凝胶层析（又叫凝胶过滤或分子筛）凝胶层析是指混和物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分类的技术。1.  原理凝胶层析的固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样。常用凝胶有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶等。葡聚糖凝胶介质是由多聚葡聚糖与环氧绿丙烷交连而成。zui常用的葡聚糖凝胶层析介质是Sephadex G系列，不同型号的凝胶用G表示，G代表交联度，从G10到G100。“G”后面的数字表示每10g干胶的吸水量，可根据待分离混和物分子量大小选用不同“G”值的凝胶。2.  分离过程：样品随洗脱液的流动下移3.  影响凝胶柱层析的主要因素（1）层析柱的选择与装填层析柱的大小应根据分离样品量的多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无汽泡。（2）流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物质，并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。（3）加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分离时加样量约为凝胶柱床体积的10%-25%.（4）凝胶再生：葡聚糖凝胶再生使用NaOH（0.2M）和NaCl(0.5M)混合液处理。我司供应各种凝胶系列产品产品编号 产品名称SY2141    葡聚糖凝胶LH-20SY2142    葡聚糖凝胶LH-60SY2143    葡聚糖凝胶G-10SY2144    葡聚糖凝胶G-15SY2145    葡聚糖凝胶G-25SY2146    葡聚糖凝胶G-50SY2147    葡聚糖凝胶G-75SY2148    葡聚糖凝胶G-100SY2149    葡聚糖凝胶G-150SY2149    葡聚糖凝胶G-150SY2150    葡聚糖凝胶G-200SY2250    琼脂糖凝胶2BSY2251    琼脂糖凝胶4BSY2252    琼脂糖凝胶6BSY2253    琼脂糖凝胶CL-2BSY2254    琼脂糖凝胶CL-4BSY2255    琼脂糖凝胶CL-6B  SY2256    琼脂糖凝胶4FFSY2257    琼脂糖凝胶6FFSY2258    丙烯葡聚糖凝胶S-100SY2259    丙烯葡聚糖凝胶S-200SY2260    丙烯葡聚糖凝胶S-300SY2261    丙烯葡聚糖凝胶S-400SY2262    丙烯葡聚糖凝胶S-500SY2263    镍-NTA琼脂糖凝胶6FFSY2264    蓝色-琼脂糖凝胶6FFSY2265    蓝色-琼脂糖凝胶CL-6BSY2266    红色-琼脂糖凝胶6FFSY2267    DEAE-葡聚糖凝胶A-25SY2268    DEAE-葡聚糖凝胶A-50SY2269    QAE-葡聚糖凝胶A-25SY2270    QAE-葡聚糖凝胶A-50SY2271    CM葡聚糖凝胶C-25SY2272    CM葡聚糖凝胶C-50SY2273    SP-葡聚糖凝胶C-25SY2274    SP-葡聚糖凝胶C-50SY2275    DEAE-琼脂糖凝胶FFSY2276    CM-琼脂糖凝胶FFSY2277    DEAE-琼脂糖凝胶CL-6BSY2278    CM-琼脂糖凝胶CL-6BSY2350    Q-琼脂糖凝胶HPSY2351    SP-琼脂糖凝胶HPSY2352    Q-琼脂糖凝胶FFSY2353    SP-琼脂糖凝胶FSY2354    DEAE-琼脂糖凝胶FFSY2356    DEAE-琼脂糖凝胶CL-6BSY2450    苯基-琼脂糖凝胶6FFSY2451    苯基-琼脂糖凝胶H.P.SY2452    苯基-琼脂糖凝胶CL-4BSY2453    丁基-琼脂糖凝胶4FFSY2454    丁基-琼脂糖凝胶H.P.SY2455    丁基-琼脂糖凝胶4BSY2456    辛基-琼脂糖凝胶4FFSY2457    辛基-琼脂糖凝胶H.P.SY2458    辛基-琼脂糖凝胶CL-4BSY2550    镍-琼脂糖凝胶6FFSY2551    镍-琼脂糖凝胶H.P.SY2552    蓝色-琼脂糖凝胶6FFSY2553    蓝色-琼脂糖凝胶CL-6BSY2554    红色-琼脂糖凝胶6FFSY2555    肝素-琼脂糖凝胶6FFSY2556    肝素-琼脂糖凝胶H.P.SY2557    谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4BSY2558    谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FFSY2559    谷胱甘肽-琼脂糖凝胶H.P.SY2560    胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4BSY2561    苯甲脒-琼脂糖凝胶6BSY2562    苯甲脒-琼脂糖凝胶4FFSY2563    ConA-琼脂糖凝胶4BSY2564    赖氨酸-琼脂糖凝胶4BSY2565    羧基-琼脂糖凝胶4BSY2566    明胶-琼脂糖凝胶4FFSY2567    环氧活化-琼脂糖凝胶6BSY2568    精氨酸-琼脂糖凝胶4BSY2650    DEAE 纤维素DE-32SY2651    DEAE 纤维素DE-52SY2652    羧甲基纤维素CM-52SY2664    羧甲基纤维素CM-32

　　血清和血浆均是不含细胞（包括血小板）等有形成分的血液液体部分，其主要区别是血清不含凝血因子和血小板，血浆则含有凝血因子，它们的制备方法如下：　　1、血清的制备：获得的血液不能抗凝，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心（一般为3000rpm，离心 5～10min），得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出（注意切勿吸出细胞成分），分装备用。　　2、血浆制备：在盛血的容器中先加人一定比例的抗凝剂（抗凝剂：血液 = 1：9，将血液加到一定量后颠倒混匀，离心（离心条件同上）后所得的上清液即为血浆。初用者最好将上清移至另一清洁容器，吸出血浆时用毛细吸管贴着液面逐渐往下吸，切忌不能吸起细胞成分。　　3、富含血小板血浆制备：将获得的血液经800rpm，离心5min，其上清即为富含血小板血浆。　　血浆与血清区别　　血清　　血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。　　血浆　　相当于结缔组织的细胞间质。是血液的重要组成分，呈淡黄色液体（因含有胆红素）。血浆的化学成分中，水分占90～92％，溶质以血浆蛋白为主。血浆蛋白是多种蛋白质的总称，用盐析法可将其分为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原三类。血浆蛋白质的功能有：维持血浆胶体渗透压；组成血液缓冲体系，参与维持血液酸碱平衡；运输营养和代谢物质，血浆蛋白质为亲水胶体，许多难溶于水的物质与其结合变为易溶于水的物质；营养功能，血浆蛋白分解产生的氨基酸，可用于合成组织蛋白质或氧化分解供应能量；参与凝血和免疫作用。血浆的无机盐主要以离子状态存在，正负离子总量相等，保持电中性。这些离子在维持血浆晶体渗透压、酸碱平衡、以及神经-肌肉的正常兴奋性等方面起着重要作用。血浆的各种化学成分常在一定范围内不断地变动，其中以葡萄糖、蛋白质、脂肪和激素等的浓度最易受营养状况和机体活动情况的影响，而无机盐浓度的变动范围较小。血浆的理化特性相对恒定是内环境稳态的首要表现。　　血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋白原，纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用　　药动实验大部分情况下用血浆，一般血浆药物浓度能反映药物的分布情况，也比血清量多一些。药代动力学不仅仅是做血中的药物浓度，还要做血浆蛋白结合率。药物代谢动力学研究，主要测血浆中的药物浓度，但是如果血浆中中含有的抗凝剂影响药物浓度的测定，就应使用血清样品。　　血浆的制备：将采取的血浆置含抗凝剂（如：肝素、草酸盐、枸橼酸盐、EDTA、氟化钠等）试管中，混合后，2500~3000rpm离心5min，取上清液即为血浆。　　血清的制备：将采取的血浆在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹棒或玻璃棒轻轻拨去血饼，然后以2500~3000rpm离心5-10min，取上清液，即为血清。　　血浆、血清、全血的优缺点：　　血浆与血清中的药物测定值通常是相同的，而且血成分更能接近于组织液，测定血浆与血清中药物浓度比全血更能反映机体的具体情况　　优点 缺点　　血浆 处理速度快，分离速度快， 获取量大； 不如血清干净　　血清 干净，更具有代表性； 获取量小，处理时间长　　当药物与红细胞结合，而且动力学行为与在血浆中不同，须采全血进行研究。

BCA 蛋白定量法是一种快速灵敏、稳定可靠的蛋白定量测定方法，其测定范围是10－2000ug/ml，是比Lowry 法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品。BCA 蛋白定量测定方法：（96孔板）1、配制BCA 工作液: 根据标准品和样品数量，按50 体积试剂A，1 体积试剂B 配制适量BCA 工作液，充分混匀。2、将蛋白标准品按0, 1, 2, 4, 6，8, 10 微升加到96 孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌双蒸水补足到10 微升；取10 微升待测样品加入96 孔板。每个测定要做2-3 个平行。3、向带测样品孔和蛋白标准品孔中加入200 微升BCA工作液（即样品与工作液的体积比为1：20）混匀。4、37℃温浴30min。冷取至室温。5、酶标仪562nm 波长下测定吸光度。6、制作标准曲线，从标准曲线中求出样品浓度。BCA 蛋白定量测定操作注意事项：1、反应颜色的深浅除了与样品的蛋白质浓度相关外，还与反应的温度有关。如果样品的浓度较高（>50μg/ml），反应温度一般采用37 度。如果样品蛋白质的浓度较低（2、该方法检测的蛋白质浓度范围20μg-500μg/ml；当蛋白浓度＜20ug/ml 时，推荐60℃温浴，并将蛋白液：工作液的比例调至1：8 进行测定（增强法）可以检测到5ug/ml。试剂A 和B 在室温的稳定期至少1 年以上。标准蛋白液保存在－20℃,短期则4℃保存。

　　细胞株在体外进行培养，失去了机体的调节和控制，因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境昼接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。　　一、温度：　　一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用。把细胞置于23~25℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓，不过，鱼类细胞的适宜培养温度为23~25℃。　　若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡，但若向培养基中加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）等保护剂，封入安瓿中后，置于液氮或低温冰箱（-70℃）中，可起保护作用，此时细胞可而耐受-70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。　　高温对细胞培养不利。细胞在39~40℃培养1h，会受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2℃，持续数小时，即在41~42℃培养1h，细胞操作严重，温度到43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。　　二、渗透压：　　细胞在高渗透溶液中低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外细胞培养的重要条件。哺乳动物和其他动物组织细胞体外孙女培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电解质与渗透压的关系，渗透压与单位体积溶剂内溶质的分子数和离子娄成正比。　　为此，按一定比例控制培养基中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送（如氨基酸、糖等），直接影响细胞基本合成系统。　　理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压，哺乳动物细胞的渗透压一般为290~300mmol/L，人胚肺成纤维细胞为250~325mmol/L，鼠细胞则为310mmol/L左右。在实际应用中，260~320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。常用培养基的渗透压值见表2-3。　　三、气体环境和PH值：　　体外培植细胞需要理想的气体环境，氧和二氧化碳石细胞生存必需的条件。　　1、氧：　　氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供应给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，单多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态，若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。　　2、二氧化碳：　　采用开放式培养时（碟或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中。CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养基的pH值有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下，细胞容易生长，一般不能低于1%，否则有损细胞。CO2增加将使pH值下降。　　3、pH值：　　大多数细胞适于在pH7。2~7。4条件下生长，低于pH6。8或高于pH7。6对细胞有害，甚至退变或死亡各种细胞对pH值的要求不尽相同。一般原代培养细胞对pH值的碱性的耐受比对酸性的耐受差，偏酸的环境比偏碱的环境对细胞生长有利。为了维持培养环境恒定的pH值，多采用在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。　　四、无毒和无菌：　　无毒和无菌是体外培养细胞的首要环境条件。细胞在深入活体内，细胞株偶尔有细菌或有害物质入侵，因体内有强大的解毒系统和免疫系统，可将其解毒或清除，而不易受损害。但在离体的环境中，失去了防御系统，一旦有害物质入侵或细菌污染，可导致细胞死亡，前功尽弃。　　如培养瓶、培养皿、支持物、培养基、瓶塞上有细胞毒性，在培养过程中可导致细胞死亡因此，在选用这些器皿、材料时要注意，若这些物品消毒不彻底，带菌或操作过程不小心使细胞污染，也会导致细胞死亡。若出现交叉污染，可使实验室原来的细胞系失去原有特性，应引起足够的重视。

　　细胞实验主要包括细胞培养、细胞凋亡和增殖、细胞迁移和侵袭、细胞信号转导和蛋白质表达等内容。这些实验方法的应用可以帮助科学家们深入了解细胞的结构和功能，推动生命科学的发展。　　原代细胞：从体内直接分离的细胞。功能、代谢、形态类似体内细胞的特点，因此原代细胞适用于分析单个细胞形态、代谢、功能。原代细胞的缺点是：细胞均一性差，因为从特定组织取下来的原代细胞可能处于不同的发育时期。增殖能力差、培养时间受限、转染效率低。　　细胞株：原代细胞经过长期培养和筛选后，功能、代谢、形态趋于均一化的无限增殖细胞。适用于整体水平实验。优点是：容易培养、好感染、干扰因素少、便于同步化、实验好操作。缺点是：与整体差别大、可能丧失原代细胞的特性，细胞株在长期传代过程中遗传物质发生变异。所以同一个学名的细胞株，有可能有完全不同的形态、代谢、功能表现。不同代数的细胞株，性质也可能完全不同。　　原代细胞由于转染效率低这个问题，应用受到了限制。自从腺病毒诞生后，因为其超强的感染能力，克服了原代细胞难感染的问题，使得原代细胞的使用变得更加简单。由于细胞实验后，很多时候需要做到动物体内，由于原代细胞有体内细胞的特点，为了细胞实验和动物体内实验的结果更加趋向一致性，因此用原代细胞来进行细胞实验更值得考虑。

酸碱缓冲溶液有三种类型：1、弱酸和它的盐（如：HAc---NaAc）的水溶液组成；2、弱碱和它的盐（如：NH3·H2O---NH4Cl）的水溶液组成；3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐（如：NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液组成。酸碱缓冲溶液的选型：一般应根据具体情况进行选择。缓冲酸性可选用碱性缓冲液，缓冲酸性可采用碱性缓冲液。常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。酸碱缓冲溶液由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。这种溶液称为酸碱缓冲溶液。

一、细胞的基本结构：细胞的基本结构是细胞质、细胞核、细胞膜。细胞分为动物细胞、细菌和真菌和植物细胞。细胞是生物体基本的结构和功能单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体现。动物细胞结构：动物细胞有细胞膜、细胞质、细胞核。动物细胞的细胞质包括细胞质基质和细胞器。动物细胞的细胞器包括内质网、线粒体、高尔基体、核糖体、溶酶体、中心体。动物细胞与植物细胞相比较，具有很多相似的地方，如动物细胞也具有细胞膜、细胞质、细胞核等结构。但是动物细胞与植物细胞又有一些重要的区别，如动物细胞的最外面是细胞膜，没有细胞壁;动物细胞的细胞质中不含叶绿体，也不形成中央液泡。而高等植物细胞没有中心体。细菌和真菌结构：细菌有细胞壁，细胞膜，细胞质，拟核。真菌有细胞膜，细胞质，细胞核。细菌和真菌的细胞质包括细胞质基质和细胞器；细菌无成型细胞核，其细胞核是由遗传物质聚集形成的拟核，拟核没有核膜及核仁。有些细菌还带有鞭毛。细菌的细胞器只有核糖体一种，真菌的细胞器包括：内质网，线粒体，高尔基体，核糖体，溶酶体。植物细胞结构：植物细胞结构植物细胞是植物生命活动的结构与功能的基本单位。它由原生质体和细胞壁两部分组成。原生质体是细胞中有生命的部分，包括细胞核和细胞质。细胞核包括核膜、核仁、染色质和核基质四个部分，在传递遗传性状和控制细胞代谢方面起着重要作用。细胞质包括胞基质和细胞器，经常处于运动的状态。细胞质的外表为质膜，紧贴于细胞壁。质膜有选择透过性，与控制细胞内外物质的交换、接受外界信号、调节细胞生命活动等有关。细胞器包括线粒体、质体、内质网、高尔基体、液泡、溶体、圆球体、微体、核糖核蛋白体、微管、微丝等。质体是植物有的细胞器，有白色体、叶绿体和有色体三种。液泡具有贮藏、消化以及调节渗透等功能。 二、细胞的主要组成部分：细胞主要由细胞核与细胞质构成，表面有细胞膜。高等植物细胞膜外有细胞壁，细胞质中常有质体，体内有叶绿体和液泡，还有线粒体。动物细胞无细胞壁，细胞质中常有中心体，而高等植物细胞中则无。细胞并没有统一的定义，比较普遍的提法是：细胞是生物体基本的结构和功能单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体现。一般来说，细菌等绝大部分微生物以及原生动物由一个细胞组成，即单细胞生物，高等植物与高等动物则是多细胞生物。细胞可分为原核细胞、真核细胞两类，但也有人提出应分为三类，即把原属于原核细胞的古核细胞独立出来作为与之并列的一类。研究细胞的学科称为细胞生物学。组成细胞的基本元素是：O、C、H、N、Si、K、Ca、P、Mg，其中O、C、H、N四种元素占90%以上。细胞化学物质可分为两大类：无机物和有机物。在无机物中水是最主要的成分，约占细胞物质总含量的75%－80%。

 　　细胞培养（cell culture）就是从机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养基 中，让这些细胞生长和增殖。体外细胞培养最常见的是合成培养基如DMEM,F12,MEM等混合一定比例的牛血清进行培养；但是大量使用牛血清制品有许多缺陷，如，动物源成分，无法用于临床研究；成分复杂，批间差大，质量不稳定，重复性差，影响实验和生产，而且极易引起交叉污染；所以无血清培养正在替代有血清培养；　　无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。　　添加组分　　1. 促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。　　2. 促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。　　3. 酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。　　4. 结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。　　5. 微量元素：硒是最常见的。　　使用方法　　目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。　　为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：　　1. 处于对数生长中期　　2. >90% 活细胞率　　3. 适应时以较高的起始细胞接种　　细胞适应无血清培养基的方法　　1. 直接适应--细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。　　2. 连续适应--分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。　　3. 特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。　　无血清培养基的优点　　1. 可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。　　2. 避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。　　3. 避免血清组分对实验研究的影响。　　4. 有利于体外培养细胞的分化。　　5. 可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。 

　　菌种提纯复壮的几个主要方法　　1、纯种分离法　　通过纯种分离，可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。　　2、宿主体内复壮法　　对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接，结瘤固氮能力减退，将其回接到相应豆科宿主植物上，令其侵染结瘤，再从根瘤中分离出根瘤菌，其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。　　3、淘汰法　　将衰退菌种进行一定的处理(如药物，低温、高温等)，往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。如有人曾将大菱鲆胃肠道内提取的芽孢杆菌的分生孢子在低温(-10℃～  -30℃ )下处理5～7 d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。　　4、遗传育种法　　即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。

　　流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与特定细胞分子结合的蛋白或配体，如与 DNA 结合的溴化丙啶 (PI)等。　　染色步骤包括：将培养的细胞或组织样品制成单细胞悬液，然后将细胞放入管子或酶标板中与荧光标记或未标记的抗体孵育。之后将细胞放入流式细胞仪中进行分析。　　悬浮缓冲液中染色的细胞样品通过流式细胞仪时，由于鞘液的作用被限制在液流的轴线上，从而通过一个非常小的喷嘴。这种微小的"流液束"使细胞一个接一个地通过激光，细胞/粒子通过通道时散射的光线被多个探测器检测到。其中光柱前有一个检测器（称为前向角散射或简称 FSC），它的旁边有几个检测器（称为侧向散射或简称 SSC）。荧光检测器用于检测荧光染料本身。粒子/细胞通过光束时，将出现光线散射，散射会通过前向散射和侧向散射被检测到。散射和荧光数据会结合起来分析。其中前向角散射光与细胞的大小有关；而侧向角散射则依赖于粒子/细胞的密度（比如胞浆颗粒数量，细胞膜尺寸），并往往以这种方式，根据不同的大小和密度的差异而将细胞群区分开来。当由相应激发波长的激光激发时，用于检测或染色的荧光染料就会发光。这些粒子/细胞就可分别被检测并进行数据分析。　　直接染色：　　直接免疫荧光染色时，细胞与直接结合有荧光染料（如 FITC 标记）的抗体孵育。它的优点在于只需要抗体孵育这一个步骤，从而消除了来自二抗的非特异性结合的可能性。这对细胞内染色特别有用，由于大的抗体荧光分子复合物包括二抗被困在细胞内造成背景，或甚至无法进入细胞，阻止了一抗的检测。　　间接染色：　　间接染色时，一抗不是荧光染料直接标记的，而是通过荧光染料标记的二抗检测。另外可选择使用亲和-生物素系统，即抗体与生物素结合并且通过荧光染料标记的亲和素来检测。随着标记二抗越来越多的应用，可针对不同的目标蛋白制出未标记的一抗，然后用标记二抗进行流式细胞仪分析，这拓宽了研究者对目标蛋白的选择范围。　　细胞内染色：　　应用流式细胞术的细胞内源性抗原在染色时，应采取各种不同的固定和通透方法，以使抗体能接近胞内蛋白。　　任何情况下，要获得成功的染色都必须对实验条件进行优化，包括测定抗体效价，采用合适的对照设定流式细胞仪，并且（如有必要）优化样品的固定和通透方法。　　选择荧光结合染料　　对一个给定的抗体，从阴性中分辨出阳性细胞的能力，往往取决于所用的荧光结合染料。　　各种荧光染料相对强度的一般准则是，从zui亮到zui暗，PE（藻红蛋白），PE-Cy7，PE-Cy5，APC > APC- Cy7，Alexa Fluor 47，Alexa Fluor 700 > FITC，Pacifi c Blue，Alexa Fluor 488。这是使用信噪比的一般模式，但对于个别抗体仍有些差异。　　一个高表达的抗原通常可以被几乎所有的荧光团分辨。一个低强度表达的抗原可能需要使用较亮的 PE 或APC，提信噪比，把未染色细胞中足够分离出阳性细胞。　　荧光染料强度的相对差异取决于仪器，这是因为在不同的仪器上激光和过滤器的组合差异。一定要使用适当的FACS。　　流式细胞术常见问题分析　　无信号/荧光强度弱　　不正确的信号补偿　　检查流式细胞仪阳性单一颜色对照是否正确，通道和补偿设置是否能正确地捕获所有粒子。　　没有足够的抗体来检测　　增加抗体的量/浓度　　无法接近细胞内目标　　检查目标蛋白是否在细胞内。对于胞内染色，确保有足够的通透性。为防止细胞表面蛋白质的内化，该过程应用冰冷的试剂，在冰上或 4 °C进行，以终止一切反应。加入叠氮钠可防止表面抗原的修饰和内化带来的荧光强度的损失。对于细胞系染色，胰蛋白酶可以引起细胞表面蛋白质的内化，尤其是细胞表面分子，可能需要更温和的分离方法。　　细胞内染色结合荧光分子太大　　对细胞内染色实验，荧光分子应具有较小的分子量。大分子量荧光染料会降低抗体的动力和其进入细胞的可能性。　　激光器未对齐　　确保流式细胞仪的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微球来调整路线。如果激光器不能正确对准或发生漂移时，您可能需要考虑此机的客服。　　目标蛋白不存在或处于低水平表达，确保组织或细胞类型表达的目标蛋白处于一个足够检测的量。　　可溶性或分泌型目标蛋白　　目标蛋白是否可溶并从细胞内分泌？需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里以便流式细胞仪能很容易检测到。通过高尔基体封闭的步骤，比如加入 Brefaldin A，可提高细胞内染色信号。　　补偿过高或增益过低　　使用阳性对照再次设置流式细胞仪，利用补偿以确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理的范围内）。　　荧光分子的荧光逐渐消退，抗体可能放置时间太长或没有避光，新鲜抗体是必需的。　　一抗和二抗不匹配　　二抗应该是和一抗来源物种相同（例如*抗体来源于兔，就要使用抗兔的第二抗体）。　　荧光强度过高　　抗体浓度过高　　这将导致较高的非特异性结合或非常高的荧光强度。减少每个样本中加入的抗体量。　　过量抗体被困　　这是细胞内染色特有的问题，较大的荧光分子使抗体被困在细胞中。确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton。　　封闭不足　　与封闭步骤一样，抗体中加入1-3% 封闭试剂。　　背景高或阳性细胞百分比高　　增益设置过高或补偿过低　　使用阳性对照再次设置流式细胞仪，用补偿减少小颗粒背景并减少增益以降低信号。　　抗体过量　　降低抗体浓度。您还可以在洗涤缓冲液中添加去污剂，以确保洗去多余的抗体。观察到两个或多个细胞群但应该只有一群细胞不止一类细胞表达目的蛋白检查样品中所有细胞类型的预期表达水平，如果必要确保细胞充分分离。　　出现细胞双峰　　细胞双峰在图上显示两倍的荧光强度的第二种细胞类型。染色前轻轻地混合细胞，在放入流式细胞仪前用吸管再次混匀，也可以筛选或过滤细胞以除去团块（30 μm 的尼龙网）。　　侧向散射背景偏高（来自小颗粒）　　细胞裂解　　确保样品中细胞没有裂解和破裂。样品应是新鲜的并且是正确制备的。细胞不能高转速离心或剧烈震荡。　　细菌污染　　确保样品不受污染。细菌会低水平自发荧光，这也会导致高粒子率。　　低粒子率　　每毫升的细胞数量太少 制备 1 × 10 6 个细胞/ml。确保细胞充分混合（操作要轻）。　　细胞聚集，阻塞管道　　染色前轻轻吹打几次确保形成同源单细胞悬液。确保运行之前再次混匀。在的情况下，可筛选或过滤细胞以去除团块（30 μm 的尼龙网）。

　　细胞培养的体内、外细胞的差异和分化　　1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。　　2、分化：细胞分化的实质是基因选择性表达的结果，在个体发育过程中基因按照一定程序相继活化的现象，称为基因的差次表达（differential expression）或顺序表达（Sequential expression） 。即在同一时间内不是所有的基因都具活性，而是有的有活性，有的无活性，有些细胞是这部分基因有活性，有些细胞则是另外一些基因有活性。　　组织特异性基因和管家基因 一类是维持细胞最基本生命活动的基因，是所有一切细胞都需具备的，由此译制基本生命活动所必需的结构和功能蛋白。这类基因称“House-keeping gene”，译为“管家基因”，它们与细胞分化关系不大。如编码与细胞分裂、能量代谢、细胞基本建成有关的蛋白质的基因属此类。另一类是译制特异蛋白质的基因，与细胞的基本生存无直接关系，但与细胞分化关系密切，被称为“Luxury gene”，译为奢侈基因。　　组合调控引发组织特异性基因的表达 弄清了细胞分化的实质，研究者们便把注意力集中到基因选择表达的控制机理方面。除细胞核与细胞质的相互作用对细胞分化的影响外，包括环境在内的诸多因素均对细胞分化有重要的影响。

 　　（酶联免疫吸附剂测定）是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本的处理对于实验的成功有着举足轻重的作用。 利用进行检测的样本类型包括常见的血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等，这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到实验的结果。下面就常见细胞处理方法的整理，希望对您有所帮助。　　细胞样本根据目的物所在部位可选择细胞裂解液或细胞培养上清作为样本。 需要注意的是： 因该类样本干扰因素较多， 如细胞状态、 细胞数量(大于 10^6)、ph(约为 7)、培养基盐离子浓度、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。　　如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可选择细胞培养上清作为样本，如果目的物主要存在于胞内，则建议选择细胞裂解液作为样本类型。细胞培养上清处理方法相对简单，取细胞培养上清，1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测。　　细胞裂解液：　　1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集） ；　　2）将收集到的细胞用冷PBS 洗3次；　　3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融） ：　　⇒ 超声破碎：取适量PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂；　　⇒ 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复3次，使细胞溶胀破碎；　　4）将标本于2-8 度 1500×g 离心 10 分钟，收集上清备用。　　一般情况下，物理方法如反复冻融，匀浆等方法会比化学方法好，因为化学方法会引入酸或碱，可能会对ELISA实验产生影响。我们也做了相关实验来评测化学提取液和洗涤剂对ELISA检测的影响，如 RIPA、TritonX-100、NP-40和SDS、脱氧胆酸钠、β巯基乙醇、DTT 和尿素。根据我们的质检结果，高浓度的洗涤剂会影响ELISA检测的终结果。然而，其效果会洗涤剂浓度的降低而减少。与其他化学裂解缓冲液相比，1％的 Triton X-100 和 1％NP-40 对 ELISA检测的影响较小。如果一定要用化学提取方法的话，推荐用这两种洗涤剂来提取靶蛋白。利用化学的细胞裂解液裂解细胞，如果去污剂成分会干扰抗原抗体反应影响检测效果，推荐利用透析和超滤的方法除去去污剂成分。　　处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存， 4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80度不应超过2个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。样本的处理是实验成功的第1步, 以上就是关于常见样本处理方法的一个简述，供研究者参考。 

　　一、实验步骤：　　（1）样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。　　（2）样品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。　　（3）染核：苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。　　（4）分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。　　（5）染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。　　（6）吹干或自然晾干细胞 爬片后，中性树胶封片。　　若细胞用4%多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。　　二、注意事项：　　1、染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。　　2、切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。　　3、切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。　　4、在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。　　5、切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。　　6、最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

细胞死亡是所有生物的基本过程，通过不同的机制发生。程序性细胞死亡的三种主要类型是凋亡、焦亡和坏死，每一种途径都使用复杂的分子和细胞机制。尽管每种途径都有特定的机制和结果，但它们具有共同的组成部分和特征。凋亡（即 I 型细胞死亡）是程序性细胞死亡（PCD）的严格调控形式，可触发细胞自我毁灭而不受任何外部影响。它是生命的重要组成部分，特别是对于必须控制细胞的生长、发育和更新以维持体内平衡的多细胞生物而言。凋亡是胚胎正常发育的关键，典型例子如手指之间的细胞为了分开手指而凋亡。自噬（即 II 型细胞死亡）也经常被归类为一种程序性细胞死亡。然而，随着时间的推移，它可以促进细胞存活以及细胞死亡，这取决于环境。自噬是溶酶体吞噬细胞器和其他内容物以清除不必要或功能失调的成分的过程。该关键机制允许细胞材料的系统降解和回收。坏死（即 III 型细胞死亡）被认为是由于极端外部生理压力或 ACD 而偶然发生的过程。然而，近年来，研究人员阐明了特定的受调节分子机制，这些机制可在细胞处于应激状态且无法使用其他细胞死亡方法时触发。其中一些受调节的坏死细胞死亡通路，包括坏死性凋亡、焦亡、铁死亡和 NETosis。远慕生物提供细胞凋亡检测试剂盒(仅供科研使用)：Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒 货号：R31628Hoechst33342/PI细胞凋亡染色试剂盒 货号：R0365细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒 货号：R0371细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 货号：R0370结晶紫细胞凋亡检测试剂盒 货号：R3162

　　WB免疫印迹法，也称免疫转移技术IBT(Immunoblotting)，是Towbin将1975年Southern发明的Soutnern blotting技术应用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫学检测方法。其操作简便，主要用于未知蛋白检测及抗原组分、抗原决定簇鉴定，同时也用于未知抗体的检测和单抗鉴定等，在生物学基础研究和临床疾病早期诊断和预后跟踪分析方面都有应用。　　WB实验中使用到的有三种抗体：一抗、二抗和内参抗体。一抗是唯一针对目标抗原的抗体，可以进行制备也可以购买现货，难度系数较高；二抗直接买就OK，只是需要留意下种属选择；内参抗体必不可少，是WB实验中的质控环节。　　那么，在制备抗体或者选择抗体时，是不是十分纠结？今天，远慕跟大家聊一聊。　　WB检测之一抗　　一抗制备　　如果目的蛋白的现货抗体没有找到，或者都不中意，就需要亲自动手制备了，请公司帮你做也不错哦！自己制备一抗通常情况下可以选小鼠、兔制备多抗或者选小鼠制备单抗，前者省时省钱，后者耗时耗财却各有优缺点。多抗制备出来容易产生杂带，却容易出结果，单抗制备出来能得到单一条带及一张漂亮的WB图片，拿去炫耀下也不错。然而做单抗如果没有强有力的细胞培养、融合、筛选经验，也有各种意想不到的结果。比如完败，或者只筛到一株却不能做WB。不过在每一步实验中注意细节还是可以得到满意的抗体的。　　多抗制备过程：　　第一步：免疫及效价检测。看似只是把抗原打进动物体内，其实暗藏玄机，不同的免疫方式效果不一。通常情况下，免疫效果排序如下：皮内>皮下>腹腔>静脉，通常采用皮内或皮下免疫。免疫剂量过多过少均会产生免疫耐受，一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次，兔每次每只免疫300-500 μg共5次。每次免疫后测定效价均要设置对照，以排除各种情况导致的ELISA假阳性或假阴性。　　第二步：取血。小鼠取血通常采用眼球取血，一只小鼠可得到大约1.5 mL的抗血清。兔取血通常采用颈动脉取血，一只兔可得到大约25 mL的抗血清。　　第三步：抗体纯化。单抗的纯化使用proteinA/G即可，得到的都是均一性的抗体分子。多抗的纯化可以采用proteinA/G或抗原亲和纯化，后者筛掉了一些非特异性的IgG，留下的都是能与抗原结合的抗体，所以能在一定程度上避免WB结果的杂带问题。　　单抗制备过程：　　第一步：参照多抗制备的第一步。　　第二步：细胞融合。细胞在融合的过程中非常脆弱，所以劲道要轻、时间要把控好，一般按照标准的融合方案来，做到能一手画圆一手画圈，此步需要向郭靖童鞋学习，手不要抖则基本达标，可以在融合板里看到很多圆溜溜的单克隆。　　第三步：亚克隆。基本上程序化操作，对细胞吹打不要太狠就行。　　第四步：筛选检测。细胞融合及亚克隆后都要对细胞上清进行筛选检测。细胞单克隆在生长过程中容易因为外力散落成不规则形状而影响判断，或许一个很好的阳性克隆就这么被忽略掉了。所以千万不要让你的板子磕到了，尤其是融合的细胞板换液时更是要极其小心。当然，如果不嫌麻烦可以把融合板的单克隆挑到新的细胞板再进行检测。　　第五步：腹水制备。将筛选的阳性单抗细胞株注射到小鼠腹腔，经过一段时间小鼠腹腔会产生含高浓度单抗的腹水。注射的细胞数量不宜过多或过少，过少会导致不生成腹水或周期过长，过多会导致小鼠过早死亡。一般一只小鼠腹腔注射10^6个细胞即可，大约2周即可取腹水。　　第六步：参照多抗制备的第三步。　　一抗选择　　如果有现货，就不用花时间精力再去自己制备啦，快来get现货一抗选择新技能！　　①抗体的说明书中明确指明可用于WB检测的是首选。但没写不表示不能做，可能厂商没有验证，如果确实需要这个或者只有这一个，可以向厂商申请试用装哦。　　②抗体适用的种属也是需要考虑的。说明书中也会写明，如果研究样本的来源物种不在列表里，也并不代表就不能使用，不过最好不用。当然抗体的适用性与不同物种统一蛋白的序列相似性有关，用信息学的方法比对一下可以预测抗体是否可用，如果同源性较高的话还是可以选择的。　　③抗原类型也需要审视。免疫原不限于蛋白，菌体或细胞都可以作为免疫原，在选择时要进行区分。比如要检测的是蛋白的区段或同型物，就要选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。　　④如果一抗是未标记的，后续还需使用二抗，则选择的一抗来源物种与样本来源物种要避免相同导致交叉反应。比如检测大鼠组织内目的蛋白，则最好选兔抗鼠的一抗，而不选择小鼠来源的一抗。如果一抗是标记的，则可以不考虑这个问题。　　远慕生物提供各类抗体试剂：

抗体和重组蛋白无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。1. 收到抗体和重组蛋白后的操作收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋白是溶液态），请务必在 4℃，12000rpm，离心 3 分钟，再打开管盖进行分装、溶解和保存（如果抗体和重组蛋白体积小于 50?l，请延长离心时间至 5 分钟，以保证全部抗体和重组蛋白均离心下来，干粉状态的同样适用）。抗体和重组蛋白使用特制的储存管，只有在 12000rpm 离心 3 分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体和重组蛋白全部离心下来（即使是在 10000rpm 离心也会离心不完全，导致出现抗体和重组蛋白的量不足的现象）。请详细阅读说明书，并按照推荐的保存条件正确保存和使用抗体和重组蛋白。2. 抗体和重组蛋白的长期保存对于 大部分抗体和重组蛋白，比较合适的保存方式是：抗体分装后保存在 -20℃，重组蛋白分装后保存在 -80℃。（1）分装可以-大程度的降低反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体和重组蛋白造成的污染可能性。（2）分装的量以一次实验用完为好，少不能少于 10 ?l 每份。因为分装体积越小，抗体和重组蛋白的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。（3）复融后的分装抗体和重组蛋白如果一次用不完，将剩余母液保存在 4℃，避免再冻起来。（4）抗体和重组蛋白工作液应该当天配制当天用完，4℃ 保存尽量不要超过 1 天。（5）绝-对避免将抗体和重组蛋白保存在自动除霜冰箱中，将抗体和重组蛋白保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。3. 抗体和重组蛋白的短期保存大部分的抗体和重组蛋白收到后 4℃ 短暂保存 1~2 周，对抗体和重组蛋白活性没有影响。如果抗体和重组蛋白很快会使用（1~2 周内），推荐在 4℃ 保存，这是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害。关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体和重组蛋白。4. 抗体和重组蛋白的运输条件一般的运输过程需要 1~2 周的时间，所以是在低温 4℃ 的条件下来完成的。4℃ 运输主要的目的是为了避免反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体和重组蛋白是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中一般避免干冰运输。5. 抗体和重组蛋白的稳定性（1）抗体的稳定性是自然界长期进化的结果，抗体是免疫系统中重要的分子之一，其稳定性是自然进化筛选的结果，在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳定的结构。（2）抗体的高Tm值，在室温下，甚至短时间温度达到 50~60℃，抗体分子都能维持正确折叠，保持其应有的活性。（3）抗体和重组蛋白的纯度。 采用先进的抗体和重组蛋白纯化技术，确保抗体和重组蛋白产品的高纯度，保障其抗体和重组蛋白产品的稳定性。（4）抗体和重组蛋白的浓度。高浓度的抗体和重组蛋白产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓度的抗体和重组蛋白稳定性更好。 大部分抗体和重组蛋白浓度为 1mg/ml，抗体和重组蛋白纯度高，特异性好，效价更高。6. 重组蛋白的特性重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在 -80℃ 条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。（1）原核细胞表达的重组蛋白。 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白 100?g，用 86?l 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。（2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。（3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。

PBS缓冲液是一种广泛应用于生物化学实验中的缓冲溶液，它的全称是Phosphate Buffer Saline (PB)，中文通常称为"磷酸盐缓冲盐溶液"或者"磷酸盐缓冲生理盐水"。这种溶液之所以能够保持稳定的pH值，主要得益于其中的磷酸缓冲对（H2PO4-和HPO42-）。在PBS中，阴离子主要是碳酸氢根离子(HCO3-)，而阳离子则是钠离子(Na+)或钾离子(K+)。这些离子共同构成了一个稳定的酸碱平衡体系，使得PBS能够在一定的范围内保持稳定的pH值。因此，PBS不仅适用于作为培养基的成分之一，还可以用于稀释试剂、清洗仪器等场景。配制PBS缓冲液：首先需要准备一定量的磷酸氢二钠(Na2HPO4)和无水氯化钠(NaCl)。将磷酸氢二钠溶于水中，得到磷酸氢二钠溶液；然后将无水氯化钠加入到水中，得到氯化钠溶液。接下来，将磷酸氢二钠溶液缓慢地加入到氯化钠溶液中，同时不断搅拌以使两者充分混合。在这个过程中，由于磷酸氢二钠溶液中的碳酸氢根离子与氯化钠溶液中的氯离子发生反应，生成了碳酸氢钠(NaHCO3)和水，从而形成了磷酸盐缓冲对。最后，将配好的PBS缓冲液过滤除菌后，即可使用。需要注意的是，PBS的pH值会随着浓度和温度的变化而发生变化，因此在使用时需要进行实时监测和调整。此外，PBS缓冲液具有一定的盐分含量，因此在某些特殊实验场合下可能需要使用无盐或低盐的缓冲液。PBS磷酸盐缓冲液的常用范围：磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液:5.8-8.0；磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液:4.92-8.18；磷酸二氢钾–氢氧hua钠缓冲液:5.8-8.0；磷酸缓冲液和磷酸盐缓冲液的区别：磷酸缓冲液是鉴于PO43-,HPO42-,H2PO4-之间的缓冲能力而有其中的任意两种组成的缓冲液,而磷酸盐缓冲液是指由氯化钠,氯hua钾,磷酸二氢钾,磷酸氢二纳而配成的溶液。1×PBS缓冲液，经过除菌处理，可直接使用。?4℃保存可延长产品保质期，长期不用建议低温保存。1×PBS缓冲液工作液能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力，是生物学中经常使用的缓冲盐溶液，用于分子克隆及细胞培养等，pH为7.4，与人体血液等渗，本产品为1×工作液，经过除菌处理，可直接使用。?4℃保存可延长产品保质期，长期不用建议低温保存。

白细胞介素，简称白介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白介素ELISA检测试剂盒两大问题问题一：造成白介素ELISA试剂盒结果异常的原因A、试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响。B、试剂盒、样品用前未平衡至室温。C、加入试剂的体积和时间有误，移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁。D、必须在有效期内使用，超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。E、孵育时间及孵育温度未达到要求，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。F、洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力。G、蒸馏水水质有问题。H、洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求，洗涤冲击力太大，浸泡时间太长。I、显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入。问题二：白介素ELISA试剂盒显色反响应避光运用白介素ELISA试剂盒目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色明晰者为阳性。但在ELSIA试剂盒中，正常人血清反响后常可呈现呈色的本底，此本底的深浅因ELISA试剂盒的构成和试验的条件不一样而异，因而试验中有必要加测阴性对照。阴性对照的构成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判别成果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。此刻酶催化无色的底物生成有色的产品。反响的温度和时刻仍是影响显色的要素。在必定时刻内，阴性孔可坚持无色，而阳性孔则随时刻的延伸而呈色加强。恰当提高温度有助于加快显色进行。在定量测定中，参加底物后的反响温度和时刻应按规则力求。ELISA试剂盒定性测定的显色可在室温进行，时刻通常不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显况恰当缩短或延伸反响时刻，及时判别。OPD底物显色通常在室外温或37℃反响20-30分钟后即不再加深，ELISA试剂盒再延伸反响时刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反响结束时参加停止液停止反响。OPD产品用硫酸停止后，显色由橙黄色转向棕黄色。TMB受光照的影响不大，ELISA试剂盒可在室温中置于操作台上，边反响调查成果。但为确保试验成果的稳定性，宜在规则的恰当时刻阅览成果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐步削弱，ELISA试剂盒至2小时后即可彻底衰退至无色。TMB的停止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反响停止。这类停止剂尚能使蓝色维持较长时刻(12-24小时)不褪，是目视判别的杰出停止剂。此外，各类酸性停止液则会使蓝色转变成黄色，此刻可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

　　流式细胞术：即FCM。很多小伙伴在做实验过程中会碰到很多问题，比如：无信号、荧光强度高等一系列问题，接下来就来聊聊流式细胞技术！　　目前，流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与特定细胞分子结合的蛋白或配体，如与 DNA 结合的溴化丙啶 (PI) 等。　　实验原理　　待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管，用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。　　临床应用　　1、 细胞生物学研究　　流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲线。同时可进行多参数分析，即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光，或多种不同颜色的荧光。此外,流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期，鉴别死细胞和活细胞，利用荧光标记配体，还可定量测定细胞表面和内部的受体等。是研究DNA合成和细胞周期的一种非常有用的技术。　　2、细胞免疫学　　结合免疫荧光方法，流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞，此外，流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素，测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度，结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目，以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。　　3、肿瘤学　　应用主要是通过测DNA含量实现的，包括癌前病变检查、早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等。　　正常细胞均是DNA二倍体，当细胞癌基因表达或者由良性的肿瘤细胞转变成恶性肿瘤细胞时，这些细胞中DNA水平会发生改变，这些细胞的DNA倍体变化或者染色体结构异常在FCM检测过程中会以DNA倍体数量的改变表现出来。FCM对DNA异倍体精确的分析是肿瘤诊断、间叶组织良恶性肿瘤判断的重要依据。利用FCM还可以测定肿瘤细胞的增殖活性、分化程度和凋亡水平，这些细胞参数与肿瘤的恶性程度密切相关，并为肿瘤临床治疗方案的选择提供可靠的理论基础。　　4、遗传学　　用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。　　常见问题及解答　　问题：无信号/荧光强度弱　　问题分析：　　1、 不正确的信号补偿　　2、 没有足够的抗体来检测:增加抗体的量/浓度；　　3、 无法接近细胞内目标:检查目标蛋白是否在细胞内。　　4、 细胞内染色结合荧光分子太大　　5、 激光器未对齐　　6、 目标蛋白不存在或处于低水平表达　　7、 可溶性或分泌型目标蛋白　　8、 一抗和二抗不匹配　　9、 荧光分子的荧光逐渐消退　　解决方法　　1、 确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。　　2、确保商品化抗体没有超过有效期。　　3、 确保已正确加入足量的抗体。　　4、确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素，需加入连接有荧光素的二抗。　　5、使用了正确的二抗，就是说二抗能够识别你的一抗。　　6、检测的是PE或APC荧光素的抗体，确保该抗体未被冰冻过。　　7、检测的组织上是否表达该抗原？可查看相关文献了解该抗原的表达情况，或者同时做一个阳性对照。　　问题：荧光强度过高　　问题分析：　　1、 抗体浓度过高　　2、 过量抗体被困　　3、 封闭不足　　解决方法：　　1、 减少每个样本中加入的抗体量；　　2、 确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton；　　3、 与封闭步骤一样，抗体中加入1-3% 封闭试剂；　　问题：观察到两个或多个细胞群但应该只有一群细胞　　问题分析：　　1、 不止一类细胞表达目的蛋白　　2、 出现细胞双峰　　3、 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）　　4、 细胞裂解　　5、 细菌污染　　解决方法：　　1、 确保细胞充分分离；　　2、 染色前轻轻地混合细胞，在放入流式细胞仪前用吸管再次混匀，也可以筛选或过滤细胞以除去团块　　3、 样品应是新鲜的并且是正确制备的。细胞不能高转速离心或剧烈震荡；　　问题：结果与预期相反　　问题分析：　　1、 有些试剂可能会影响某些抗原检测，例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。　　2、 裂解液也可以影响一些抗原检测　　3、 有些抗原是表达在胞内的　　解决方法：　　1、 可采用PBMC提取法　　2、 需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理。

细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。然而，细胞株在体外培养的过程中会出现一些问题，比如：细胞株无法在培养皿上贴壁生长，细胞株生长缓慢，细胞株死亡等。那么该如何解决呢？一、细胞株无法在培养器皿上贴壁生长1.细胞株胰酶消化过度：缩短胰酶消化时间或减少胰酶用量。2.支原体污染：隔离细胞株，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞株被污染，灭菌处理后丢弃。3.培养基中无附着因子：如果使用的是无血清配方，应确保含有附着因子或者使用经过包被的培养板。二、细胞株生长缓慢1.培养基或血清改变：比较不同培养基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有无差异；通过生长实验比较新老批次血清有无差异；增大细胞株初始接种密度；使细胞株逐步适应新的培养基。2.必需生长促进成分（如L-谷氨酰胺或生长因子）耗竭、缺乏或分解：去除原培养基，加入新鲜培养基；向培养基中添加生长促进成分（如L-谷氨酰胺）。3.轻度细菌或真菌污染：在不添加抗生素的条件下进行培养，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。4.时间存储不当：血清应于-5℃至-20℃下储存；培养基应于2℃~8℃下避光储存；尽量减少血清和培养基见光时间。5.细胞株初始接种密度低：增大活细胞接种密度。6.细胞株衰老、老化：将老化细胞丢弃，取用代数较少的细胞。7.支原体污染：隔离细胞株，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。三、培养基pH值变化迅速1.培养箱CO2分压设置错误：根据培养基中NaHCO3的浓度增大或降低培养箱CO2的分压，NaHCO3浓度为2.0-3.7g/L时，应相应地使用5%-10%的CO2分压。2.细胞培养瓶瓶盖过紧：将瓶盖旋松1/4圈。3.碳酸氢盐缓存系统缓冲能力不足：加入HEPES缓冲液，使其终浓度为10-25mM。4.培养基中盐含量不正确：CO2平衡环境中使用以Earle平衡盐为基础的培养基，大气条件下使用以Hanks平衡盐为基础的培养基。以上就是细胞株在培养过程中可能出现的问题、原因以及解决方法，希望可以帮助大家在培养细胞株过程中遇到的困难，仅供参考。5.细菌、酵母或真菌污染：将细胞和培养基灭菌处理后丢弃。四、细胞株凋亡培养箱中无CO2：监测培养箱中CO2使用速度以便确定及时更换气瓶；经常检测管路连接处是否漏气；不要频繁开启培养箱门。2.培养箱内温度有波动：监测培养箱内温度，及时校正。3.使用抗生素达到毒性浓度：减少抗生素的用量；使用无血清培养基时，抗生素浓度应降低至1/10。4.细胞株复苏或冻存时受到损伤：取用新的细胞。5.培养基的渗透压不合适：检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受260~350mOsm/kg的渗透压，加入某些试剂和药物后会影响培养基的渗透压；昆虫细胞培养基的渗透压（340~380mOsm/kg）要高于哺乳动物细胞。6.培养基中毒性代谢产物蓄积：去除原培养基，换用新鲜培养基。五、悬浮细胞株集成团存在钙离子和镁离子：用不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。2.支原体污染：隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。3.蛋白水解酶消化过度导致细胞裂解、DNA释放：用0.001%DNA酶I处理细胞；用PBS冲洗后再接种到新培养基中。

　　做实验，细胞铺匀是常见的一种。然而，有许多人不是很成功，分布也不均匀:要么中间密集，周围稀疏，要么周围密集，中间秃顶。以下是利用96孔板把细胞铺匀，希望对大家有用!　　方法/步骤　　1、通常，在96孔板的每个孔中加入100微升细胞悬浮液。 从底部附近的井的左侧添加细胞悬浮液。 加入一半平板后，混合细胞悬液，不要再加入，继续加入剩余的一半平板。 添加完所有板后，盖上板，用左手轻轻握住板的左侧，用右手轻轻轻敲板的右边缘，注意抓力(我通常轻敲三次)。 如果它太强或太多次，细胞就会被浓缩和堆积。 顺时针旋转盘子(逆时针效果不好)，依次敲击剩余的三面，静置约5分钟，放入37度培养箱中。　　对于6孔板、12孔板或24孔板，我在第一个孔中加入少量无血清培养基，摇动并渗透到整个孔的底部，然后用移液管枪将整个孔的底部吸到第二个孔中。用同样的方法渗透到井底，同时模拟其它井，这样整个井底都是湿的，细胞悬浮液将平放在整个井底。 加入细胞悬液时，可以避免中间加入更多细胞，中间加入更少细胞的现象，细胞分散更均匀。 注意，加入细胞悬液后，细胞悬液应放在工作台上静置。这个方法有点慢，但是当你熟练的时候它并不慢。也可以涂抹，但强度不如96孔板，效果不如96孔板，所以我放弃了渗透井底的方法。　　2、加入细胞悬液后，抬起细胞培养板，从底部向上观察光线，看细胞是否聚集。然后从底部敲击以分散它。　　3、如果实验室有平板振荡器，建议用这个仪器轻微振荡。 效果好，即振幅小、频率高。　　4、细胞应该尽可能分散，大多数细胞处于单一状态。离心后，完全悬浮!有转移到六孔板上的，就是震动!摇晃时，不要让细胞液转向，否则细胞会全部被带到中间而不均匀!　　5、当一瓶细胞装满后，进行正常处理。 将它均匀地吹进培养瓶中，然后铺上6孔板，每孔2ml。 涂抹后，不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放入培养箱中。 稍微向左三圈，向右三圈，先三圈，然后三圈。基本上，24小时后，每个孔中的细胞将非常均匀。　　6、计算所有所需的液体和细胞数量，混合均匀，并将其添加到六孔板中。 六孔板呈水平8字形波动。 在显微镜下观察。 如果不均匀，按照上述方法再次摇动。如果细胞没有计数并直接种植，在种植六孔板的过程中随时摇动混合瓶。 我通常顺时针或逆时针转动瓶子。　　7、先上下移动，然后在水平板上左右移动，每个方向移动5-6次，但关键是摇动后直接放入培养箱，不要做太多的运动，如照镜子，否则很容易在中间再次聚在一起。

 　　实验流程　　一、SP三步法　　1）石蜡切片，常规脱蜡至水。　　2)0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。　　3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟　　4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.　　5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。　　6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最/好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。　　7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。　　8)PBS冲洗，3分钟×5次。　　9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。10)PBS冲洗，3分钟×5次。　　11）显色剂显色（DAB等）。　　12）自来水充分冲洗。　　13）可进行复染，脱水，透明。　　14）选择适当的封片剂封片。　　二、即用型二步法　　1）脱蜡、水化组织切片。　　2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。　　3)0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。　　4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。　　5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。　　6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。　　7）应用DAB溶液显色。　　8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。　　三、免疫荧光技术　　1、酶免疫组化的关键环节　　1）标本固定　　固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；　　②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；　　③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s液或mDF液效果较好。　　2）脱水、石蜡包埋和制片　　脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完/全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。　　3）脱蜡和水化　　这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60℃20min，然后立即二甲/苯1-3分别10min（这个时间是由二甲/苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。　　4）抗原修复　　由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。　　5）细胞通透　　目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。　　6）灭活内源性过氧化物酶和生物素　　在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4℃避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。　　7）血清封闭　　组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过度　　8）一抗和二抗浓度和孵育时间　　一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。　　二抗孵育条件：二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4℃蕞/佳，反应温和，但时间最/好超过16~24h。　　9）抗体稀释液　　其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠dan化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），蕞/后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。　　10）切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）　　为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。　　注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。　　②温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；　　③冲洗的时间要足够，才能彻/底洗去结合的物质。　　④PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）　　11)DAB显色　　背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（蕞/好一抗4℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。　　12）复染　　目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，an水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入an水中返兰即可。　　13）封片　　为了长/期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。　　2、免疫荧光方法中的重要环节　　1）冰冻切片制备　　建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。　　2）组织切片固定　　切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。　　3）血清封闭　　为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。　　4）一抗孵育条件　　在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果最/佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。　　5）二抗孵育条件　　二抗一般室温或37℃30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最/后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。　　6）复染　　目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。　　7）封片　　为了长/期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。　　8）切片清洗　　为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。　　注意：　　⑴单独冲洗，防止交叉反应造成污染。　　⑵温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；　　⑶冲洗的时间要足够，才能彻/底洗去结合的物质。　　⑷PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）　　9）拍照　　有条件的话最/好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙xi塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保/证镜油为无荧光镜油；电源最/好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

细菌处于容易接受外源DNA的状态称之为感受态，通过物理或化学的方法，人工诱导细菌细胞成为敏感的感受态细胞是重组DNA转化细菌技术的关键。制备出感受态细胞，我们就可以方便的将需要克隆的质粒导入其中，使其繁殖，从而获得大量的质粒。CaCl2转化法是常用的感受态细胞制备方法，其制备流程简单，快捷，成本低，并且能够满足普通的转化和克隆的需求。判断感受态细胞制备的优劣主要是通过转化效率来检测。经转化外源质粒DNA的大肠杆菌在含抗性的LB平板过夜培养后，平板上长满克隆且阴性对照（未转入外源DNA的感受态）没有克隆，证明感受态细胞制备良好。注意事项：1、在制备感受态细胞过程中，所有用到的耗材，试剂均要求无菌，操作过程也要求完全按照无菌操作进行，避免杂菌及污染。2、制备感受态的菌株最好是先将甘油菌划线于无抗性的LB平板中进行活化，然后挑选单克隆的液体培养基中培养。如果甘油菌溶解后直接在液体培养基中培养来制备感受态，会影响感受态细胞的活性。3、在制备感受态细胞的过程中，保持各环节处于低温环境，4℃离心，冰上重悬，CaCl2溶液置于冰浴中，以保证感受态细胞的转化效率。4、重悬细胞时，尽量避免吹打细胞造成细胞损伤，通过轻轻震荡使细胞重悬，减少对菌株的损伤从而影响其活性。5、制备好的感受态细胞应尽快使用，存放过久会影响其转化效率。6、感受态细胞不宜反复冻融，因为冻融过程中产生的冰晶会对细菌细胞造成伤害。

先跟着远慕一起来认识下标准溶液与基准物质标准溶液：已知准确浓度的溶液，在各种滴定分析方法中都要用到标准溶液，可根据溶质的性质、特点，按不同方法配置，配制方法有直接配置法和间接配置法。基准物质：能用来配制标准溶液或测定标准溶液浓度的物质。应具备如下条件：1、组成恒定并与化学式相符，若含结晶水，其结晶水的实际含量也应与化学式严格相符。2、纯度足够高(达99.9%以上)，杂质含量应低于分析方法允许的误差限。3、性质稳定，不易吸收空气中的水分和二氧化碳，不分解，不易被空气氧化。4、有较大的摩尔质量，以减少称量时的相对误差。5、试剂参加滴定反应时，应严格按反应式定量进行，没有副反应。基准物质标定法与标准溶液标定法区别1、 基准物质标定法：称取一定量的基准物质，溶解后用待标定的溶液滴定。根据基准物质的质量和溶液的消耗体积，计算待标定溶液的准确浓度。2、 标准溶液标定法：准确吸取一定量的待标定溶液，用另一种已知准确浓度的标准溶液滴定；或准确吸取一定量的已知准确浓度的标准溶液，用待标定的溶液滴定。根据两种溶液的消耗体积及已知的标准溶液浓度，计算待标定溶液的准确浓度。此法若标准溶液浓度不准确会直接影响待标定溶液浓度的准确性。因此，标定时应尽量采用基准物质标定法。无论用哪种方法标定，一般要求平行做3～4次实验，至少2～3次。相对偏差小于0.2%。标定好的标准溶液应妥善保存。放置一段时间后，标准溶液要先摇匀，再使用，若不稳定的溶液，还要定期标定。标准物质的正确使用包括正确的选择、正确使用（防止误用）和使用的注意事项：1） 标准物质应根据不同的用途、目的，选择不同的标准来源，如，从相应的标准品供应处购买、购买相应的商品或从特殊途径获得。2）目的不同，标准品级别要求则不同。应选用标准物质特性量值与预期应用测试值水平相适应的标准物质。使用者不应选用不确定度超过测量值与预期应用测量程序所容许水平的标准物质，一般工作场所可以选用满足要求的标准物质。对实验室认证、方法验证、产品评价与仲裁等可以选用高水平的标准物质。3）使用者在使用标准物质前应仔细、全面地阅读标准物质证书，只有认真的阅读证书中所给出的信息，才能保证正确使用标准物质。4）选用的标准物质稳定性应满足整个实验计划的需要。凡已超过稳定性的标准物质切不可随便使用。5）使用者应特别注意证书中所给该标准物质的最小取样量。最小取样量是标准物质均匀性的重要条件，不重视或者忽略了最小取样量，会影响测量结果的准确性和可信度。6）所选用的标准物质数量应满足整个实验计划使用，必要时应保留一些储备，供实验计划后必要的使用。7）选用标准物质除考虑其不确定度水平外还要考虑到标准物质的供应状况、价格以及化学的和物理的适用性。有的使用者不顾花费昂贵的价格与手续非要从国外进口标准物质来使用，这也是标准物质的误用。

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量PCR的流程是：样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。下面看看各个环节都可以使用哪些对照:1.阳性对照（Positive control，PC）和阴性对照（Negative control，NC）阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染样品，都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。阴阳性对照强调处理过程与样品一致，并且有明确的预期结果。2.扩增对照我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测RNA样品的检测试剂盒，其扩增阳性对照使用质粒，便无法监控反转录过程。3.内标（Internal Control，IC）内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增，而其他的对照都是独立扩增。3.1内参基因通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因（house-keeping gene）因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。内参基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液，咽拭子等样品，内参基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。3.2人工内标添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标。现在国外的诊断试剂盒大部分都会将内标直接添加在反应液中与模板一起扩增，但是这样的内标不能监控采样，运输和核酸提取的过程。还有另一种形式的内标，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标，这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。但是由于是人工添加到样品中，仍然不能监控胞内细菌病毒的释放情况。4.核酸提取对照可以使用内参基因，假病毒混合基质，灭活病毒混合基质来监控提取到扩增的流程。5.反转录对照（RT control）可以使用提取好的RNA内参基因，RNA假病毒混合基质，灭活RNA病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。无反转录对照（no-RT control）含有除反转录酶以外的所有成分。6.空白对照（Blank control）6.1无模板空白对照(No template control, NTC)NTC是指不含有模板（阳性模板或者阴性模板）的对照。目前的试剂盒的NC一般都是水或阴性缓冲液，所以NC等同于NTC。其实两者有不同的作用。6.2仪器空白对照NTC是含有引物探针和反应液主要监控引物探针，反应体系有没有被污染。这里的仪器空白对照我通常使用的是空反应管来监控仪器有无非特异性的荧光信号。6.3荧光染料对照最常使用的是ROX染料，由于荧光定量PCR的荧光信号在每个样品孔会有微小的差异所以使用特定的ROX荧光染料，系统可以根据ROX荧光染料的信号值来校准每孔的荧光信号。7.质控品（Quality control, QC）上述环节中使用的各种对照大部分是试剂厂家匹配试剂盒使用的产品，有的是实验室自制，所以整个的监控过程可能存在不够客观和独立。因此在实验室的对照设置中每次检测都建议使用第三方质控品，有条件的使用国家有证标准物质(Reference material ,RM)。由于标准物质具有准确量值和计量溯源性，可以更准确的评估整个试验流程的准确度。8.定值参考品医学上的定量检测试剂盒，需要配套定值参考品用于试剂盒的定量检测使用。对照的选择从上文可知没有一种对照是完美的，在检测中我们要根据自己的需求来进行灵活选择和搭配。笔者建议每一次检测时添加一个能对从提取到扩增环节进行监控的质控品或标准物质；每份检测样品中添加内标（如果样品种类比较多样建议使用人工内标，如果样品类型为相对固定的动物组织建议使用内参基因）；扩增阳性对照，扩增阴性对照，无模板对照和ROX对照。有条件的添加临床阳性对照和临床阴性对照，在怀疑提取环节或者反转录环节出现问题时使用核酸提取对照和反转录对照。不定期使用仪器空白对照。阳性对照与污染不可否认的一个事实是阳性对照可以增加实验室污染的风险。这种污染的来源一种是直接来源于扩增阳性对照的污染。对于扩增阳性对照来说通常10000拷贝/微升（CT值约25）是比较理想的，但是有一些试剂盒厂家的扩增阳性对照设置在CT值20以下，比大部分阳性样本都强。这么高浓度的对照给实验室带来了巨大的污染风险，原因可能仅仅是因为试剂厂家担心其阳性对照不稳定，长时间存放阳性对照降解。另一种污染来自于扩增产物的处理不当，或者实验室的设计布局不合理。初筛和确诊对于初筛实验，我们希望提高真阳性检出率，即提高诊断敏感性。我们需要检测系统达到最高检测效率，因此要在不同环节添加阳性对照，确保每个环节的检测效率最高。对于确诊实验，我们希望提高真阴性检出率，即提高诊断特异性。我们需要确保检测系统不出现假阳性，因此要在不同环节添加阴性对照，减少非必须的阳性对照，甚至要在样品盘的不同位置中随机插入几个阴性对照，确保实验过程中没有被污染。

　　支原体（Mycoplasma）是一种大小介于细菌和病毒之间（0.1 - 0.6μm），没有细胞壁、并独立生活原核生物，形态呈高度多形性，呈圆形、丝状或梨形。由于支原体直径较小，进行除菌过滤是，约1%的支原体可以直接穿过常规的0.22μm的微孔除菌滤膜，造成细胞的支原体污染。　　支原体污染的来源包括：　　（1）工作环境的污染，实验器材带来的污染；　　（2）操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）；　　（3）已受污染的培养基、血清，或用来制备细胞的原始组织或器官的污染；　　（4）污染支原体的细胞造成的交叉污染。　　目前，已发现的支原体品种有100多种，但根据国内外相关研究发现，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。　　以下13种支原体污染在全部支原体污染中所占比例超过99%。（1）M. orale、（2）M.Arginini、（3）M.Hyorhinis、（4）A.Laidlawii、（5）M.Fermentans、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）M. hominis、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis。其中尤其是前四种：M.orale（口腔支原体）、M.arginini（精氨酸支原体）、M.hyorhinis（猪鼻支原体）和A.laidlawii（莱氏无胆甾原体）所占污染比例超过95%，前8种占比超过98%。　　支原体通常附着在细胞的表面，并影响其宿主细胞的生理、遗传等多方面的正常功能，用这些污染后貌似正常的细胞做试验或生产，将会严重影响结果。　　1、对细胞生长繁殖和形态的影响　　细胞培养物被支原体污染后生长减慢，且产生细胞病变（cytopathic effect, CPE），表现为细胞体积增大，碎片增多，在细胞质中产生一些颗粒；细胞内病毒繁殖受阻，使细胞形成空斑。光镜下形成不正常密度生长的单层，贴壁细胞形成“流沙样”脱落、裂解。某些支原体可在侵入细胞８ｈ使线粒体膨胀，继而被破坏，细胞核萎缩呈空泡化，细胞微管解聚，培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代，甚至整个细胞群体溶解。　　2、对细胞代谢和功能的影响　　有些被污染后的细胞，虽形态上变化不明显，但培养液pH变化较大，更换培养液后几小时就变酸，培养基中的必需氨基酸被消耗掉，如谷氨酸或核苷前体，改变细胞代谢。　　支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；消耗细胞的核苷库，引起细胞染色体异常；发酵型支原体能迅速降解简单糖类，代谢产生的酸能改变细胞的功能；利用精氨酸的支原体则发生精氨酸效应，从而影响蛋白质和核酸的合成、导致细胞的分裂和生长受阻；引起细胞酶谱改变；由于支原体对细胞膜的吸附，干扰膜受体的功能，改变信号传递，破坏膜的完整性。在单克隆抗体制备中，骨髓瘤或杂交瘤细胞因支原体的污染而导致融合失败或抗体分泌能力下降以至丧失。　　3、引起染色体异常　　改变染色体组型，通常可导致细胞染色体断裂、数目减少，出现双着丝点染色体、环状染色体等。　　4、对免疫细胞产量的影响　　支原体能影响巨噬细胞的活性，抑制干扰素的合成和降低其活性，加大了继发感染其他细菌和病毒的几率，同时，通过植物血凝素干扰淋巴细胞的刺激、分化。

PCR即聚合酶链式反应，对于常年狂奔在实验室的实验人来说并不陌生。那么，对于PCR反应的核心成份，DNA聚合酶，你选对了吗？常见的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根据耐热性来分可分为耐热酶和常温酶。耐热聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等，常温聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根据保真度来分，高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等，普通聚合酶 Taq 等。DNA聚合酶的功能1）通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿5’→3’方向延长（DNA聚合酶活性）[1]2）催化由3’端水解DNA链（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除错配的碱基）[1]3）催化由5’端水解DNA链（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）[1]4）催化由3’端使DNA链发生焦磷酸解5）催化无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷酸三磷酸之间的焦磷酸基的交换面对如此之多的选择，大多数刚进实验室的新生们默默表示，选择恐惧症犯了……那么，解决的方法是，根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶。比如：常规的 PCR 扩增和菌液鉴定，长度小于 5kb 的片段，保真度要求不高，使用 Taq 酶扩增即可。选用 Mix 的形式，混样更加简单，操作更加便捷。如果混样泡沫多，想灭掉泡沫的话，推荐大家使用 Green Taq Mix。想要获得较高的产量，可以选择 Taq Plus DNA 聚合酶，相对于 Taq 酶扩增性能更强。1. 选择热启动酶降低非特异性扩增在使用 Taq 酶进行扩增时，有时会出现非特异性扩增，可能的原因可以从模板、引物、体系、程序中一一排查。如模板是否被污染，引物特异性如何，Mg2+浓度偏高等等，其中一个不可忽视的原因是 DNA 聚合酶的种类是否合适。如果排查了其它原因仍旧有非特异性产物，可以选择热启动酶重新实验，即可有效减少或消除体系中其它产物的积累。常用的热启动酶分为两类：一类是化学法修饰的热启动酶，如 Ace Taq ，预变性 95℃5 - 10 min 即可释放酶活；一类是抗体法修饰的热启动酶，如 Champagne Taq ，预变性 95℃30s 即可释放酶活。使用时注意预变性时间，方能获得满意的扩增效果。2. 选择 Lamp 扩增长片段大于 5Kb 的长片段又该如何扩增呢？如果实验对保真度的需求不高，那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍，可扩增超过 20Kb 的基因组、cDNA 片段，对于低拷贝、低纯度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。3. 选择高保真酶快速高效扩增如果实验对保真度要求较高，在选择 DNA 聚合酶的时候就需要使用高保真酶，如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。前三者都属于第一代高保真酶，已在市场中广泛使用。诺唯赞科研团队的大力改造生产的 Phanta 系列的高保真酶，保真度达到了 Taq 酶的 50 倍，扩增性能、扩增长度、产量、模板适应性都显著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍，Pfu 的 6 倍，对于质粒等简单模板有效扩增长度可达 40kb，cDNA 有效扩增长度可达 10kb，基因组有效扩增长度可达 20kb，适合于各种 GC 含量的扩增，可用于多种样本的直接 PCR 如植物叶片、全血等。且扩增仅需 30s/kb，甚至于 2kb/s。如此卓越，爱不释手了吧？4. 选择直接扩增试剂盒对粗品扩增xxx生产的各种直扩试剂盒，直接对粗品进行扩增，大大减少了实验的工作周期。如小鼠基因型鉴定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit，全血扩增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。

　　在实验室里做了无数次定量分析实验的你知道内标法和外标法有何区别吗？对于内标与外标哪种更好用，我们不能一概而论，毕竟面对着不同的分析、不同的要求。做定量分析实验，只要能简单又高效的进行定量分析才是最重要的。　　什么是内标法？　　内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。　　内标法　　例如加入一个不常见的元素如In等，测量曲线和样品的时候同时测定这个元素相同浓度，假如内标物强度变化不大说明基体干扰小，如果内标物强度明显下降说明有强基体干扰，有说是20%内变化是合理。　　内标法(相对强度法)。为了补偿谱线强度随光源波动而引起的变化，在定量分析中人们多采用内标法，即选择分析元素谱线(分析线)与内标元素(基体或人为加入)谱线(内标线)。组成分析线对，以其相对强度(R)的对数与分析元素浓度(C)间的关系式，作为定量分析的基础:LgR=blgc+1gK这就是内标法的基本公式。该式表明，分析线相对强度(R)的对数与分析元素浓度(C)的对数成正比，其斜率为b，其截距为1gK。在一定条件下b、K都是常数。　　什么是外标法？　　外标法的中心内容是需要用预测组分的对照样品作出峰高或峰面积对含量（重量或浓度）的校正曲线。校正曲线通常是线性的，并且外推通过原点。绘制校正曲线。　　外标法　　工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。　　外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：　W=A(W)/(A)　　式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。　　定量分析中怎样选择内标法或外标法？　　选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物(当然是样品中没有的组分)，然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。　　内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。选择内标物有4个要求：　　1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;　　2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;　　3.加入内标物的量应接近于被测组分;　　4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。　　内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。　　内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。　　结论：应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下，用内标法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。　　另峰面积归一法：如果被分析样品的组分是同系物，校正因子相近可直接用峰面积求出组分的百分含量。如果被分析样品的组分不是同系物，则要知道每种组分的相对校正因子。优点：不必准确知道进样量，操作条件略为变动对结果影响较小，计算方便，适合多组分的工厂例行分析。主要分析对象为任意。　　测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。由于峰面积归一化法误差较大。因此，通常用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另外规定外，不宜用于微量杂质的检查。

　　细胞破碎是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展,以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。　　  但是由于细菌、酵母、植物细胞壁的组成成分不同,且同类细胞结成的网状结构也不同,所以其细胞壁的坚固程度不同。而动物细胞虽没有细胞壁,但具有细胞膜,也需要一定的细胞破碎方法来破膜,达到提取产物的目的。　　一般用物理或者化学方法来使得细胞裂解　　物理法：　　（1）反复冻融：将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下，反复冷冻溶解10次-20次。适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。　　（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。　　（3）超声法：将细胞放置于超声破碎仪中，以一定频率的超声破碎细胞，适用于绝大部分微生物细胞。　　（4）渗透压法：将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液，细胞吸收大量水分破解。　　（5）液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。　　化学法:　　（1）强酸、强碱溶液：一般应用0.5N NaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。　　（2）生物酶：一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。

　　质粒提取常见问题分析 　　1、影响质粒提取的因素有哪些？　　质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。　　2、为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶菌酶？　　革兰氏阳性菌有一层细胞壁，必须加入溶菌酶才能使之溶解。　　3、如何根据实验需要选择不同级别的产品？　　从纯度上：各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化，普通纯度的质粒可以满足要求；而对于转染实验，则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。　　从提取的量上：1-20μg，应选择小量提取试剂盒；20-40μg，应选择中量提取试剂盒；大于40μg，应选择大量提取试剂盒。　　从宿主菌上：分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒，根据情况进行选择。