相信很多人都听到过含量，纯度之类专有名词，人们想当然的将纯度和含量画上了等号，其实不然，很多产品的纯度和含量都不一样，含量一般考察的是主要物质，而纯度则主要关注杂质。　　　　虽然纯度用主成分的百分数表示，但是主要目的是反应杂质情况。另外，含量结果与纯度结果往往不完全相同，因为含量需减去水分，残留溶剂等等。　　　　含量测定一般需要标准品，多数采用外标法定量；纯度则一般采用面积归一化法，如果杂质与主成分响应差别较大，往往还需要加入校正因那问题来了，纯度该怎么测定，含量该怎么测定？　　　　1. 含量：考察的是主成分。一般用标准品配置一定浓度的溶液，用外标法或者内标法测定。　　　　2. 纯度：其实没有“纯度”这个说法。正确的说是“有关物质”。考察的是杂质。一般用主成分自身对照或者杂质标准品来测定。　　　　3. LC或者GC，主峰的的面积百分比。如果是面积归一法，可以认为是有关物质。如果是外标法，单独一针的面积百分比没有意义。　　　　4. 在定制合成的范围，不会为一个样品开发方法或者做方法验证。一般做一针HPLC，通过主峰的面积比来确认是不是符合要求。这个时候会说“纯度”。　　　　5. 在原料药的范围，一般按照药典或者企业标准来做。会有开发方法和方法验证，只有含量和有关物质的概念，没有人会说“纯度”　　　　纯度　　　　纯度一般是用面积归一化法来做，主要是在一张图中扣除所有杂质峰后主成分的百分比。但是这种情况没有考虑到在一个样品中还有水分，还有无机盐，以及各个峰之间的响应值的差异，因此是一个比较大略的检测结果，通常只在起始原料检测中会用到纯度。　　　　含量　　　　含量则是通过标准品来进行参考，或外标或内标计算含量，并且一般都要扣除水分，因此相较“纯度”这个概念而言，含量是一个更为准确的结果。　　　　同样用液相色谱，面积归一法测得面积百分比是纯度，内/外标法测得的是含量。　　　　纯度VS含量　　　　1.纯度是有机物中主成分除去有机杂质（往往是液相系统或气相系统中一个系统的杂质）的一个含量。含量是主成分除去有机杂质（液相杂质、气相杂质）、无机杂质、水分后的含量。　　　　2.纯度一般指化合物物的分面积归一法测得面积百分比。含量使用容量分析法（滴定）或者色谱外标法、内标法、紫外分光光度法等等测得的质量百分含量。　　　　3.纯度包含样品里各组分的含量（或者浓度），包括杂质的含量（或者浓度）。含量基本上就是指主要成分的浓度。　　　　4.纯度是指一种物质中除去杂质的量之后占总的量的多少。含量是指一种物质中含有的物质的量。　　　　5.二者单位不一样，含量一般是XXmg/Kg ug/Kg；纯度就没单位，直接用xx%表示。也可以这样理解：含量与收率应该有关，而纯度反映的是产品的质量。　　　　6.纯度往往指扣除水份或盐份后标的物的含量，含量指单位质量的物料中标的物的百分比(%)或体积比或绝对量(如**g/L)，如75%酒精的乙醇含量为总质量的75%，但其纯度与除水以外的其他杂质有关，若你用一点杂质没有的乙醇来配制，则其酒精纯度为100%；若你用含有5%甲醇的乙醇来配制,则其酒精纯度为95%。　　　　7.检测方法也有异：同样用液相色谱，面积归一法测得面积百分比是纯度，内/外标法测得的是含量。测定纯度一般采用化学分析方法或仪器分析方法，先测出要求测的所有杂质含量，然后通过计算求出其纯度。含量的方法通常采用容量法和重量法等。　　　　8.表示方法不同：纯度目前可以从99.99％－99.99999%，随着测试水平的提高“9"的数目也在逐渐增加。含量：由于测定方法中有效数字的限制，一般准确至小数点后两位数，一般为XX.X％-XX.XX％。　　　　含量和纯度是不能单独进行讨论，它们之间有交集。　　　　纯度是相对于某一特定物质含有的量，通常说纯不纯，也就是含量高不高。而含量是相对于整体来说，意思是在整体情况下，对于某一特定物质含有多少。含量很高，通常也说，此物质比较纯，纯度较高。

　　天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链（heavy chain，H），而分子量较小的两条链称为轻链（Light chain，L）。同一Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。　　　　1．重链分子量为50 000～75 000，由450～550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将抗体分为5类（class），即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。不同类的Ig具有不同的特征，如链内和链间二硫键的数量和位置、结构域的数量及铰链区的长度等均不完全相同。即使是同一类的Ig，其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数量、位置也不同，据此又可将同类Ig分为不同的亚类（subclass）。例如，人IgG可分为四个亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；人IgA可分为IgA1和IgA2两个亚类。　　　　2．轻链分子量约为25 000，由214个氨基酸残基构成。轻链可分为两种，分别为kappa（κ）链和lambda（λ）链。据此，可将Ig分为两型（type），即κ型和λ型。一个Ig分子上两条轻链的型别总是相同的。不同类Ig既存在κ型，也存在λ型。同一个体内可同时存在κ型和λ型的Ig分子，不同种属生物体内两型轻链的比例不同。正常人血清Ig的κ：λ约为2：1，而在小鼠则为20：1。Ig的κ与λ的比例异常可以反映免疫系统的异常。根据λ链恒定区个别氨基酸的差异，又可将λ链分为λ1、λ2、λ3和λ4四个亚型（subtype） 。

缓冲溶液多种多样，在实验中经常使用，下面远慕具体聊一聊，希望大家能对缓冲溶液有一个全面的了解。缓冲原理具备缓冲作用的缓冲溶液，通常针对溶液中放入一定量的酸和碱，能够起到防止溶液PH值产生一定变化的良好作用。一般来说，弱酸以及其盐溶液混合而成的溶液、弱碱与其盐溶液进行混合的溶液等，都可以被称为缓冲溶液。能够产生对酸的缓冲作用，是由于其中的弱酸根离子的原因。如果向该溶液里面滴加定量的强酸物质，氢离子势必要被弱酸根离子消耗完。这样就能维持PH的固定值，使其不会变化。如果加入适量强碱，溶液里的弱酸会消耗氢氧根离子，从而阻碍PH发生改变。缓冲溶液的选择与计算为了保证缓冲溶液有足够强的缓冲能力，在配制缓冲溶液时，需要做到：为使共轭酸碱对的浓度比接近于1，应根据所需要维持的pH范围选择合适的缓冲对，使其中的弱酸的PKa等于或接近于所要求的pH。例如，生物培养液中需用PH=7.0的缓冲溶液，已知H2PO4-的pKa2=7.21，因此，H2PO4—HPO42-是可以选择的合适的缓冲对。如若配制PH=9.0的缓冲溶液，则可选择NH3·H2O-NH4Cl缓冲对(pKa(NH4+)=9.25)。可见弱酸的Ka是选择缓冲溶液的主要依据，表中列出了几种常用的缓冲溶液。常见组成常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。常见的缓冲体系有：1、弱酸和它的盐(如HAc---NaAc)2、弱碱和它的盐(NH3·H2O-NH4Cl)3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐(如NaH2PO4---Na2HPO4)的水溶液组成。而生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液在37℃进行测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。在pH7.5以下，其缓冲能力极为不理想。缓冲溶液的作用缓冲溶液的作用是在有限的范围内调整溶液的pH值使待测溶液的酸度符合分析方法所规定的范围，例如，苯酚在碱性介质及铁氰化jia存在下，可与4-氨基安替比林反应生成橙红色的安替比林染料，为了防止芳香胺类的干扰以pH在10士0.2时为适宜。为此，就需要在待测溶液中加入氨一氯化钱缓冲溶液调整和控制待测溶液的pH为10.0士0.2。在实际工作中有些分析人员由于不大了解缓冲溶液的作用机理，当所配制和使用的缓冲溶液与规定的数值不相符时，为使缓冲溶液达到要求，就用盐酸或氢氧化钠等强酸、强碱进行调节, 以为这样做可以使缓冲溶液尽快达到所需要的pH值，然而，结果却适得其反，这样的溶液pH值虽然调对了，可是它的缓冲体系却被破坏了，作用也就失去了，缓冲溶液一般都是由弱酸及其弱酸盐或是弱碱及其弱碱盐组成的一对共轭体。使用中的注意事项使用缓冲溶液的注意事项：不少缓冲溶液都含有易挥发组分，如，氨-氯化铵中的氨酷酸-醋酸钠中的醋酸。现在，不少实验室引入了定量加液器，用定量加液器加试剂，具有简便准确误差恒定的特点，特别是在做成批样品时更显出它的优越性，不少同志也喜欢用它来加缓冲液，但是，应注意缓冲液不能长久存放在定量加液器中，因该器皿不密闭，易造成氨的挥发(醋酸-醋酸钠缓冲液中的醋酸也同理)，从而，导致溶液失效，正确的做法是缓冲液应适量配制，使用后及时密闭并置于低温中保存。

　　细胞融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。　　　　1．试剂与材料　　　　(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。　　　　(2)1640培养液100ml。　　　　(3)完全1640液100ml。　　　　(4)2.5%FCS－1640液50ml。　　　　(5)HAT培养液100ml。　　　　(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。　　　　(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。　　　　(8)40孔塑料培养盘。　　　　2．操作方法　　　　⑴准备好脾细胞。　　　　⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。　　　　⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。　　　　⑷移去上清液。　　　　⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。　　　　⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。　　　　⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。　　　　⑻重复⑺一次。　　　　⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。　　　　⑽重复⑼一次。　　　　⑾加1640液15ml。　　　　⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。　　　　⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。　　　　⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。　　　　⒂轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。　　　　⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。　　　　⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。　　　　⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

　　一 、模板质量问题：　　　　1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。　　　　2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。　　　　3） 为什么跑电泳会出现拖带呢？　　　　1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。　　　　2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。　　　　二 、引物问题　　　　1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！　　　　2）普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。　　　　在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr，没关系的三Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。　　　　三、Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。　　　　四、模板浓度过低。　　　　五、退火温度过高。有可能，可以做个梯度PCR试一下。　　　　六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。　　　　七、dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。　　　　八、PCR产物电泳　　　　1.电泳图不清晰，可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。marker都出问题说明是胶的问题，或者电泳操作的问题。　　　　2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

　　1. 感染预实验　　　　以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）　　　　Day1：　　　　准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种 5×104 个细胞，添加细胞培养液至 500µL。通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）　　　　Day2：　　　　（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；　　　　（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：　　　　A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；　　　　B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；　　　　C. 混匀后，细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。　　　　Day3：　　　　更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。）　　　　Day4：　　　　继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。　　　　Day5：　　　　观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。）　　　　根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出目的细胞的 MOI 值。

一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。western显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。二、操作步骤：(一)配胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。2、封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)(二)样品处理1．培养的细胞（定性）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。⑶100℃，1min。⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。⑹待样品恢复到室温后上样。2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。⑷12000g离心，4℃，2min。⑸取少量上清进行定量。⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵12000g离心，4℃，2min。⑶取少量上清进行定量。⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)(三)电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。电泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/LTris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L(四)转膜1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。电转液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L(五)封闭及杂交1．封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。2．结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。3．洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。5．洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)Tween-200.01%~0.02%NaCl150mMTween-200.05%封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200mlPBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。(六)发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。1．HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。2．AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。三、注意事项：增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。封闭40~60min一抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。二抗杂交，37℃1h。PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。发光鉴定。若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。10．三抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。12．发光鉴定。一抗溶液中加入0.2%叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）(七)NC膜的多次使用一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

　　准确性、均匀性和稳定性是标准物质量值的特性和基本要求。　　　　(1)准确性　　　　通常标准物质证书中会同时给出标准物质的标准值和计量的不确定度，不确定度的来源包括称量、仪器、均匀性、稳定性、不同实验室之间以及不同方法所产生的不确定度均需计算在内。　　　　(2)均匀性　　　　均匀性是物质的某些特性具有相同组分或相同结构的状态。计量方法的精密度即标准偏差可以用来衡量标准物质的均匀性，精密度受取样量的影响，标准物质的均匀性是对给定的取样量而言的，均匀性检验的最小取样量一般都会在标准物质证书中给出。　　　　(3)稳定性　　　　稳定性是指标准物质在指定的环境条件和时间内，其特性值保持在规定的范围内的能力。　　　　在选择、购买标准物质时，应考虑以下要素：　　　　（1）特性量的种类及定值方法：某些标准物质可能只适用某一特定方法或专属领域的应用，某些标准物质的值有特殊规定，如含结晶水的值，应对证书中该类说明加以注意，防止误选误用；　　　　（2）特性量水平：标准物质的特性量水平应与日常测量样品的水平匹配；　　　　（3）可接受的不确定度水平：标准物质特性量的相关不确定度水平应与日常测量中的精密度和正确度限度要求匹配；　　　　（4）基体及可能的干扰：标准物质用于开展方法确认、质量控制以及一些基体效应较为严重的测量方法的校准时，基体应与日常测量样品基体尽可能接近；　　　　（5）形式：标准物质可制备成不同的形式，如冻干与冰冻样品，制备方式的不同可能会导致相同特性在标准物质与真实样品中的行为差异，从而产生互换性问题，选购前应充分调研；　　　　（6）最小取样量：只要标准物质证书中规定了最小取样量，用于测量的取样量应不小于该最小取样量，因此选购时应考虑最小取样量是否能满足测量方法要求；　　　　（7）用量：标准物质的购买用量应足以满足整个实验计划中的应用，包括根据需要考虑的备样；　　　　（8）稳定性：选购前应确认所购买批次标准物质的有效期限，避免使用时发生过期的情况。

实验原理细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。实验器材1.活材料培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。2.染色液和试剂5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液。3.器材小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。实验方法1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。2.Schaeffer与Fulton氏染色法（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。（3）染色：①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持 15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。②水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。③复染：用蕃红液染色5min。（4）水洗、晾干或吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。注意事项1.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。

　　牛血清白蛋白是血液中的主要成分（38g/100ml），分子量68kD，等电点4.8，含氮量16%，含糖量0.08%，仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。牛血清蛋白溶液可以作为测量蛋白质含量的标准曲线用。　　　　一般买回来的牛血清蛋白是细小片状的乳白色粉末。牛的血清蛋白也以铁为基本原料。　　　　1、特纯级牛血清蛋白　　　　用途：用作酶标、金标等诊断试剂的封闭剂，生化试验等。　　　　电场対超感牛血清白蛋白截留率的影响　　　　性状：淡黄色干燥粉末　　　　2、无脂肪酸牛血清蛋白　　　　用途：用作酶标、金标等诊断试剂的封闭剂、保护剂，尤其适用于容易受脂肪酸影响的产品和试验。　　　　性状：淡黄色干燥粉末　　　　3、无蛋白酶牛血清蛋白　　　　用途：用于酶标、金标等诊断试剂的封闭剂、保护剂，尤其适合血液脂类的诊断试验、脂类诊断试剂及对纯度要求高的产品。　　　　性状：淡黄色干燥粉末　　　　4、细胞培养级牛血清蛋白　　　　用途：无血清培养基的蛋白添加剂，供细胞培养使用。　　　　性状：淡黄色干燥粉末白蛋白

酸碱滴定实验详细步骤：1、把已知物质的量浓度的盐酸注入事先已用该盐酸溶液润洗过的酸式滴定管，至刻度“ 0”以上，把滴定管固定在滴定管夹上。轻轻转动下面的活塞，使管的尖嘴部分充满溶液且无气泡。然后调整管内液面，使其保持在“0”或“0”以下的某一刻度，并记下准确读数。2、把待测浓度的NaOH溶液注入事先已用该溶液润洗过的碱式滴定管，也把它固定在滴定管夹上。轻轻挤压玻璃球，使管的尖嘴部分充满溶液且无气泡,然后调整管内液面，使其保持在“ 0”或“ 0”以下某一刻度，并记下准确读数。3、 在管下放一洁净的锥形瓶，左手控制活塞，右手拿好锥形瓶。从碱式滴定管放出25.00 mL NaOH溶液，注入锥形瓶，加入2滴酚酞试液，溶液立即呈粉红色。4、把锥形瓶移到酸式滴定管下，左手调活塞逐滴加入已知物质的量浓度的盐酸，同时右手顺时针不断摇动锥形瓶，使溶液充分混合。5、随着盐酸逐滴加入，最后，当看到加入1滴盐酸时，溶液褪成无色，且反滴一滴NaOH溶液又变回红色说明反应恰好进行完全。停止滴定，准确记下滴定管溶液液面的刻度。酸碱中和滴定的注意事项：1、摇瓶时，应微动腕关节，使溶液像一个方向做圆周运动，但是勿使瓶口接触滴定管，溶液也不得溅出。2、滴定时左手不能离开旋塞让液体自行流下。3、注意观察液滴落点周围溶液颜色变化。开始时应边摇边滴，滴定速度可稍快（每秒3~4滴为宜），但是不要形成水流。接近终点时应改为加一滴，摇几下，最后，毎加半滴，即摇动锥形瓶，直至溶液出现明显的颜色变化，准确到达终点为止。4、每次滴定最好从“0.00”ML处开始(或者从0ML附近的某一段开始），这也可以固定使用滴定管的某一段，以减小体积误差。

原代细胞可用来转染siRNA、antisense RNA、microRNA 等 200bp 以内的小分子 RNA 和 DNA，可转染绝大多数原代细胞。目前，无论国外还是国内，原代细胞的核酸转染都是个热点难题，市场还缺乏真正有效的商品化的原代细胞核酸转染试剂。原代细胞能够高效转染绝大多数原代细胞，获得比较理想的基因敲除效果。甚至对一些活体寄生虫幼虫，也能获得较为理想的转染结果。对于大多数原代细胞，RFect PM 细胞转染阳性率都在 80%以上，而转染细胞死亡率不到 10%。原代细胞分离和培养基本步骤1、器官和组织的选择尽可能的去除不必要的组织和血迹。2、原代细胞的分离（1）应用PriCells原代细胞分离试剂盒I、II、III。（2）根据组织来源不同，可选用不同的PriCells原代细胞分离试剂盒。3、原代细胞的培养：（1）PriCells原代细胞特制培养基（2）PriCells原代细胞特制添加物（3）优质胎牛血清4、细胞的培养和鉴定：PriCells原代细胞鉴定试剂盒4、原代细胞的传代、保存（1）传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。（2）保存：DMSO＋培养液＋血清按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。5、原代细胞的复苏（1）取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。（2）吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。（3）用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃CO2培养箱静置培养。

质粒载体的基本介绍质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。 质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力不同，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰氏阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属的抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。质粒载体具备的条件质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础,加以人工改造和组建。理想的细菌质粒载体,除去其他类型载体相同的特点外,还应具备以下条件：①相对分子质量尽可能小,质粒越小,拷贝数越高,而且便于提取和纯化；②DNA结构和功能清楚,质粒序列中具有包含一系列单一限制酶酶切位点的多克隆位点,便于带有不同末端的外源片段的插入；③具有在宿主中合适的一个或多个选择标记,用以筛选携带有目的片段的克隆,这类选择标记可以分为显性标记和营养缺陷型标记,最主要的显性标记是各种抗生素抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、阿泊拉霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等)；④缺失流动基因,这样质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌。常用的质粒载体载体种类：质粒、噬菌体、腺病毒载体、逆转录病毒载体质粒特点：存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pMD-18T质粒、pUCl9质粒、pBR322质粒等

　　一、贴壁生长的细胞核悬浮生长的细胞都有很多种　　　　活体体内的细胞当离体置于体外培养时大多数均以贴壁方式生长，主要包括正常细胞和肿瘤细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织（骨及软骨），心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞，内分泌细胞，黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。 　　少　　　　数细胞在体外培养是悬浮生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞以及癌肿细胞。　　　　二、贴壁细胞与悬浮细胞在培养条件上的区别　　　　贴壁细胞要加血清，不贴壁的可以不加血清。　　　　三、贴壁细胞与悬浮细胞在培养方式上的区别　　　　不贴壁的一般用各种摇瓶和反应器培养，贴壁的一般用方瓶或孔板培养，使用微载体时也可以用反应器培养。　　　　四、贴壁细胞和悬浮细胞在传代方法上的不同　　　　由于贴壁细胞贴壁生长，接触抑制，长满一瓶后贴壁较紧，不易取出。这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，使其分散开后取出，然后在放入新的培养瓶中培养。　　　　悬浮细胞其实也有贴壁现象，只是贴壁不牢。可以直接用吹打发是细胞掉落下来，进行传代。　　　　五、贴壁细胞与悬浮细胞在显微镜下的区别　　　　贴壁细胞分为两种，上皮细胞型和成纤维细胞型，在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形，而且晃动培养液时，细胞不动。　　　　悬浮细胞漂在培养液中，呈圆形，晃动培养液时细胞也随着漂动。

　　冻存原理　　　　当细胞所处温度低于0°C时，细胞脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶的大小对细胞的影响是不同的，大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，故造成复苏出来的细胞存活率、状态等与冻存前的状态相差甚远。因此，我们在冻存细胞的时候会采取两个措施，一加入低温保护剂，二，慢冻细胞　　　　冻存时机：细胞应在生长良好、密度约为 80-90％、数目一般为 10 6 -10 7 /ml，活力差的细胞在冻存后的成活率很小。　　　　低温保护剂：常用的低温保护剂是二甲基亚砜DMSO，它是一种渗透保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。　　　　慢冻细胞：可以使用程序性降温盒，缓慢冻存细胞，可使细胞内避免产生大的冰晶。如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放于4度1h，-20度2h，-80过夜，大部分细胞也可以适应。　　　　冻存液配置：冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞（DMSO加入到培养基中会放热），冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。　　　　操作步骤：　　　　1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗1-2遍；　　　　2.消化细胞：加入适量胰酶，置于培养箱中37°C消化（10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5min，注意不同细胞消化时间不同，终止消化截点为镜下观察80%-90%以上的细胞变圆）；　　　　3.待消化到位后加入胰酶2倍体积的完全培养基终止消化，800-1000rpm离心3-5min；　　　　4.准备好冻存管，标记上日期，细胞类别，人名，代数，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml,转移到冻存管中；　　　　5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。　　　　注意事项　　　　1、  细胞加入冻存液之后立即放入-80度保存，勿常温放置太久　　　　2、 冻存细胞储存在-80度中通常不建议超过半年，液氮中通常不建议超过2年。

　　培养基倾注温度小常识　　1、培养基的倾注适宜温度约45℃。培养基放置于手心感觉不烫，但是放置于手背感觉烫时，培养基温度大约就是45℃。培养基倾注时温度太高的话，凝固时间较长，另外皿盖上会有大量冷凝水，不利于后续实验。温度太低则容易出现倒板过程中瓶中培养基部分凝固的现象。　　2、有些培养基需要加入添加成分，这些添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。　　3、目前多数实验室培养基灭菌后会放置水浴或者烘箱中，需使用的时候拿出来直接倒板。但培养基静置时间不宜过长，静置时间一般不超过4小时。静置时间过长，培养基中琼脂可能会少量凝固，形成类似絮状析出。　　4、在实验过程中不可避免因特殊情况而导致未倒板培养基已凝固，凝固后培养基可重新加热溶解。一般来说沸水浴或者电磁炉加热，不能重新再灭一次菌。　　培养基的倾倒方法主要涉及以下几个步骤：　　1.温度调节。培养基倾注的适宜温度大约为45℃。如果温度过高，会导致凝固时间延长，且皿盖上会有大量冷凝水，不利于后续实验。如果温度过低，则可能导致倒板过程中瓶中培养基部分凝固。　　2.添加成分。如果培养基需要加入添加成分，这些成分在加入前应先放置到室温，以避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。　　3.静置时间。培养基灭菌后应放置在水浴或烘箱中，使用前拿出直接倒板。培养基的静置时间不宜过长，一般不超过4小时，以避免琼脂少量凝固。　　4.平板准备。倒皿前，平皿应保持在35℃~40℃的温度。如果需要表面接种，有冷凝水的平板表面容易产生蔓延菌落。这时可放在有对流的无菌净化台中吹干培养基表面，但不能过度干燥，否则培养过程中平板容易开裂。　　5.倾注量。平板倾注量一般在18~20mL左右，如果培养时间超过48小时或培养温度高于40℃，为防止水分过量蒸发导致平板开裂，倾注量一般为25mL左右。　　6.避免气泡。倒平板时尽量贴着平皿壁缓慢倒入，将气泡留在瓶子底部。如果平板中有少量气泡的话，可以把气泡轻摇到平板壁上，这样不会影响结果观察。　　7.混合均匀。每个平板中加入10mL融化的琼脂培养基并迅速往复摇动和转圈晃动5~15次使培养基与接种物充分混合。　　8.培养。待平板冷却后翻转并置于适当的温度下培养。　　在整个操作过程中，需要注意避免污染，使用前需将装有培养基的瓶子或试管弄松，然后放在滚水或蒸汽浴里进行溶解，要小心避免培养基过热变质。已消毒培养皿的数量要比所测样品的数量多一个做空白对照。

免疫荧光的原理免疫荧光（Immunofluorescence,IF）原理免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（SlidesorCoverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响。用于免疫荧光染色的染料需具备以下几个条件：荧光染料应有较高的量子产额和消光系数；荧光染料对488nm的激发光波长有较强的吸收；发射光波长与激发光波长之间应有较大的波长差；容易与被标记的单克隆抗体结合而不影响抗体自身的特异性。1.异硫氰酸荧光素（FITC）：可产生亮绿色荧光。FITC是免疫荧光标记最常用的荧光探针。2.德州红：与生物素偶联的抗体有很强的亲和力，产生红色荧光。3.藻胆蛋白类：主要包括藻红蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、别藻青蛋白（APC）三类。多发生橙色至红色荧光。4.能量传递复合染料

细胞裂解液的制备一、试剂准备1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:150mMNaCL1%NP-40(去垢剂)0.1%SDS(去垢剂)2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)1.5mMEDTA(蛋白酶抑制剂)1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150mMNaCL溶液中。2、冷的PBS中加入1mMPMSF1.5mMEDTA1mMNaVanadate（钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液(每75cm2培养瓶加1ml).然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用BioradBradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在-70℃。细胞裂解一般用物理或者化学方法物理法：（1）反复冻融：将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下，反复冷冻溶解10次-20次。适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。（3）超声法：将细胞放置于超声破碎仪中，以一定频率的超声破碎细胞，适用于绝大部分微生物细胞。（4）渗透压法：将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液，细胞吸收大量水分破解。（5）液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。化学法:（1）强酸、强碱溶液：一般应用0.5NNaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。（2）生物酶：一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。

　　目的：了解微生物的习性，细菌与某些疾病的关系。　　意义：有些细菌可以制作药物，食品与生物塑料，比如：泡菜、塑料餐具、抗生素药物。　　细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。　　细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。　　动物细胞培养的必需条件：　　在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。　　⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。　　⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。　　⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。　　防止细胞培养出现污染的方法如下：　　1、从培养箱取放细胞前，用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。培养瓶放入培养箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。　　2、操作的时候防护服、口罩、手套缺一不可。操作前，准备好所有实验所需物品，以减少走动，物品需有序摆放在超净台触手可及的地方，同时空留足够操作空间。　　3、操作时，试剂不用尽量及时盖上盖子，移至操作区外围，尽量不要从开口容器上经过。　　4、使用移液枪时，将容器倾斜以便于移液，切勿将枪杆碰触瓶口及内壁。一旦发生倒吸情况，要及时用酒精棉球擦拭，以免液体残留导致细菌滋生。

　　对照品（标准品）是执行药品质量标准的实物对照，是量值传递的重要载体，是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具、测量药品质量的基准、确定药品真伪优劣的物质对照，也是作为校正测试仪器与方法的物质标准。　　中药标准品、对照品、标准物质的应用标准　　1、常用对照品（生活品）中检院现有派发出示（可参阅中国药典2010年版二部附则ⅩⅤG），且使用说明同样时，应应用中检院出示的现行标准生产批号对照品（生活品），并出示其标识和使用手册，表明其生产批号，不可应用别的来源于的标准物质；使用说明与使用说明使用说明不一起，如判定对照品作为定量分析用、效价测量用生活品作为物理化学测定方法定量分析、UV法或容积法对照品作为色谱法定量分析等，应选用适度并工作经验证的方式 再次校准，并出示校准方式 和统计数据；若色谱法含水量测量用对照品作为UV法或容积法，定量分析用对照品作为判定等，则可立即运用，无须再次校准。　　2. 中检院未有对照品（生活品）供货时，可应用给出标准物质开展规范制定和别的早期基本性科学研究工作中：　　（1）海外药品监管中国政府或药典委员会派发的对照品（生活品）或海外制药业公司的工作中对照品（生活品），但应出示其包裝标识的彩色相片及使用说明书的影印件，表明生产批号、有效期限、使用说明等信息内容，能确保其量值溯源性；　　（2）申请者自主校准或授权委托省所进行对照品（生活品）的校准，申请时出示标准物质的科学研究材料及基本信息，通常包含给出內容：　　①主成份对照品--制取加工工艺、构造及含水量层面的科学研究材料及其通用性名、化学名、结构式、化学式、含量、各种各样残渣含水量（水份、残余有机溶剂、无机盐等）、主成份含水量测量统计数据（不一样剖析技术性）、主要用途、储藏标准等信息内容。　　②残渣对照品--制取加工工艺、构造（UV，IR，NMR，MS，x射线透射的分析或出示对比图普）及含水量（不一样剖析技术性）层面的科学研究材料及其有机化学名字、结构式、化学式、含量、主要用途、储藏标准等信息内容。　　③混和对照品（精准定位）--各多组分制取加工工艺、构造（UV，IR，NMR，MS，x射线透射的分析或出示对比图普）及纯净度层面的科学研究材料及其有机化学名字、结构式、化学式、含量、含水量（如必需）、判定具体做法与底限规定。　　同时，申请者应立即与中检院洽谈对照品（生活品）的校准事项，便于商品发售后能够立即得到法定标准化学物质。　　3、产品质量标准中采用的对照品如中检院在现阶段状况下尚不可以一切正常出示，提议申请者在申请材料中确立商品发售后，标准物质的可获得性及对应措施。　　4、产品质量标准中涉及的各己知残渣，应在产品质量标准中确立其通用性名字（或有机化学名字）、化学结构式、化学式、含量等基本信息，以精确指称、操纵各特殊己知残渣。　　5、通常状况下，为保证标准物质的精确应用和操纵，有待出示对照品（生活品）的产品质量标准，并要求专属性操纵新项目，如非对映异构体残渣的比旋度等。

“跑胶”看到这个，已经进入实验室学习的小伙伴想必不陌生，琼脂糖凝胶制作胶板从而让样品在胶板上产生电泳，简称“跑胶”。通常跑胶分为跑琼脂糖胶和 SDS-PAGE 胶，当然也还有非变性胶，这里主要说明上面两种。SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE 胶）一、原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中 SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS 溶液中，与 SDS 分子按比例结合，形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物，这种复合物会使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块。从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于 SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分离范围取决于胶的聚丙烯酰胺的浓度与交联度。各种需要用到的溶液配方考马斯亮蓝染液在 90 ml 甲醇：水（体积比 1:1）和 10 ml 冰乙酸混合液中溶解 0.25 g 考马斯亮蓝 R-250。用 0.45/0.22um 的膜抽滤，室温保存。脱色液在 90 ml 甲醇：水（体积比 1:1）和 10 ml 冰乙酸混合液用 0.45/0.22um 的膜抽滤，室温保存。1X Tris-甘氨酸电泳缓冲液 （即 Running buffer）25 mmol/L Tris250 mmol/L 甘氨酸0.1%（m/V）SDS同样可以扩大配方为 5X 的储存液。30％ 丙烯酰胺混合液（100 ml）29.2 g 丙烯酰胺（Acr）0.8 g 亚甲基双丙烯酰胺（Bis）10 g SDS 外包锡纸，4℃ 冰箱保存二、制胶选择胶板（0.75 mm 或 0.1 mm 的，上样量会有些差别，新手的话推荐 0.1 mm）制胶前先将胶板刷干净，装上以后用水先验漏（5-10 min）然后倒掉水且从侧边将水用滤纸吸干。根据你的蛋白大小来选择一定浓度的胶。注意最后加入 TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）（因为 TEMED 能够通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺的聚合）先配下层胶每块胶 5 ml，加到固定架子的夹子处即可（图中紫色线所在的位置），然后用加水将胶压平。等待胶干（通过未加完的液来判断）然后是上层的积层胶，先将上层水倒出吸干，再将积层胶加入，立即在其中插入一块干净的梳子，注意不要混入气泡，然后在家一些积层胶溶液彻底填满梳子之间的空隙，将胶垂直放置等待胶凝固。每块胶需配 1 ml，新手可配 2 ml，以防插梳齿时不顺，还可以有补救的机会，同样注意最后加入 TEMED，最后将液用枪均匀打入即可，待干了后即使用。样品处理e.g. 6XSDS-PAGE 上样缓冲 4 ul+蛋白液 20 ul 与小 EP 管中，将其放入沸水中 5 mln，再 8 000 r 离心 5 min。若有多余的孔道可以用上样缓冲+水的混合物来填充。装好跑胶装置将胶专门的夹子夹住注意一定两面均要夹上且夹紧，将整个胶架放入电泳槽中，先加入 running buffer 电泳槽至夹脚上方一点即可，再向胶中加入 running buffer。不要急于加样，可以缓个几分钟看看是否漏液，漏的话需要重新用夹子固定胶。若不漏液，小心地将梳子拔下。三、上样上样尽量选枪头细的枪，maker 最多上 10ul（条带就很深了），上蛋白样 10-20ul 均可（但其他孔道一定要保持一致，这样才能保证各个孔道的条带的平整），多出来的孔道要用上样缓冲稀释液来填充，不然最边上的条带会跑的歪向一边，条带会很丑。跑胶电压一般设置 110 V，其他也是可以的，一般 85～150 V 都问题不大，电压太大速度快但会产热大，电压太小速度太慢。根据所跑的目的蛋白的大小来定时间，若蛋白大小超过 100 kDa，可以让蓝色上样缓冲跑出来后，再跑上 20 min；若蛋白的大小小于 15 kDa，则使蓝色到整块胶 4/5 处就可以停止了；若蛋白大小介于 15-100 kDa 之间，则使蓝色到胶的末尾即可。这样的目的是跑出来的目的条带尽可能的处于相对中间的位置。四、拍照有些上样缓冲中会加有免染的染料，就可以直接通过凝胶成像仪来直接成像。对于一般的情况还是要通过考染（将凝胶浸泡在至少 5 倍体积的染色液中，置平缓摇动的平台上温室染色至少 4 小时），在用脱色液褪色（同样也要在水平的混匀仪器上摇）后在用凝胶成像仪来看即可。琼脂糖凝胶电泳一、原理琼脂糖是 D-和 L-半乳糖残基通过糖苷键交替构成的线状聚合物，且琼脂糖凝胶具有三维网络结构，物质分子通过时会受到阻力，不同的大小的带电物质在电场下涌动时受到的阻力不同，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。一般用于分离核酸分子，同时不同构象的核酸的迁移速率也不一样，超螺旋环状＞切口环状＞线状。不同浓度的胶适用的分离范围也不一样。二、制胶这里以 1% 琼脂糖胶为例缓冲 TBE：Tris-硼酸（TBE）使用液0.5X：0.045mol/L Tris-硼酸0.001mol/L EDTA（pH8.0）储存液（1 000 ml）5X：54 g Tris 碱27.5 g 硼酸20 ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）TBE 尽量用 5X 储存，10X 的比较容易沉淀。染料：溴化乙锭或 SYBR GOLD制胶的第一步是选好梳齿，将胶架放上胶板，再放上梳齿。梳齿决定了胶的孔道的大小，尽量选择厚的梳齿，梳齿的间距较大的，这样一来既可以增加上样量又能避免上样时枪头不小心破坏了胶孔。第二步是取稀释成 0.5X 的 TBE 25 ml，1000X 染料 2.5ul（根据具体染料的乘数来定），0.25 g 的琼脂糖，放入在厚玻璃瓶中，用微波炉对其加热至液体中没有颗粒。第三步是趁热加到胶架上，调整梳齿（不要使梳齿靠到两边，不然挨着的孔会不能用了），赶气泡（用枪头将气泡赶到边缘，不然凝固的胶中有气泡若在孔道中将会影响到样的电泳速度，得到的条带会不平整）。三、上样待胶凝固好了，将胶架取下来放到电泳槽中，（若有多余的孔道可以切下来放入一次性手套中在 4 度保存），用 0.5XTBE 覆盖胶。然后上样 Maker（根据你的样的大小来定）最多 10 ul（如果你的样的上样量少可以酌情减少，这样之后跑完胶照相是条带的相对亮度会更好）；样（处理，用 loading buffer，根据 buf 的乘数来定）最多 20 ul 就足够了。将胶摆正，盖上盖接上电源后（注意胶的摆放一定是向正极跑，不然你的样都跑出去了，你就苦逼了）。调好电压和时间，一般为 110 V，不同的 DNA 大小不同时间也不太一样，但原则上使 maker 跑到胶的 2/3 处就可以了。四、拍照用凝胶成像仪，调整好曝光度，保存条带亮度差不多的即可。

质粒克隆载体的设计和构建的原则①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA--片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DNA--片段。③组装合适的选择标记基因构建的质粒克隆载体应该组装什么样的选择标记基因，必须根据要转化的受体细胞的特性来决定。④选择合适的启动子为了构建表达质粒的克隆载体，必须组装合适的启动子，当设计真核生物的基因须在原核生物中表达式，常改用原核生物或病毒(噬菌体)基因的启动子，而原核生物基因在真核细胞中表达时，仍可用原核生物基因的启动子。质粒载体的分类按复制形式分为严紧型和松弛型复制。根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或在宿主细胞的拷贝数的多少，可以将质粒分为两种不同的复制类型：严紧型和松弛型。严紧型质粒复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，拷贝数较小一般只有1~3个拷贝。疏松型质粒的复制宿主的控制比较松，在宿主中的拷贝数比较多，一般有10~200个拷贝，有时可达到700个。按基因转移性分两类：（1）传递性质粒：常为大型、严紧型质粒；（2）非传递性质粒：多为小型、松弛型质粒。按遗传性状、产物分类（1）抗生素抗性：如氨苄西林、氯霉素抗性；（2）限制酶-修饰酶（R-M）系统：如hsdR-菌株可使DNA甲基化，但不限制外源DNA；hsd-菌株为限制和甲基化双缺陷型。人工构建的质粒载体分类高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。低拷贝数的质粒载体由 pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。如pBEU1、 pBEU2。插入失活型克隆载体。载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42。正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

1mg或是几mg的标准品怎么称量?有人说，要用百万分之一天平，用十万分之一的达不到要求，误差太大。还有人说，在称几个mg的标准品时，最好还是用减量法称量，减量法会更准确。但是，少量标准品一般用分析天平称好溶解后，再一步步稀释得到，而不用一步称到位，再溶解。我们都知道，有些标准品非常昂贵，厂商只能以非常小的包装提供给客户，如1mg\5mg\10mg等，所以，如何高效称量，需要好好判断好再行动哦。标准品相关定义参考值：该值为标准样品研制单位提出，但未经验证或只确定的数值。不确定度：测定结果表达式中说明数值范围的那一部分，表示真值以给定的概率落在此范围内。不确定度的含义是指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度。反过来，也表明该结果的可信赖程度。它是测量结果质量的指标。不确定度愈小，所述结果与被测量的真值愈接近，质量越高，水平越高，其使用价值越高;不确定度越大，测量结果的质量越低，水平越低，其使用价值也越低。准确度：测定值和真值之间的符合程度。标准品称量方法请根据您需要称量的重量和容许误差选择合适的天平。如称量少于10mg的产品，建议使用十万分之一的分析天平。在购买产品时也请注意产品的重量能否满足您的需求。一般采用增量法或减量法进行称量，以下是一些建议供您参考：a.称量前：建议将产品直立放置一段时间，使产品全部集中至底部，便于取用。尤其是粘稠状物质，可以倾斜至与竖直方向呈45度，使产品集中在瓶底边缘。如果当心瓶盖上有粘附，可以在未打开瓶盖前甩动瓶身，使产品集中至瓶底。b.粉末或晶体：建议采用增量法称量，准备合适的干燥容器，归零后将产品倾倒在容器内，得出容器中用于配制标准溶液的物质重量。c.粘稠状或液体：建议采用减量法称量，先称量原产品连瓶一起的重量，再用适当器具移取所需样品至配制容器中，称量移取后的产品连瓶重量，其差值为实际用于配制标准溶液的重量。d.如果瓶盖上粘有物质，可以在减量法称量时连瓶盖一起称量，移取产品时注意使用干燥的器具。瓶内少量标准品的称量和溶解请根据已有的方法或者物质的相关理化性质选择合适溶剂。不适当的溶剂可能造成无法溶解或者产品降解。1.当样品量非常少时，如何从瓶子中获取所有的纯物质呢?有些标准品非常昂贵，厂商只能以非常小的包装提供给客户，如1mg\5mg\10mg等，拿到产品时可能会觉得瓶子是空的，这种情况是由于粉末状的物质会分散在瓶壁和盖子上，而液体状物质会在瓶壁形成一层可能看不见的液层。可根据具体的实际情况，按照以下操作来获取瓶内所有产品：1、擦拭瓶外壁和盖子，等其晾干。2、称量整个瓶子，记录数据，精确至0.1mg。3、用合适的溶剂将瓶内的产品转移到容量瓶中。荡洗瓶盖和瓶内壁数次并都转移到此容量瓶中。4、中等加热或者氮吹使瓶外壁和内壁干燥。5、在同一台天平上称量空瓶连盖的重量，精确至0.1mg。6、两次称量差值即为容量瓶内溶解的产品量。7、用溶剂定容至容量瓶刻度，即可计算所配溶液的浓度。2.能否直接将溶剂加入标准品的瓶子中进行溶解，再转移到容量瓶中定容?不能。一般除非特别指明，所有标准品厂商给出的产品质量和体积都不是精确数值，比如10mg的标准品，其瓶中的产品重量可能大于10mg，如10.5mg或11mg。如果产品的重量为精确数值，厂家一般会特别注明，如CDDD-SC494-10MG，其在证书中有说明。所以请务必先对产品进行称量，在标准曲线浓度计算中使用实际称量数值。注意事项产品的保质期：厂家的标签或分析证书上一般有保质期限，其含义是当产品未打开使用并按照厂家注明的条件进行保存时，厂家对产品的纯度与分析证书上的纯度的一致性负责。由于分析中会有一定的误差，所以产品的纯度一般有一个不确定度或误差范围。有一些产品，由于物质性质比较特殊，厂家对产品不标明具体的保质期限，而是保证在出厂或者客户收到产品的一定时间范围内有效，即在此时间限度内厂家对产品的纯度与分析证书上的纯度的一致性负责。产品打开使用后：产品打开使用后，纯品型的标准品，一般在适当储存条件下还是比较稳定的，厂家给出的产品保质期也是可以参考的，少数挥发性物质如乙醛等除外。而对于溶液型的标准品，建议客户打开后尽快使用，物质降解和溶剂挥发等原因都有可能对溶液的浓度产生影响。标准溶液的稳定性：对于购买的溶液型标准品和自己用纯品型配制的标准溶液，在初次使用后请在适当条件下保存。一段时间后如需再次使用，请通过与之前的数据对比对溶液的浓度进行确证再使用。

　　对照品（标准品）是执行药品质量标准的实物对照，是量值传递的重要载体，是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具、测量药品质量的基准、确定药品真伪优劣的物质对照，也是作为校正测试仪器与方法的物质标准。　　对国家药品标准而言，它是国家颁发的一种药品计量、定性的标准物质。药品标准物质必须具备材料均匀、性能稳定、量值准确等条件，才能发挥其统一量值的作用。在药物研发当中，对照品（标准品）涉及量值溯源、产品定性、杂质控制等重要环节，其制备和标定情况与药品的质量研究、稳定性研究乃至药理毒理学研究中剂量的确定等临床前基础研究间存在密切关系，因此，药品对照品（标准品）的制备与标定是药品技术审评的一项重要内容。一般来讲，药品研发中标准物质的使用一般可参照如下原则：　　1、所用对照品（标准品）中检院已有发放提供（可参阅中国药典2010年版二部附录ⅩⅤ　G），且使用方法相同时，应使用中检院提供的现行批号对照品（标准品），并提供其标签和使用说明书，说明其批号，不应使用其他来源的标准物质；使用方法与说明书使用方法不同时，如定性对照品用作定量用、效价测定用标准品用作理化测定法定量、UV法或容量法对照品用作色谱法定量等，应采用适当并经验证的方法重新标定，并提供标定方法和数据；若色谱法含量测定用对照品用作UV法或容量法，定量用对照品用作定性等，则可直接应用，不必重新标定。　　2. 中检院尚无对照品（标准品）供应时，可使用如下标准物质进行标准制订和其他前期基础性研究工作：　　（1）国外药品管理当局或药典委员会发放的对照品（标准品）或国外制药企业的工作对照品（标准品），但应提供其包装标签的彩色照片及使用说明的复印件，说明批号、有效期、使用方法等信息，能保证其量值溯源性；　　（2）申请人自行标定或委托省所完成对照品（标准品）的标定，申报时提供标准物质的研究资料及相关信息，一般包括如下内容：　　①主成分对照品--制备工艺、结构及含量方面的研究资料以及通用名、化学名、结构式、分子式、分子量、各种杂质含量（水分、残留溶剂、无机盐等）、主成分含量测定数据（不同分析技术）、用途、贮藏条件等信息。　　②杂质对照品--制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及含量（不同分析技术）方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、用途、贮藏条件等信息。　　③混合对照品（定位）--各组分制备工艺、结构（UV，IR，NMR，MS，X射线衍射的解析或提供对照图谱）及纯度方面的研究资料以及化学名称、结构式、分子式、分子量、含量（如必要）、定性具体方法与限度要求。　　同时，申请人应及时与中检院接洽对照品（标准品）的标定事宜，以便产品上市后可以及时获得法定标准物质。　　3、质量标准中用到的对照品如中检院在目前情况下尚不能正常提供，建议申请人在申报资料中明确产品上市后，标准物质的可获得性及相应措施。　　4、质量标准中涉及到的各已知杂质，应在质量标准中明确其通用名称（或化学名称）、化学结构式、分子式、分子量等相关信息，以准确指称、控制各特定已知杂质。　　5、一般情况下，为确保标准物质的准确使用和控制，尚需提供对照品（标准品）的质量标准，并规定专属性控制项目，如非对映异构体杂质的比旋度等。

抗酸染色的基本原理：分枝杆菌的植物细胞内带有很多的脂类，包围着在肽聚糖的外边，因此分枝杆菌一般不容易上色，要历经加温和增加上色时间来促进其上色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染剂融合后，就难以被酸碱性脱色剂褪色，故称抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加温标准下使分枝菌酸与石炭酸复红坚固融合成一氧化氮合酶，用盐酸乙醇解决都不褪色。当再加偏碱美兰复染后，分枝杆菌依然为鲜红色，而别的病菌及情况中的物质为深蓝色。抗酸染色一般流程1）初染用装片夹夹紧抗酸染色标本采集，滴加石炭酸复红2-3滴，在火苗高空缓缓加温，切忌烧开，出现蒸气即临时离去，若染色液挥发降低，应加上染色液，以防干枯，加温3-5分钟，待标本采集制冷后自来水清洗。2）褪色3%盐酸乙醇褪色30秒~1分钟；自来水清洗。3）复染用偏碱美兰水溶液复染1分钟，水清洗，用吸水海绵吸走后用食油镜观查。

　　目前主流的实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）方法分为染料法和探针法，染料法以SYBRGreen法为代表，SYBRGreen染料游离时荧光微弱，但但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，反应管中的荧光强度与反应管中双链DNA的数量成正比例关系，因此荧光定量pcr实验步骤可以通过检测荧光计算反应管中产生的双链DNA（PCR产物）的量，但该方法没有特异性，非特异性扩增的产物也会被计入。　　对于探针法来说，反应管中的荧光强度也是检测PCR产物量的依据。但其发光机制却与染料法完全不同。　　一、荧光　　是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光。　　其原理为：光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。　　（紫外验钞的原理就是利用了经漂白处理后的纸张在紫外线(波长为365nm的蓝光)的照射下会衍射出波长为420460nm的蓝光　　二、荧光共振能量转移fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)　　荧光物质间存在一种现象，如果一个荧光基团（称为供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当二者的距离接近到一定程度（1-10nm）供体被激发光激发但是却不发出该物质的发射光，而是将能量转移至受体，整个能量转移的过程中由一对偶极子介导，不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭（即供体荧光被受体淬灭）；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。　　三、qPCR探针法的本质　　目前所有的探针法qPCR的理论基础都是利用了荧光共振能量转移现象，探针上存在一对能产生荧光共振能量转移的基团，利用PCR反应中的一些过程（酶切，杂交等），使两个基团的距离产生变化，使系统中的荧光强度或者荧光种类发生变化，这种变化又与PCR产物的种类和量有直接关系，通过检测这种变化，我们就可以检测出PCR反应体系中产物的种类和量。　　四、几种qPCR探针法　　1、Taq-Man探针：Taq-Man探针法是最经典的探针方法，设计一条与扩增产物能互补杂交的探针，在探针的5’端标记荧光基团（供体），在探针3’端标记淬灭基团（受体），当探针完整时，荧光基团和淬灭基团距离很近（探针长度）因荧光共振能量转移，荧光基团在入射光激发下不发出荧光。PCR反应进行时，探针杂交在扩增产物上，当引物介导的延伸反应到达探针位置时，因taq酶拥有5’-3’的外切酶活性，会从5‘端切割（水解）探针，从而使5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团分离，使它们的间距超过10nm，超出荧光共振能量转移的范围，荧光基团此时在合适入射光的作用下，就能发出自身波长的荧光。探针杂交是特异性的，所以荧光的种类和量能特异性的代表目标产物的种类和量。　　近年来对Taq-Man探针进行改良发展出TaqMan-MGB探针，在Taq-Man探针的3端加入一个能插入DNA小沟的二氢环化吲哚卟啉-三肽（DPI3），可以使大大提高探针的TM值，增加杂交反应的特异性。　　2、双杂交探针（dualhybridizationprobe）：与Taq-Man法不同，双杂交探针的供体基团和受体基团分别在两条探针上，这两条探针都可以与扩增产物杂交，杂交位置不同但很接近，反应时两条探针一头一尾杂交于扩增产物上，杂交后两个基团距离在10nm以内（一般1-5碱基），此时产生荧光共振能量转移现象，激发光下供体基团不发光，受体基团发光，检测受体基团的发光情况既可以确认扩增产物的情况。　　3、分子信标探针（molecularbeacon，MB）：分子信标探针采用的是在反应中增加荧光基团和淬灭基团距离的方法，和Taq-Man法不同，分子信标探针不是采用酶切的方式使荧光基团和淬灭基团分离，而是通过杂交的方式改变探针二级结构，增加两个基团的距离从而使荧光基团发光。　　分子信标探针在与靶序列杂交前呈现一个茎环结构，其中环部分为能与靶序列互补杂交的特异性序列，臂部分互补，荧光基团和淬灭基团分别在两臂的末端，当分子信标探针呈茎环状态时，荧光基团和淬灭基团距离极近，荧光基团被淬灭。　　当PCR扩增反应产生靶序列产物，探针环部分与靶序列发生杂交，两臂距离因此拉开，两个基团间的距离不能形成荧光共振能量转移，荧光基团发光。　　4、蝎形探针（scorpion）：蝎形探针又叫蝎形引物，因形状类似蝎子而得名，其基本原理与分子信标探针十分类似，不同点在于，蝎形探针3’端带了PCR引物，反应中得到的产物与蝎形探针为一个分子，探针的杂交在分子内部，而不需要两个分子参与，从而使杂交反应更加迅速，高效。

　　含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（pureculture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。　　　　１、倾注平板法　　首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50℃左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。　　　　２、涂布平板法　　首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。　　　　３、平板划线法　　最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。　　　　４、富集培养法　　富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。　　　　５、厌氧法　　在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。　　　　6、单细胞（或单孢子）分离法　　是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是选择错了切片、抗体或蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。二、“杂音”染色片免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，以下将其归纳为下面几种。1、全片着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4度冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。2、切片边缘着色切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：（1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。（2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。3、“阴阳脸”着色指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。4、灶片状着色切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：（1）裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。（2）坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。（3）制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（5ml盐酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥（室温）、2% APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮（1-2秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2秒钟）、37 度过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。5、间质着色着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。6、细胞浆着色胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干扰。7、细胞核着色不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长（如从星期五浸泡到下星期一）、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。其他常见问题：1、脱片产生的原因有哪些？（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。（3）没烤好，时间短，温度不够之类。（4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。（6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。（7）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。2、免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？（尤其是微波修复）关于抗原修复，我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为：2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调PH值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。对于柠檬酸修复来说，只要高压修复时间控制在加阀冒气后90秒，冷水下终止开高压锅盖，高压修复和微波修复一样不掉片子，而且一般高压修复效果往往更好一点；关于EDTA热修复，一般说明书上都讲的是PH值等于9，实际上我试过，如果单传用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不会掉片子了，Tris-base的浓度为0.05mmol/L,高压和微波修复都可以，PH也等于9。3、DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：（1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。（2）有可能是你的显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。（3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

单克隆抗体制备的原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力、B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的、将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术。单克隆抗体制备的过程：免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。单克隆抗体制备的意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值(1)沉淀反应：Precipitation reaction(2)凝集实验：haemaglutination(3)放射免疫学方法检测免疫复合物(4) 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离.(5)ELISA 等免疫学检测(6)BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 .(7)免疫印记(western blotting)(8) 免疫沉淀：(9) 亲和层析：分离蛋白质(10) 磁珠分离细胞(11)临床疾病的诊断和治疗;

【简介】抗A,抗B血型定型试剂(单克隆抗体)用A血型单克隆抗体或B血型单克隆抗体配制而成，用于鉴定人ABO血型。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。【用途】 本试剂盒专/供鉴定人血型用，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。【测定原理】 利用单克隆抗A、抗B抗体和相应的红细胞抗原发生特异性凝集反应的原理。能和抗A抗体发生凝集反应，而不和抗B抗体反应的为A型；和抗B抗体发生凝集反应而不和抗A抗体发生反应的为B型；同时能和抗A及抗B抗体发生凝集反应为AB型；而不被抗A及抗B抗体凝集的则为O型。【测定步骤】 1.被检者的抗凝血，用生理盐水洗涤1-2次后，取压积红细胞配成5%的生理盐水悬液。2.取小试管5支，分别标明抗A、抗B、A细胞、B细胞、O细胞。在抗A管内加1滴抗A试剂，抗B管内加1滴抗B试剂，A细胞、B细胞、O细胞管内各加被检血清1滴，然后在抗A、抗B管内各加被检红细胞1滴，A细胞管内加1滴5% A型红细胞悬液，B细胞管内加1滴5% B型红细胞悬液，O细胞管内加1滴5% O型红细胞悬液。3.混匀，离心1000转/分，1分钟。然后判断结果。【结果判断】按下表判别被检者血型被检者血型 正定型 反定型抗A 抗B A细胞 B细胞 O细胞A + - - + -B - + + - -O - - + + -AB + + - - -“+”表示凝集,“-”表示不凝集【注意事项】1.本试剂可用平板法(玻片法)操作，步骤如下：本试剂与受检者全血或10%红细胞生理盐水悬液在玻片上按1：1比例混合，摇匀，3分钟按照有无凝集判定结果。2.最好血型试验与细胞试验同时进行。3.单克隆抗体试剂发生定型疑问时，用人血清型试剂来裁决。