盐，要么在正确的范围内使用缓冲盐，要么选择一个能够完全覆盖所需pH值的缓冲盐。最后，缓冲盐的添加也是具有一定的要求的，如果将水相的缓冲溶液加入到有机相中，会大大增加缓冲盐析出的风险。缓冲盐的析出在初期可能并不明显，但会对仪器的各个部件都会产生一定影响。长此以往不仅会导致实验结果不准确，更会有可能导致仪器损伤甚至损坏。直接用纯有机溶剂冲系统如果之前的方法在B通道使用缓冲溶液，而这次没有经过调查就直接在B通道使用了纯的有机溶剂，那么就会造成该通道缓冲盐析出、出现堵塞等风险。仅使用超声来给流动相脱气超声脱气有一定的脱气作用，但完全脱气的效果并不理想。所以在此建议使用真空脱气机进行在线脱气。梯度洗脱时从流动相比例从0%开始现在的液相色谱能够非常高效的进行在线脱气和流动相混合。但是将梯度洗脱比例从0%开始，会有比较大的出现气泡和沉淀的风险。

食品安全事件的频频发生，使得民众对食品安全问题越来越关注。为了确保食品安全，政府部门除了要出台相关法律法规外，更为重要的是要建立起更为科学的食品安全性的检测技术。规范的检测方法是有效保障食品安全的重要环节，它要求检验数据具有更高的准确度和可信度。食品中菌落总数反映了食品在生产过程中的卫生情况，体现食品被细菌污染的程度，是做出科学卫生评价的重要指标之一。本文主要对国标法微生物检测中菌落总数测定采用的传统方法即平板计数法的注意事项进行相关的分析，并着重介绍了快速检测技术在菌落总数检测中的应用。注意事项国标法测菌群总数是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或mL检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。国标法检测应注意以下问题：所用器皿及稀释液检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则需采用蒸馏水。样品稀释检样稀释时,无菌称取(或量取)有代表性的样品25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成1:10的稀释液。制备10倍系列稀释的样品匀液时，每一步都应该摇匀试管或反复吹吸，使菌体能够尽量分散均匀。如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000-10000rpm速度搅拌1分钟，使做成均匀的1：10稀释液。对于像食醋或酸性饮料等酸度较高的样品，如果直接用原样液来检测菌落总数，结果会偏低甚至为0 ，只有严格按标准要求先用灭菌的20-30%碳酸钠溶液将其PH值调至中性后方可准确检测出菌落总数。根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1:10稀释液1mL与9mL稀释液混和做成1:100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1:1 000、1:10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。   当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。平板接种与培养将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作1O倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液加入皿内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2h。其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点．果脯，酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃24±2h培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。菌落计数在进行菌落计数时，有一些样品的残渣会在视觉上与菌落混淆，因此，在进行计数时应该仔细分辨。菌落的形状相对规则，比较有光泽度，更饱满，而样品的残渣比较不规则，没有菌落的饱满度和光泽度。另外，还可向培养基中添加一定浓度的TTC，可以使菌落成红色，便于观测和计数，但TTC的浓度不宜过高，否则会抑制菌落的生长。从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。若1个稀释度的平均菌落数在30—300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。快速检测新技术3M测试片快速分析技术3M测试片快速分析技术概念3M测试片法是一种便捷可再生水化干膜，适用于细菌和真菌的计数。检测步骤只需三步就可实现快速准确的测定。(以大肠杆菌的为例)结果判读①测试片中含有一种红色指示染剂可使菌落着色，计算所有红色菌落(不论其大小和颜色深浅均计算之)。②测试片上没有任何菌落生长。③有不多的菌落。④测试片菌落数适宜计数范围是25-250。⑤测试片面积约为20平方厘米，当菌落数超过250个，如5所示，为了估计菌落数，可选择其中一个或数个有代表性菌落的小方格(1cm2)，计算平均菌落数，再乘以20可得到整个测试片上的菌落数。⑥ 测试片上菌落太多而无法计数。⑦有很多高数量菌落，使整个生长区变粉色，应计录为菌落太多无法计数。⑧有时菌落分布出现不均衡，如8所示,这也记录为菌落太多无法计数。⑨测试片上的菌落,最/先粗略一看是可计数的，然而，你密切注意到生长区边缘，能看到高密度的菌落，应记录为菌落太多无法计数。测试片法特点工作效率的极大提高根据大量数据统计，使用 3M测试片技术， 可以提高实验室工作效率 118% 以上。劳动资源的最佳使用带来生产能力的提高，最终的效果就是效益的增加。标准化的检测方法品质稳定的快速测试片克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。国际化的认证方法3M快速测试的方法得到包括 AOAC，AFNOR 在内的国际权威机构的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而可以确保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。快速得到检测结果对比传统的测试方法， 3M快速测试片缩短检测时间，使您在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措施解决发现的问题。方便进行HACCP 认证由于检测速度快，检测项目全，准确性高。3M为食品生产工艺过程中关键控制点的监控提供了较为完整的系列产品，可以对包括生产线，生产设备和环境在内的各个环节进行全面的测试。ATP法ATP荧光法检测总菌落数原理萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂—荧光素酶、虫荧光素(D-luciferin)以及所有细胞生物都产生的生物能量物质—三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：ATP法特点：具有成本低，操作简单，响应速度快等特点，微生物 ＡＴＰ 生物发光法在国外已被广泛地运用于食品中菌落总数的测定。MTT法MTT法检测原理检测原理为活体微生物线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT（噻唑蓝）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。Formazan结晶形成的量与活菌数成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活菌细胞数量。应用实例：巴氏消毒奶中活菌素快速检测取巴斯消毒奶10mL ，至于无菌离心管中3000rpm离心5分钟，弃去上清。加入10mL无菌生理盐水洗涤离心管，再次3000rpm离心5分钟，弃去上清取出奶液基质。加入1mL生理盐水重悬底部的微生物，取0.2mL到96孔酶标板中，同时加入标准菌液做标准曲线，统一加入底物反应30分钟，读数。该方法的特点：检测快速，灵敏度高。流式细胞术流式细胞术检测原理检测原理：细胞经特异荧光素标记后，通过激光照射，产生特异荧光信号，通过对这些荧光信号的检测和定量计算出菌群总数。特点：快速、便捷结果可靠、便于操作。结语：菌落总数是微生物检测中最常见的项目，在检验的每一个环节都应该小心谨慎，精准操作，确保检测结果的准确度。国标法采用的平板计数法是我们最常用的检测方法，但是操作过程较为复杂，时间较长；而其他方法操作简便，省时，但是有的成本相对较高，并且有的只针对特定的食品种类。我们应该积极关注新的科学技术在检测方法中的应用，让检测更加精确、经济、便捷和可靠。

化学品在存放时，常因周围环境温湿度变化结块或者冻块，而引起变质，对其品质产生影响，从而使成本变高。因此，必须根据试剂的不同物化性质，分别采取相应的控温、控湿手段妥善保存。有些试剂容易吸湿而潮解或水解；有的容易跟空气里的氧气、二氧化碳或扩散在其中的其他气体发生反应，还有一些试剂受光照和环境温度的影响会变质。化学品性质不相同，如何区别对待？1、低沸点的化合物、需要低温保存的药品须按要求放入所需的环境（低温冰箱）；2、避光保存的药品及其所配制的试剂，均应按要求用棕色容器（瓶）保存，或用深色纸包裹；3、药品一律放入药品柜内，不得与配制的溶液混在一起放置；4、液体药品放置矮柜。固体药品与液体药品分开放置；5、酸碱不能混放，氧化剂和还原剂不能混放，如果混合会发生剧烈反应的试剂不能混放，防止可能因为倾倒，破碎等意外原因引发事故；6、对于一些常温环境下存放的药品，一定要注意防潮，负责会发生固体结块现象！液体样品结块好像以前只遇到冰醋/酸，放在温度高些的地方就能变成液态了；7、北方的冬季有点冷，部分实验室的空调一般只制冷，不制热，有一些凝固点和常温偏差不大的试剂，会出现冬天凝固，夏天又变成液体的情况。还要注意的是，试剂瓶一般都是普通玻璃生产的，非常厚，温度变化太剧烈的话容易炸裂。比如，对怕冷怕冻的腐蚀性物品，如受冻结冰的冰醋/酸，受冻聚合沉淀的甲醇等，库房温度应保持在15℃左右，冬季要保暖；8、硫酸和盐酸都不好保存，虽然都是酸，硫酸应该跟甲酸、乙酸、盐酸分开放置；9、甲酸、乙酸、盐酸有强挥发性，应通风良好，把酸雾及时排出；10、硫酸具有强氧化性和强脱水性，应该单独放置；

中文名：GVC增菌液培养基英文名：GVC Enrichment Broth用途：培养基用于酵米面、变质银耳及其它淀粉类发酵食品引起的食物中毒样品中椰毒伯克霍尔德氏菌的增菌培养。标准：GB/T 4789.29-2003配方（g/L)成分            含量（g/L）马铃薯         300 (从中提取浸出)粉葡萄糖         20结晶紫         0.01氯霉素         0.02最终pH         5.6±0.2原理马铃薯提供各类氮源，碳源，维生素；葡萄糖提供能源；结晶紫抑制革兰氏阳性菌；氯霉素抑制除椰毒伯克霍尔德氏菌的大部分细菌生长。用法取瓶内GVC增菌液培养基干粉24.03克，用1000ml蒸馏水或纯水溶解。搅拌加热煮沸至完全溶解(不能持续高温加热，建议不要重复煮溶)，121℃高压灭菌20min。增菌：以无菌操作取检样25  g（淀粉类食品）或1g（鲜银耳），加入GVC增菌液225 mL（淀粉类食品）或20ml（鲜银耳），36 ±1 ℃培养48h。质量控制1.外观方面：GVC增菌液培养基属脱水干粉培养基：淡黄色粉末。溶解后颜色：浅黄色2. 生物学方面下列质控菌株接种待测试培养基，35～37℃，48-72h结果如下：质控菌株及编号指标质控评判标准椰毒伯克霍尔德氏菌ATCC33664生长率(半定量)接种＜100 cfu于该培养基中按规定温度时间培养后，稀释100倍在PDA(揶毒专用)上生长的菌落应＞30cfu，菌落灰白或乳白色，中心凸起，呈草帽状，菌落周围有黄色素扩散到基质中大肠埃希氏菌ATCC25922选择性在TSA上＜20cfu金黄色葡萄球菌ATCC6538选择性在TSA上＜20cfu

干细胞治疗也被称为再生医学，是指利用干细胞及其衍生物来促进受损、病变或功能丧失的组织进行修复。如今，许多白血病等患者已经受益于干细胞治疗。未来，骨关节炎、脑瘫、心脏衰竭、多发性硬化症、甚至是听力损失等都有望受益。干细胞治疗处在生命科学的最前沿，将会引起一场新的医学革命。“10至20年后，干细胞将会成为一种基本的治疗技术，帮助人们解决现在无法克服的疾病”，很多患者认为10年至20年太长，希望干细胞能够早日帮助人类克服疾病带来的痛苦。干细胞研究发展势头猛，间充质干细胞成主流如今，全球干细胞治疗市场已经涌现了大量的新研究、新项目以及新疗法，其中大多数疗法处在研发管线中，少数已经获得了监管机构批准上市。目前正在开展的脐带血干细胞、骨髓干细胞、皮肤干细胞、胎盘干细胞治疗心血管疾病和糖尿病等疾病的研究将为市场的发展打开一扇新的大门。统计发现，间充质干细胞的临床试验涉及上百种疾病。神经系统、心血管和骨科疾病是三类主要的研究领域，占比都在15%以上，总和超过一半。另外，糖尿病、肝脏、肺脏、胃肠道、皮肤和GVHD的比例都在5%左右，是间充质干细胞临床应用的重要研究方向。具体而言，脊髓损伤、多发性硬化、中风、肌萎缩侧索硬化症、老年痴呆症、骨关节炎、股骨头坏死、椎间盘退化、心肌梗死、肝硬化、克罗恩病、间质性肺病、系统性红斑狼疮、勃起功能障碍以及卵巢早衰是研究得较为多的疾病。未来这些患者有望更早地受益于间充质干细胞治疗。目前，国/际上已经有间充质干细胞治疗产品获批上市。根据统计，全球已有超过13项干细胞治疗药物上市，其中绝大多数都属于间充质干细胞产品。随着临床试验的开展，未来会有更多的间充质干细胞治疗产品获批上市，受益的患者也将更多。间充质干细胞无血清培养基，您选对了吗？近几年，随着细胞治疗的进展，对细胞体外培养的关注热度也在不断提高，作为药品监管的细胞制品，跟所有的药品一样，其评价标准也是“安全性、有效性”。因此培养间充质干细胞的培养基，就成为了研究、应用MSC细胞的企业、科研机构的核心关注点。市场上有许多“无血清”培养基，价格从1000-4000不等。弄得用户一头雾水，不知所以。事实上，市场上的“无血清”间充质干细胞培养基产品，可分为三类。第一种是“假的无血清”MSC培养基；第二种是“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基；第三种是“真正的无血清”MSC培养基。培养基购买可以选择远慕生物！

生物素，是一个分子量只有244.31Da的小分子，经活化后可与蛋白、抗体等生物大分子结合，不仅可以很好地保持大分子的生物活性，而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用，使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。那么如何使用生物素标记抗体或蛋白呢？下面远慕给大家分享一下。工具/原料1.10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器2. 恒温箱（37℃）3. 离心机（离心力可达到12,000×g）4. 生物素标记试剂盒（Cata.No:EBLK0002, Elabscience)实验前准备1.仔细阅读使用说明书。2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中）。4.溶解NH2-Reactive Biotin：加入30ulDMF至NH2-ReactiveBiotin瓶中，静置10min，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10mM。操作步骤：（本操作步骤按照1mg的量进行标记）1.取1mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的Labeling Buffer，使抗体的终浓度为2mg/ml，12,000 x g离心10min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5ml②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次）2. 加入13.3ul NH2-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000 x g离心10min。3. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，12,000 x g离心10min。4. 操作3重复一次。5. 加0.2ml Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000 x g离心10min。6. 收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。

微生物样品的扫描电镜观察广泛地应用于微生物学研究的各领域。为微生物资源的利用,微生物生物技术、遗传工程、环境保护等提供了大量直观的,有科研价值的形态学依据。 大多数微生物样品体积微小,使样品制备,尤其是临界点干燥,离子溅射等难于操作。积多年微生物制样的经验,远慕为大家介绍微生物中有代表性的细菌,霉菌的制样技术,其他微生物样品均可参照处理。1、细菌取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。(1)收集菌体:?液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入215%戊二醛固定液;?固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。(2)固定,脱水按常规方法。215%戊二醛,2~4hy磷酸缓冲液清洗3次y1%锇酸4~6hy缓冲液清洗3次y乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20minP次y乙酸异戊酯置换2次,20minP次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。(3)临界点干燥:普通定性滤纸裁成35mm@18mm的纸条,将长边 35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1P4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。2、霉菌取在固体培养基上旺盛生长的曲霉菌落。(1)取材:在菌落四周用刀片划5mm@5mm见方小块。用刀片将小块挑出,片成2mm厚的薄片。材料投入装有戊二醛固定液的青霉素小瓶(因菌块易漂浮,用注射器从橡胶瓶塞刺入,抽出空气,使样块沉下)。(2)固定,脱水,临界点干燥,离子溅射金参照组织块制样常规方法。

许多实验室都制定了自己的参考标准 - 付出了很多努力，总是带来错误风险。根据ISO指南34和ISO 17025质量标准生产的标准物质始终能够保证最高级别的色谱安全性和可靠性。参考物质作为色谱参考是必不可少的，以确保样品成分的正确识别和分析数据的准确性。在确保测量结果的准确性和可靠性时，它们是不可或缺的 - 为分析带来信心。错误的阅读可能会导致(有时是严重的)错误的决策，这不仅会带来可观的额外工作量，还可能意味着失去信心和经济损失。大量的工作与错误的风险参考标准解决方案仍主要由研究实验室自行生产，但制造本身就意味着大量的工作。开始是所有原材料的采购和正确存储。严格地说，进口检验必须在这里进行，检查原材料的特性和纯度。但是，经验表明，许多实验室依赖制造商的信息，因此从一开始就有可能在其系统中引入不确定性。储存的化学品必须经常监测并检查其稳定性; 如果物质不能按要求的最小量订购，则可能需要处理剧毒物质。最重要的是，多组分标准溶液的生产在实践中准备了相当多的额外支出，并且还增加了错误风险。为了确定最佳的储存条件，必须研究各溶剂中各组分的相容性和彼此之间的相容性。物质在混合物中的代谢通常难以预测，因此必须用经验值来费力和长时间地确定。最后，标准解决方案的每次重复应用都需要与之前的比较测量。就所使用的参考材料的质量而言，考试实验室正在提出更多的要求。这特别适用于ISO 17025认可的实验室。满足这些要求变得越来越复杂和耗时。ISO标准创造信任作为校准，验证和质量控制的一部分，ISO 17025包含对使用参考材料的测试实验室的能力要求。在ISO 17025的更新版本中，计量可追溯性正在发挥越来越重要的作用。测量的溯源性是其准确性和正确的判断测量不确定度的一个重要先决条件。为了确保在任何地方和任何时间的可比性，必须有一个通用的计量参考这正是定义了什么是正确的。它要求追溯到一个由标准化机构或具有公认能力的制造商提供的定义参考。在德国，认证参考材料的开发是柏林联邦材料研究和测试研究所(BAM)的一项任务; 在美国，认证参考材料由美国国家标准与技术研究院(NIST)开发和提供。购买商业制造商提供的认证参考标准解决方案也是可能的。为了建立对使用参考标准的信任，国际标准化组织在20世纪90年代制定了ISO指南34，该指南通过众多指导原则对参考标准的制定进行规范，并接受严格的测试。作为定期认证的一部分，参考标准制造商必须向当局证明其符合全球质量标准。在德国，认证由德国认证机构(DAkkS)授予。在美国，认证中心是美国实验室认可协会(A2LA)。ISO标准最终确保了所需的可追溯性，并赋予实验室对制造商能力的必要信心。根据ISO指南34和ISO 17025质量标准制造的参考标准被称为ISO指南下的认证参考标准。

 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。1.3 平板划线法最/简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。1.4 稀释摇管法用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。2、用液体培养基分离和纯化大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95%)表现为不生长。3、单细胞(孢子)分离只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类是稀释法的一个重要缺点。在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(或单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。4、选择培养分离没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。自然界中，在大多数场合微生物群落是由多种微生物组成的，从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释法几乎是不可能的。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。4.1 利用选择平板进行直接分离根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如要分离高温菌，可在高温条件下进行培养;要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离;有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。4.2 富集培养富集培养法原理和方法非常简单，利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，很容易地分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。5、二元培养物分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是很难做到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。另外，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

在环境监测和实验室分析测定时，常常使用三氯甲烷、四氯化碳和石油醚等有机溶剂。这些试剂化学性质不活泼、不助燃，与酸、碱不起作用，处理起来比较困难。其易挥发，具有一定的毒性，污染环境。本文根据实验室试验及使用试剂的要求，探讨有机试剂的回收和循环利用。一、回收方法：1.活性碳吸附法活性碳吸附法回收有机废液装置，在长吸附柱底部装入一层脱脂棉，起过滤作用，防止活性碳粉末随废液流入回收瓶中，同时可以进一步除去废液中剩余的水分；在吸附柱中部装入颗粒状活性碳(粉末状活性碳过滤性能差，易堵塞吸附柱)，除去废液中的杂质。在吸附柱顶部装入一层脱脂棉，除去废液中的水分，同时滤去废液中的颗粒物，起初步净化作用；在吸附柱顶部加一漏斗，用于加入有机废液或待回收的废液，同时可以防止废液蒸发。回收有机废液时，将有机废液通过上部漏斗加入吸附柱中，利用活性碳的强吸附能力进行吸附，以除去废液中能被活性碳吸附的杂质，吸附后的有机试剂流入回收瓶中，在回收瓶口盖上聚乙烯塞子，防止有机试剂蒸发。2.恒温水浴蒸馏法恒温水浴法回收有机废液装置，在恒温水浴锅中装入自来水，插入温度计，将装有待回收废液的蒸馏瓶放置于恒温水浴锅中，接入冷凝管，确保接口密封良好，通入冷却水，冷凝管末端插入废液回收瓶中，在回收瓶口盖上聚乙烯塞子，防止有机试剂蒸发。回收有机废液时，根据温度计读数调节水温，将恒温水浴锅中的水调至所需的温度，废液倒入蒸馏瓶中恒温加热。有机废液受热后蒸发形成蒸气，通过冷凝管冷凝成液体，流入回收瓶中。二、四氯化碳的回收利用对于实验室使用后的四氯化碳废液，可以采用恒温水浴蒸馏和活性碳吸附法进行回收。根据溶解在四氯化碳中的有机物蒸发或气化温度不同和四氯化碳易挥发的特点，部分分析物质的蒸发温度低于四氯化碳的蒸发温度， 可以先将废液倒入蒸馏瓶内，于50～70 ℃(不超过70℃，防止四氯化碳沸腾)的恒温水浴中进行加热蒸馏，初步去除杂质及溶解在试剂中的化学物质。然后将蒸馏后的四氯化碳通过加有颗粒状的活性碳的吸附柱进行吸附过滤，进一步去除溶解在四氯化碳中的化学物质。三、四氯化碳的合格性检验将利用上述方法回收后的四氯化碳,用光程长4cm的玻璃比色皿，在红外分光光度计中于3.1～3.6μm或在波数为3300cm-1～2600cm-1之间的红外波段进行扫描，要求透过率≥90%，在波长3.3μm，3.38μm，3.41μm 或波数为3030cm-1、2960cm-1、2930cm-1处没有明显的吸收峰，其他指标符合GR级四氯化碳标准。如果四氯化碳用于红外分光光度法测定油类时，用光程长4cm 的玻璃比色皿，在红外分光光度计中波数为3300cm-1～2600cm-1之间的红外波段进行扫描，以GR级四氯化碳为参比，测定回收后四氯化碳的油类含量，当四氯化碳中油类的含量低于0.02mg/L 时，也可回用于实验室油类的分析测定。四、三氯甲烷的回收利用1.三氯甲烷的回收对于实验室使用后的三氯甲烷废液，可以采用恒温水浴蒸馏和活性碳吸附法进行回收。由于三氯甲烷能够溶解水中的油类及其它有机物用三氯甲烷进行萃取时，常将水中的有机物萃入试剂中，根据有机物蒸发温度不同，部分分析物质的蒸发温度低于三氯甲烷的蒸发温度，可以先将废液倒入蒸馏瓶内，于50～60℃(不超过60℃，防止三氯甲烷沸腾)的恒温水浴中进行加热蒸馏，初步去除难蒸发的化学物质。然后将蒸馏后的三氯甲烷通过加有颗粒状的活性碳的吸附柱进行吸附过滤，进一步去除溶解在三氯甲烷中的其它杂质。当三氯甲烷中含有乙醇时，除去乙醇的方法是用水洗涤氯仿5～6次后，将分出的氯仿用无水氯化钙干燥24h，再进行蒸馏，收集60.5～61.5℃馏分；或者将氯仿与少量浓硫酸一起振动两三次，每200ml氯仿用10ml浓硫酸，分去酸层以后的氯仿用水洗涤，干燥，然后蒸馏。2.三氯甲烷的合格性检验在1cm或2cm玻璃比色皿中倒入回收后的三氯甲烷，在带光谱扫描的分光光度计中，于400nm～760nm可见光波段进行光谱扫描，透过率 ≥90%，在各波段没有明显的吸收峰，其他指标符合AR级三氯甲烷标准。如果三氯甲烷废液只是分析某一种单独组分，并回用于同类项目的分析测定时，可以在某一特定波长处进行扫描，检查该组分的含量，如无明显吸收峰时即可回用。或者以未使用过的三氯甲烷作参比，测定回收后的三氯甲烷的吸光度或透光度，当该吸光度为0或透光度为100%时，也可回用于该项目的分析测定。五、石油醚的回收利用用石油醚作为萃取剂进行萃取产生的废液中，其中含有少量不饱和烃，沸点与烷烃相近，用直接蒸馏法无法分离。石油醚的精制通常将石油醚用其体积的浓硫酸洗涤2～3次，再用10%硫酸加入高锰酸钾配成的饱和溶液洗涤，直至水层中的紫色不再消失为止。然后用水洗，经无水氯化钙干燥后蒸馏。或者在150ml分液漏斗中，加入100ml石油醚，用10ml浓硫酸分两次洗涤，再用 10% 硫酸与高锰酸钾配制的饱和溶液洗涤，直至水层中紫色不再消失为止。用蒸馏水洗涤两次后，将石油醚倒入干燥的锥形瓶中，加入无水氯化钙干燥1h。蒸馏收集需要规格的馏分。若需绝对干燥的石油醚，可加入钠丝(与纯化无水乙醚相同)。综上所述，使用以上方法能够较好地回收实验室产生的四氯化碳、三氯甲烷和石油醚等有机废液，减少了实验室废液的排放，保护了环境，同时，回收的试剂回用于实验室，节约了成本和费用。附：三废处理注意事项1. 因处理报废试剂费用很高，不得将无毒无害试剂当作有毒有害试剂处理，例如稀HAc、NaOH溶液，固体NaCl、Na2SO4等。2. 提倡自行提纯回收有机溶剂再利用。3. 提倡自行对某些有害废液进行无害化处理，例如，酸碱中和、BaCl2溶液用废H2SO4或废硫酸盐处理等。4. 能相互反应产生有毒气体的废液，不得倒入同一收集桶中。若某种废液倒入回收桶会发生危险，则应单独暂存于一容器中，并贴上标签。5. 化学废弃瓶采用专用回收桶。回收空瓶应经过清洗、无残液。

核酸纯化在分子生物学实验室已经广泛应用。怎样获得高质量、高纯度的DNA或RNA样品对下游实验的顺利进行至关重要，因此，对纯化后的核酸进行鉴定也是必不可少的步骤。本文简单的回顾学习一下核酸鉴定的方法。核酸鉴定包括：浓度/纯度鉴定+完整性鉴定1.浓度/纯度鉴定（1）紫外分光光度计：原理：由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。由于核苷酸最大吸收波长为260nm,根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50?g/ml的双链DNA， 40?g/ml的单链RNA。紫外分光光度法只适用于测定浓度大于0.25?g/ml的核酸溶液。计算公式:dsDNA（?g/?l）=OD260x50x稀释倍数/1000RNA（?g/?l）=OD260x40x稀释倍数/1000纯净的DNA OD260/OD280=1.8，制备的样品DNA比值在1.7-1.9，若洗脱时不使用洗脱缓冲液而使用去离子水，比值会偏低，因为PH值和离子存在会影响光的吸收值。当OD260/OD280当OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量较高。可用RNaseA消化后再进行纯化。OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、盐类或有机试剂污染。

　　优级纯或一级品（GR，精密分析和科学研究 工作）；分析纯或二级品（AR，重要分析和一般研究工作）；化学纯或三级品（CP，工矿及学校一般化学实验）；实验试剂(L.P.)。　　基准试剂含量应该是99.9%～100.2%。随着科学技术和新兴工业的发展，对化学试剂的纯度、净度以及精密度要求愈加严格和专门化。　　在分析化学中应用极为广泛。试剂的品级与规格应根据具体要求和使用情况加以选择 。定级的根据是试剂的纯度（即含量）、杂质含量 、提纯的难易，以及各项物理性质。有时也根据用途来定级 ，例如光谱纯试剂、色谱纯试剂，以及pH标准试剂等等。　　国标试剂：该类试剂为我国国家标准所规定，适用于检验、鉴定、检测　　试剂级（RG，红标签）：作为试剂的标准化学品。　　基准试剂（PT，绿标签）：作为基准物质，标定标准溶液。　　优级纯（GR，绿标签）： 主成分含量很高、纯度很高，适用于精确分析和研究工作，有的可作为基准物质。　　分析纯（AR，红标签）： 主成分含量很高、纯度较高，干扰杂质很低，适用于工业分析及化学实验。　　化学纯（CP，蓝标签）： 主成分含量高、纯度较高，存在干扰杂质，适用于化学实验和合成制备。　　实验纯（LR，黄标签）： 主成分含量高，纯度较差，杂质含量不做选择，只适用于一般化学实验和合成制备。　　教学试剂（）：可以满足学生教学目的，不至于造成化学反应现象偏差的一类试剂。　　指定级 （ZD），该类试剂是按照用户要求的质量控制指标，为特定用户订做的化学试剂。　　高纯试剂（EP）：包括超纯、特纯、高纯、光谱纯，配制标准溶液。 此类试剂质量注重的是：在特定方法分析过程中可能引起分析结果偏差，对成分　　分析或含量分析干扰的杂质含量，但对主含量不做很高要求。　　色谱纯（GC）：气相色谱分析专用。 质量指标注重干扰气相色谱峰的杂质。主成分含量高。　　色谱纯（LC）：液相色谱分析标准物质。质量指标注重干扰液相色谱峰的杂质。主成分含量高　　指示剂（ID）：配制指示溶液用。 质量指标为变色范围和变色敏感程度。可替代CP,也适用于有机合成用。　　生化试剂（BR）：配制生物化学检验试液 和生化合成。质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成　　生物染色剂（BS）：配制微生物标本染色液。 质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成　　光谱纯（SP）：用于光谱分析。 分别适用于分光光度计标准品、原子吸收光谱标准品、原子发射光谱标准品　　电子纯（MOS）：适用于电子产品生产中，电性杂质含量极低 电镀级:适用于电镀工业生产的，对电镀有害的杂质较少，纯度大致高于工业级 ，略低于化学纯。 当量试剂（3N、4N、5N）：主成分含量分别为99.9%、99.99%、99.999%以上。　　电泳试剂：质量指标注重电性杂质含量控制。　　此外，还有特种试剂，生产量极小，几乎是按需定产，此类试剂其数量和质量一般为用户所指定。 合成试剂：所谓合成试剂：就是在标明成分主含量的前提下，严格给出该产品的有关各种物理常数的一类化学试剂。

　　（一）根据产生细胞因子的细胞种类不同分类　　1.淋巴因子（lymphokine)　于命名，主要由淋巴细胞产生，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。重要的淋巴因子有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF和神经白细胞素等。　　2.单核因子（monokine）　主要由单核细胞或巨噬细胞产生，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、G-CSF和M-CSF等。　　3.非淋巴细胞、非单核-巨噬细胞产生的细胞因子　主要由骨髓和胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等细胞产生，如EPO、IL-7、IL-11、SCF、内皮细胞源性IL-8和IFN-β等。　　（二）根据细胞因子主要的功能不同分类　　1.白细胞介素（interleukin, IL)　1979年开始命名。由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用，凡命名的白细胞介素的cDNA基因克隆和表达均已成功，已报道有三十余种（IL-1―IL-38）。　　2.集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)　根据不同细胞因子刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为G（粒细胞）-CSF、M（巨噬细胞）-CSF、GM（粒细胞、巨噬细胞）-CSF、Multi（多重）-CSF（IL-3）、SCF、EPO等。不同CSF不仅可刺激不同发育阶段的造血干细胞和祖细胞增殖的分化，还可促进成熟细胞的功能。　　3.干扰素（interferon, IFN)　1957年发现的细胞因子，初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种物质可干扰另一种病毒的感染和复制，因此而得名。根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，他们分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生。各种不同的IFN生物学活性基本相同，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。　　4.肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF)　初发现这种物质能造成肿瘤组织坏死而得名。根据其产生来源和结构不同，可分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化T细胞产生，又名淋巴毒素（lymphotoxin, LT)。两类TNF基本的生物学活性相似，除具有杀伤肿瘤细胞外，还有免疫调节、参与发热和炎症的发生。大剂量TNF-α可引起恶液质，因而TNF-α又称恶液质素（cachectin)。　　5.转化生长因子-β家族（transforming growth factor-β family, TGF-β family)　由多种细胞产生，主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ1β2以及骨形成蛋白（BMP）等。　　6.生长因子（growth factor,GF）如表皮生长因子（EGF）、血小板衍生的生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-1）、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子（LIF）、神经生长因子（NGF）、抑瘤素M（OSM）、血小板衍生的内皮细胞生长因子（PDECGF）、转化生长因子-α（TGF-α）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。　　7.趋化因子家族（chemokine family)　包括四个亚族：（1）C-X-C/α亚族，主要趋化中性粒细胞，主要的成员有IL-8、黑素瘤细胞生chang刺激活性(GRO/MGSA）、血小板因子-4（PF-4）、血小板碱性蛋白、蛋白水解来源的产物CTAP-Ⅲ和β-thromboglobulin、炎症蛋白10（IP-10）、ENA-78；（2）C-C/β亚族，主要趋化单核细胞，这个亚族的成员包括巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）、MIP-1β、RANTES、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/MCAF）、MCP-2、MCP-3和I-309。（3）C型亚家族的代表有淋巴细胞趋化蛋白。（4）CX3C亚家族，Fractalkine是CX3C型趋化因子，对单核-巨噬细胞、T细胞及NK细胞有趋化作用。

　　PeproTech细胞因子中不含载体蛋白（Carrier Protein）或其他添加剂（如BSA、HAS或蔗糖等），并且通常以最少量的盐来进行冻干处理，因此微量的细胞因子在冻干过程中会沉积于管内，形成很薄或不可见的蛋白层。所以我们建议在收到产品后，务必在开盖前先离心，使粘在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底（此时能否见到白色沉淀均属正常现象）。　　1．离心：高速离心 (10, 000 rpm) 20-30 秒，或低速离心 (2, 000 rpm) 5 分钟。　　2．溶解（Reconstitution）：用去离子水或其它缓冲液（根据说明书要求进行选择）溶解至说明书要求的浓度 (一般为 0.1-1.0 mg/mL，如10ug的产品，需用10uL-100uL的去离子水或缓冲液溶解)。溶解时不可振荡，避免因化学键的断裂造成蛋白失活，可加入适当的溶剂轻摇并静置一段时间，待细胞因子完全溶解后使用。溶剂的选择：　　1）要求用去离子水溶解的产品，务必不可用盐溶液，避免过高的盐浓度造成蛋白不可逆的析出；　　2) 要求用盐溶液溶解的产品，请依照说明书上的浓度，同样也是为了避免过高的盐浓度。　　3．分装和贮存（Aliquot and Storage）：蛋白溶解后可根据自己的实验需要进一步稀释成工作液，稀释可用RPMI 1640、DMEM或PBS等溶液，其中最好含有5-10%的FCS （小牛或胎牛血清）或0.5 %的BSA（牛血清白蛋白）来稳定蛋白。工作液在4℃可保存1周，如需长期保存，则需分装冻存于-20℃ （注意：不可冻存于-80℃）。分装时每管中工作液的体积最好是一次实验的用量，以实现每次实验用完一只工作液，避免反复冻融引起蛋白活性的降低。

　　细胞因子在体内具有重要的病理作用，在感染、炎症、自身免疫病、免疫缺陷疾病等状态下，部分细胞因子会明显变化，根据这些指标可以判断机体的免疫功能。血清、血浆或组织液中细胞因子检测可以对疾病诊断和治疗做出相应评价,具有重要的应用价值。广泛应用于细胞生物学、免疫学以及肿瘤学等领域的流式细胞术是细胞因子检测的一种方法。　　由于血清、细胞培养上清、积液中的细胞因子含量低，不容易检测，加上样本数量少，传统的方法无法满足多因子检测。流式微球捕获芯片技术（CBA）微量样本多重蛋白定量技术，是用流式细胞仪对多重蛋白进行定量检测的方法，能够同时对样本中的多个指标进行定性、定量检测，可用于细胞因子检测。　　流式细胞仪技术（FCM）技术可以应用流式细胞仪，结合单克隆抗体技术、免疫荧光染　　色技术，对快速流动液体中的单细胞进行多种参数测量和分析。CBA 检测系统采用聚苯乙烯荧光微球连结特定的捕获抗体，捕捉待测物，同时再加入待测物的荧光抗体，三者形成夹心复合物，通过流式细胞仪进行检测。流式细胞术的优点是同时可以进行多参数检测，快速并且信息量大。　　（1）能够同时对单个样本进行多种检测　　小鼠血清Th1／Th2／Th17 相关细胞因子是实验中经常会用到的检测指标，由于血清量少很难运用传统的方法如ELISA法进行多因子检测，而CBA 法正好能解决这一问题，它能够一次性对血清中的IL－2、IL－4、IL－6、IFN－Υ、TNF、IL－10、IL－17A进行定量检测。美迪西可以为广大医药研发人员提供细胞因子及生物标志物的检测服务，其生物分析部基础设施齐全、仪器设备先进，拥有的流式CBA、MSD、Luminex系统等高端技术平台可以进行各种single plex或multiplex多形式的细胞因子和生物标志物的检测。　　（2）所需样本量少、灵敏度高等　　传统ELISA方法每项实验样本用量50-200μl，而流式CBA检测技术样本用量少于50μl且分析灵敏度高达2.8pg/mL。对于稀有样本，CBA只需少量样本即可检测细胞因子、抗体、抗原等多个指标。　　（3）稳定性好　　CBA 稳定性好、可重复性高，能避免酶联免疫放大技术使信号失真导致的假阳性。　　流式细胞术检测用于细胞因子检测是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。但由于胞内分析步骤复杂，涉及变异因素多，可能会出现结果不稳定，较难重复等问题。　　如在检测血清时，由于血清成分复杂，细胞因子含量差距大，实验中经常会出现分群不明显、微球聚集、浓度太低等现象，对实验结果造成很大影响。如流式CBA法的微球由聚苯乙烯材料制作而成，血清加入微球之后如果没有充分涡旋，容易沉淀聚集，细胞因子不能充分跟微球结合，导致多群甚至聚集现象发生，检测结果将是无效的。需要从制备混合微球开始到加入实验管，直到上机检测前每一步都必须充分涡旋，以避免微球发生聚集。　　而且CBA操作过程繁琐，对实验人员技术要求高，从一定程度上限制了其广泛使用。因此在具体实验过程中，需要多次摸索，结合实验中所遇到的问题进行分析，找出解决问题的办法，并在今后实验中规避实验中的一些问题的出题，来提高实验的有效性和准确性。

1、在提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；在EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟。3、取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟。4、按照每1mlTRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。Ps:在收集到生物材料之后，最好马上进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

牛血清白蛋白(BSA)产品种类繁多，可满足不同种的应用。但是该怎么选择呢，目前BSA大致分为标准级BSA、BSA第五组分、无IgG试剂级BSA、无蛋白酶BSA、无脂肪酸BSA、低内毒素BSA、无蛋白酶/IgG BSA、诊断级BSA。我们一起来看一下他们的区别：标准级BSA经热处理的普通BSA产品，可作为组织细胞（微生物、动物及昆虫细胞等）培养养料和培养成分以及蛋白分子量标准组份，为性价比较高的BSA产品，BSA第五组分BSA第五组分较普通的BSA纯度更高。BSA第五组分使用Cohn方法纯化而来，是生物技术级的产品，一般可用于细胞培养，也可作为半抗原载体、保护剂以及蛋白补充物对照等。无IgG试剂级BSA试剂纯级BSA比BSA第五组分具有更好的纯度，该粉末中不含有可能会干扰分析的球蛋白IgG成分。可作为组织细胞培养养料和培养成分以及蛋白分子量标准组份。无蛋白酶BSA无蛋白酶的牛血清白蛋白可用于细胞培养生产蛋白实验，尤其适用于表达对蛋白酶活性敏感的蛋白。另外无蛋白酶的牛血清白蛋白也非常适合。无脂肪酸BSA无脂肪酸BSA可用于脂肪代谢相关分析的载体蛋白，也可与某种特异性的脂肪酸结合以形成白蛋白，可应用于增强细胞培养体系的性能；若实验中脂肪或脂肪酸的存在影响激素或者胆固醇的读数时，这个产品是首选。低内毒素BSA低内毒素牛血清白蛋白是细胞和组织培养非常理想的选择。可作为无血清和合成培养基营养补充剂的载体，另外作为实验室的一般试剂用来稳定和稀释敏感蛋白溶液，也可以作为诊断、分析工具，如ELISA。无蛋白酶/IgG BSA不含有蛋白酶以及RNase酶活性，同时不含IgG，纯度等级更高，作为稀释液或封闭液应用于EIA和ELISA等试验中。诊断级BSA诊断级牛血清白蛋白粉末是专门用于减少可能会产生背景干扰以及细胞培养体系抑制等因素，不含蛋白酶、生物负载以及IgG，具有很低活性的内毒素（低于3.0 EU/mg）。可用于蛋白标准品、稀释剂、偶联物或者酶稳定剂，也可以应用于高灵敏度的免疫分析实验、细胞培养以及杂交实验等。

　　牛血清白蛋白，称牛血清蛋白，又称第五组分，英文名称为Bovine Serum Albumin，也称Bovine albumin，或Cohn Fraction V，简称BSA。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。　　状态： 白色结晶或类白色冷冻干燥粉末;　　溶解性：溶于水，难于盐析　　分子量：66.430 kDa　　等电点：4.7　　纯度：98%　　产品应用:　　酶切反应的应用;　　ELISA及WB实验中，用作封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液;　　生化研究，遗传工程和药物研究;　　标准级别的牛血清白蛋白(BSA, Standard Grade)，可以满足大部分常规实验需求，如用作免疫封闭剂、组织细胞(微生物动物及昆虫细胞等)培养养料和培养成分、蛋白/酶稳定剂以及蛋白定量标准品。　　诊断级别的牛血清白蛋白(BSA，Diagnostic Grade)，可以满足大部分常规实验需求，如用作免疫封闭剂、蛋白/酶稳定剂、稀释剂、载体以及蛋白标准品。另外，还可用于具高灵敏度要求的免疫检测、细胞培养和杂交实验。　　无IgG、蛋白酶、DNase的牛血清白蛋白，适用于RIA和ELISA检测中用作稀释液和封闭剂。也可用于干细胞培养、杂交瘤细胞培养。　　无脂肪酸的牛血清白蛋白(Fatty Acid Free BSA)，其内的脂肪酸含量非常低(0.02%)，几乎可忽略，且易溶解。通常用作微量元素，脂肪酸，激素和生长因子的载体蛋白，加入无血清培养体系。本品允许BSA内加入某些特定的脂肪酸以促进细胞生长。适用于避免脂类或脂肪酸干扰结果的激素或胆固醇分析检测。　　无蛋白酶的牛血清白蛋白(BSA, Protease Free)，经检测无蛋白酶残留。主要用于重组蛋白生产，更适合用于RIA/ELISA实验封闭剂以及抗体稀释液。　　低内毒素的牛血清白蛋白(BSA, Low Endotoxin)，产品中内毒素含量低于2.0 EU/mg，在内毒素水平敏感的细胞培养中，该产品可作为天然载体蛋白使用;适用于无血清或化学成分限定的细胞和组织培养中;有效的稳定和稀释敏感蛋白溶液;也可用于ELISA等诊断检测。

大部分elisa检测均以血清为标本。血清标本可按惯例方法收集，应留意防止溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为符号的ELISA测定中，溶血标本可能会添加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会发生假阳性反应。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃。超越一周测定的需-20℃保存。冻住血清融解后，蛋白质局部浓缩，散布不均，应充沛混匀并防止发生气泡。混浊或有沉积的血清标本应先离心或过滤，弄清后再检测。重复冻融会使抗体效价下跌，所以测抗体的血清标本如需保存作屡次检测，宜少量分装冰存。保存血清自收集时就应留意无菌操作，也可参加适当防腐剂。ELISA试剂盒检测血清的详细留意事项：1) 要留意防止呈现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因而，在以HRP为符号酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很简单在温育过程中吸附于固相，然后与后边参加的HRP底物反应显色。2) 冰冻保存的血清标本须留意防止因停电等形成的重复冻融。标本的重复冻融所发生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发生损坏效果，然后引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应留意，不要进行剧烈振荡，重复倒置混匀即可。3) 标本在保存中如呈现细菌污染所造成的的混浊或絮状物时，应离心沉积后取上清检测。4) 样本的收集及血清别离中要留意尽量防止细菌污染，一则细菌的成长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白发生分化效果;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作符号的测定方法发生非特异性搅扰。5) 血清标本如是以无菌操作别离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则主张冰冻保存。样本的长期保存，应在-70℃以下。

ELISA实验已经做完，做出来的数据是否准确，有没有达到自己的预期，这些都是有很多条件决定的，具体有哪些条件呢，今天就让远慕生物为您介绍！首先要选择优质的试剂优质的试剂是良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有差异，国内医学检验一般均用板式点。 本文将叙述板式ELISA各优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。其次 ，样本的选择可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。最后，注意elisa试剂盒的操作步骤在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。