不同动物细胞融合的特点和诱导因素1、病毒诱导融合病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。2、聚乙二醇（PEG）诱导融合聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。优点：聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高缺点：PEG有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。3、电融合20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，在相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。

随着生命科学的迅速发展，细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值,已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。昆虫细胞是农业生物应用方面的高新技术，主要是提取来自昆虫的一类真核细胞。通过培养制造宿主的病毒，这些病毒可以引起昆虫流行病，但对人畜和植物无害，因而可作病毒杀虫剂。还可以生产某些药用蛋白。许多昆虫培养基配方正不断得到改进,以使之适于细胞生长。zui通用的商品培养基有Grace氏培养基、TC-100、IPL-41、TNM-FH以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC199-MK等。细胞培养的关键是培养基配方的开发,已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长。昆虫细胞培养所用培养基一般均补加FBS,血清提供了细胞生长过程中所需的营养物质和微量元素,使细胞能健康生长和传代。但是FBS的使用也存在着缺点:价格高；每批血清的质量不同,影响细胞的生长和病毒复制；血清中的蛋白影响从培养的上清液中分离和提取重组蛋白,使蛋白的纯化更加困难；血清易被支原体污染。由于部分加入胎牛血清或牛血清使典型昆虫培养基变得很复杂。因此,无论工业上或学术上,开发无血清培养基都是必然的趋势。由于在无血清培养基中含有从血清或动物脏器中纯化的蛋白成分,如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白和脂蛋白等,增加了分离纯化的难度和成本。细胞在无血清低蛋白或无蛋白培养基环境中对剪切应力更为敏感,故需适当提高保护剂的浓度。无血清培养基的应用有时会降低重组蛋白的产量,在无血清培养基内,较高的细胞生长密度与相对较低水平的重组蛋白产量这一事实表明,促进细胞分裂的因子与促进重组蛋白生产的杆状病毒感染晚期起作用的因子是不尽相同的。无血清培养基配方还需进一步改进以便适应于重组蛋白的表达。中文名称：HighFive昆虫细胞（保成活）规格：1支供应商：上海远慕生物应用：用于杆状病毒增殖和重组蛋白表达诱导方法：杆状病毒诱导细胞特点:     可用于 Express Five?SFM。High Fiv昆虫细胞 (BTI-TN-5B1-4) 是从亲代 Trichopulsia ni 细胞系分离得到的克隆，通常用于使用杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 的重组蛋白表达。 这种细胞能在 Express Five? SFM 中进行无血清悬浮培养，显著节省了与无血清和/或悬浮培养时的培养物驯化相关的时间和经费。 Express Five? SFM 是使High Five细胞实现最佳生长和重组基因表达的优化无蛋白昆虫细胞培养基。进行如下测试： 检验每个批次从超低温冷冻法回收后的生长和活力，并测试其是否含有支原体。远慕生物的HighFive昆虫细胞（保成活）质量好，用的放心，保证您购买到的都是最新批次的产品，欢迎新老客户来电订购！

细胞转染常见问题一、转染效率低影响转染效率因素很多，主要因素有细胞培养物、血清、载体构建、DNA质量以及转染技术等。1.没有使用优化条件：优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。2.DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。3.存在抑制剂：不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素。透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。4.不恰当的细胞密度：转染时融合度应为70%-90%。5.阳离子脂质体试剂冻结：不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。6.质粒纯化的问题。二、细胞死亡率高1.DNA量太高2.阳离子脂质体试剂量太高3.在转染过程中使用抗菌素：在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。4.细胞太少5.在无血清条件下细胞活性降低：使用OPTI-MEM培养基。确保在不存在血清的条件下形成复合物。6.阳离子脂质体试剂被氧化：不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂，这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。7.对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快：在加入筛选性抗生素前至少预留24-48h使细胞表达抗性基因。   细胞转染注意事项1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。3.有血清时的转染：1）在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。2）阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此在转染培养基中加入血清时需要对条件进行优化。3）大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEM培养基，一种营养丰富的无血清培养基。4.培养基中的抗生素抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素（稳定转染最常用的抗性筛选试剂）的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。5.设置阳性对照和阴性对照。6.一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。7.如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

大多数原代贴壁细胞贴壁时间是6h到12h，细胞不贴壁有好多种原因的：1、如果你用玻璃培养瓶培养的话，有可能你的瓶子没处理好；建议你用一次性培养瓶，进口的都可以。2、一般做原代细胞贴壁培养用胰酶消化，消化的程度要掌握好，如果消化时间不到、分散不均匀不贴壁。一般消化有热消化，就是放在37度里消化，时间比较短不好控制，传代培养常用。还有就是冷消化放在4度里，一般在几个小时以上，胰酶浓度也有要求的，一般都用0.125－0.25％之间。ph在7.6左右。3、还有就是天然培养基的选择，就是血清种类，血清能够使细胞贴壁，并且提供细胞生长的重要营养成分。细胞培养中的不贴壁及分化的解决办法如果细胞呈现不贴壁现象，且细胞根本就不能锚定的解决办法:1、可以在铺有琼脂和琼脂糖的培养皿上克隆细胞，也可在衬有琼脂的甲基纤维素的非组织培养用平皿制备细胞克隆。2、在这些支持物中应适当添加生长因子及添加物。3、如使用组织培养用平皿克隆细胞，应在灌制琼脂等支持物前铺加饲养层。如果细胞呈现不贴壁现象，但细胞能够锚定但贴壁不佳的解决办法:使用铺加了甲基纤维素的组织培养用用培养皿进行细胞克隆。细胞培养如果细胞不发生分化，解决办法如下： 1、更换能够诱导细胞分化的培养条件。 2、在细胞分离和传代中使用选择性培养基。细胞培养中如果所养细胞丧失产物形成能力，解决办法如下： 1、采用PCR及Northern杂交方法，检测相关基因表达能力。 2、采用PCR及Northern杂交方法检测报告基因和方案。 3、使用分化诱导条件。 4、在细胞分离和传代过程中针对特定细胞使用相应的选择培养基。 

　　一、可利用交叉实验即可辨别ELISA试剂盒是否造假，方法如下：　　1.取出购买的试剂盒A的包被板两条；　　2.一条包被板加试剂盒A的标准品做标准曲线；　　3.另一条包被板加试剂盒B的标准品做标准曲线；　　4.后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物；　　5.实验完毕后，检测两条标准曲线，如果两条标准曲线一致则说明两个ELISA试剂盒检测的同一个指标而非A和B，即该试剂盒为伪劣假造ELISA试剂盒。　　6.如果两条标准曲线不一致则说明两个ELISA试剂盒检测的不同指标，试剂盒A只能检测A，不能检测B，即该试剂盒为正常的。　　二、ELISA试剂盒真假分辨　　1、看产品包装　　没有任何的出产地址、等信息，却挂着如R&D等大公司的LOGO，这种产品有问题了连个投诉的地方都没有，假如投诉，供货方会敏捷容许赔付，但您得到的可能是换了包装的相同的东西。　　2、看品牌　　一个仅仅说自主研制，自己包被却没有品牌的公司，你拿到的试剂盒发文献怎样发？不要相信什么写供货商的公司就能够发，底子不可行。　　3、看产品品种　　要什么有什么的，你得好好考虑一下，那么多质料他得投入多大本钱，得有多大的出产车间和多少冰箱，对方是否有这个实力！　　4、看出产地址　　底子没有出产地址，就租了个民宅或商务办公室。咱们知道做试验做产品需求许多的仪器、试剂、耗材，没人相信一间办公室能够出产各式各样的试剂盒。　　5、看价格　　价格低得离谱，却打着进口R&D等大公司质料分装。咱们自己核算一下本钱，这种低得离谱的价格连质料都买不起，哪家公司会亏着本买东西？　　最好辨认假货的办法就是是否每年都有发布SCI文献，假如能够实地去看看他们的出产条件，敢让您去看的，每年发布SCI文献的，做假货的可能性去除80%。

elisa试剂盒试验原理：试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。elisa试剂盒组成结构：1、 血清:操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。2、 血浆:EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。3、 细胞上清液:1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。4、 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。5、 保存:如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。elisa试剂盒试剂盒成分：1 预包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 96T2 酶标记抗体: (30倍浓缩)HRP标记抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 0.4mL x 13 标准品: 重组小鼠白介素-6 0.5mL x 24 EIA缓冲液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 30mL x 15 标记抗体稀释液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 12mL x 16 显色剂: TMB底物液 15mL x 17 终止液: 1N硫酸 12mL x 18 浓缩洗涤液: (40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 50mL x 1 操作说明 1实验所需器材(但试剂盒没有提供) 酶标仪(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及烧杯 去离子水 冰箱(4°C) 坐标纸(log/log) 吸水纸 试管(用于标准品稀释) 温育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性试剂管(用于浓缩酶标记抗体和显色剂)

实验室常用小型设备包括：天平、水分测定仪、超纯水机、PH计、电导率仪等，相比大型分析仪器，小型设备对环境条件要求相对少，但对于它们的维护保养却同样值得重视，以电子天平为例，无论是使用、维护、保养都应该谨慎对待，否则，称量稍有误差，就会导致后续的一系列分析数据失去参考价值。本文远慕生物主要针对电子天平、PH计(酸度计)、紫外可见分光光度计、电导率仪等小型仪器的维护、使用、及保养原则予以整理。一、电子天平的使用、维护、保养1.使用条件：称量台：稳固的实验台或石台，不得用铁板制品、塑料和玻璃制品的材料。工作室：只有一个出入口(防止空气对流);窗户数量尽量少(避免阳光直射)温湿度：温度要求15-30oC(并尽可能保持稳定)、湿度30-65%RH(尽量保持在50% RH)空气：避免空调或风扇直吹天平，并避免将调温、除湿设施安放于天平附近。2.操作注意事项：调平：使用天平前应首先检查气泡是否在水平仪的中央，必要时调节调平螺丝直至水平。称量之前天平必须预热30分钟以后方可称量; 自校：带有自校功能的天平在一系列称量之前要进行仪器自校已提高称量的准确性和稳定性;不能用手直接接触被称物体或将手伸入称量间，以防止被称物体或称量间温度、湿度发生变化; 电子天平不能直接称取过冷、过热、腐蚀性物品; 电子天平应远离磁场;天平在挪动位置或故障修复后均需重新进行校准; 无论任何时候切勿让风吹入称样室内。3.维护与保养：称样室与称样盘的清洁。用柔软的毛刷将天平内的杂物清理干净后用布蘸少许肥皂水轻轻地对天平进行擦拭。(且不可用有机溶剂如：酒精);使用时要用清洁的称量容器;若要更换配件或有不明原因的故障需要和供应商或厂家联系;保持天平室内卫生，不可堆放杂物或经常出入。4.期间核查：期间核查周期：可根据使用频次制定，但最长时间不得超过半年。核查内容： 计量检定标志是否齐、清晰、牢固;检查天平的使用条件;检查天平是否水平; 天平四角误差: 将砝码依次加放在面积约等于承载器1/4的区域内，用标准砝码分别放4个区域重复称量至少3次，每点法定允许差为1.0e(根据不同精度等级e值、法定允许差、最大允差可在检定证书中查找)，由于环境条件影响一般情况最大允差小于1mg是允许的。(《0.0010g);重复性测试：用50%的最大称量进行重复测试至少3次，每点法定允差为1.0e，每次称量不得超过最大允差。5.一般故障分析天平不显示：天平未开启;未接上电源线;缺乏交流电源;发生暂时性干扰(可以关闭天平后再开启，或拆除电源线后再接回);工作电压调整错误;电源保险丝失效，可依照说明书进行更换或与供应商联系。OFF信号只显示上半部分 ：暂时性电源中断，可按下控制杆;超过最大量程;天平开启时，称量盘上有物件。(移走物件) 。称量的结果不稳定：天平室或称样室内气流太大(关闭挡风窗);天平放置的地方不稳定;天平室内留有手的体温;称量的物体并非处于室温。二、PH计(酸度计)使用、维护、保养1.使用条件：稳固的实验台，仪器周围无强烈震动，无腐蚀性气体;电源应符合仪器规定的 电源电压;环境温度控制在20-30 oC。2.操作注意事项:测定前仪器至少预热30分钟;在测定样品前必须按操作规程对电极进行常规校准一般选用(三组)PH为4.01/6.86/9.00的缓冲溶液进行校准;如果所用电极没有温度补偿应按照操作规程规定的测定温度对测定溶液的温度进行调整;必须保证待测溶液混合均匀;PH计(酸度计)为精密仪器，电极内有毛细管，更换溶液或搬动时动作要轻;系列测定过程中每次更换溶液时，用蒸馏水冲洗电极后，再用干净的滤纸吸干电极上的水(注意：不得擦拭!因为这样会产生极化和响应迟缓现象);小心使用电极，请勿将之用作搅拌棒。在拿放电极时请勿接触电极膜。电极的损伤会导致精度降低和响应迟缓现象;请勿使用超过保质期的缓冲溶液，同时用剩下的缓冲溶液不可倒回试剂瓶。3.电极的保养：请勿使电极填充液干涸，因为这样可能导致电极的永久损伤。将装有(3mol/L的氯化钾)正确填充液的电极竖直放置，并周期性的更换全部填充液;要长期存放电极必须选用合适的电极存放盒，盒内充满填充液，最好盖住填液孔;电极响应缓慢或不精确时可以用蘸有丙酮或肥皂水的脱脂棉擦去电极表面的污垢;0.1MHCI浸泡过夜。4.常见故障：显示-----(测定超出范围)：检查电极是否连接 ;检查电极是否浸入样品;检查电极保湿帽是否移走;更换电极。读数不稳定： 检查电极填液孔是否打开;检查样品是否盖没接口;检查电极液接口是否存在气泡;清洁或更换电极接口 。响应缓慢：检查电极填液孔是否打开;检查溶是否处于不同温度;避免在两次测定之间擦拭电极;样品本身离解力低也会导致响应迟缓;清洁/调节电极。读数不正确 ： 检查是否使用正确的校准缓冲溶液;检查缓冲溶液是否超过保质期或被污染。5.期间检查：每次使用前必须反复校准电极，并利用校准液进行反测，使其达到检测要求。

　　试剂规格基本上按纯度(杂质含量的多少)划分，共有高纯试剂、光谱纯试剂、基准试剂、分光纯试剂、优级纯试剂、分析试剂和化学纯试剂等7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3种。选用不同纯度试剂的标准主要是不同的反应需求，以及该试剂所含杂质对分析要求有无影响。　　按照国家标准，根据试剂中所含杂质的多少，划分为三个等级国对比如下：　　实验试剂(LR：Laboratoryreagent)，又称四级试剂。 除了上述四个级别外，目前市场上尚有：化学试剂;基准试剂：专门作为基准物用，可直接配制标准溶液; 光谱纯试剂(SP)：表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分达不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。纯度远高于优级纯的试剂叫做高纯试剂(≥99.99%)。　　目前，国外试剂厂生产的化学试剂的规格趋向于按用途划分，常见的如下：生化试剂(BC：Biochemical) 生物试剂(BR：Biologicalreagent) 生物染色剂(BS：BiologicalStain) 络合滴定用(FCM：ForComplexometry)试剂。　　定义及分类　　试剂纯化工产品纯度就是原料的纯净程度，相对来说也是指原料的含杂程度。纯度越高的原料所含的杂质种类和数量越少。化工原料按纯度可分为工业纯和试剂纯二大类。而试剂纯的原料按纯度高低又可分为四级。对化学试剂，我们习惯上有许多混乱的称谓：　　以含量为基础的称谓　　标准物质、标准溶液、标准杂质溶液、标准对照品、标准样品、行标试剂、指示试剂、基准物质、基准试剂、化学基准、化学标准、仪器标准、分析试剂、一类试剂、二类试剂、超纯试剂、高纯试剂、当量试剂、医药标准、农药标准、光谱纯、色谱纯、电子纯、钢铁标样、生铁标样、煤标样、矿石标样等……　　以用途为基础的称谓　　化学试剂、通用试剂、分析试剂、诊断试剂、教学试剂、实验试剂、分离工具、缓冲溶液、指示试剂、生物染色素、感光材料、合成试剂、中间体、化工原料、水质分析、残留农药测试、分子生物学试剂……　　以来源为基础的称谓　　进口试剂、天然物提取、浸膏、干粉、提取物…… 以习惯为基础的称谓：化学药品、精细化学品、药品、冷偏试剂、特种试剂、一类试剂、二类试剂、三类试剂、小品种试剂……　　以性质为基础的称谓　　无机试剂、有机试剂、同位素及标记化合物、生化试剂、氨基酸及其衍生物、蛋白质与多肽、核苷酸及其衍生物、单糖与多糖、酶和辅酶、抗生素、维生素、染料及色素、培养基、层析介质、电泳介质、生物缓冲剂……　　化学纯：是指一般化学试验用的，有较少的杂质，不妨碍实验要求。　　分析纯：是指做分析测定用的试剂，杂质更少，不妨碍分析测定。　　色谱纯：色谱纯试剂是在最高灵敏度下以10-10克下无杂质峰来表示的。是指进行色谱分析时使用的标准试剂，在色谱条件下只出现zhi定化合物的峰，不出现杂质峰。　　实验纯：代号LP，一般使用黄标签，纯度较差，杂质含量不做选择，只适用于一般化学实验和合成制备。　　超高纯试剂：UP-S级(也就是MOS级)：金属杂质含量小于1ppb,适合 0.35—0.8微米集成电路加工工艺。　　等离子体质谱纯级试剂(ICP-Mass Pure Grade)：绝大多数杂质元素含量低于0.1ppb，适合等离子体质谱仪(ICP Mass) 日常分析工作。　　等离子体发射 光谱 纯级试剂(ICP Pure Grade)：绝大多数杂质元素含量低于1ppb，适合等离子体发射光谱仪(ICP) 日常分析工作。　　原子吸收 光谱纯级试剂(AA Pure Grade)：绝大多数杂质元素含量低于10 ppb，适合原子吸收光谱仪(AA) 日常分析工作。　　优级纯与色谱纯的区别　　试剂纯度级别：农残级>色谱级>优级纯>分析纯。　　优级纯与色谱纯纯度都很高，色谱纯主要是指对吸光物质的xian量作为指标考察。但是，优级纯的试剂里含有微量(甚至痕量)的具有紫外吸收的物质，对于化学反应来说，这些物质可能并不影响，但是做液相实验干扰就大了，常用于精密分析试验，可作为基准物质。　　色谱纯是指色谱专用溶剂或者试剂，在低波长处的透光率比较好。也特指进行色谱分析时使用的标准试剂，在色谱条件下只出现zhi定化合物的峰，不出现杂质峰。避免了一些不良影响。　　一般情况下都用色谱纯，在气质时用农残级。　　色谱试剂与色谱纯试剂区别　　两个截然不同的概念，色谱纯是指试剂的纯度而色谱试剂是指试剂应用的对象。色谱纯试剂纯度发很高，除要求含量高以外，还对微尘、水分都有很高的要求，属于高纯试剂的范畴。而色谱试剂是指用于色谱分析、色谱分离、色谱制备的化学试剂。因色谱种类多，过程复杂，故又把色谱试剂分类成各种不同的色谱试剂如：气相色谱试剂、高压液相色谱试剂、薄层色谱试剂、柱层析色谱试剂、离子色谱试剂、离子对色谱试剂等。而各种色谱试剂中根据用途的不同，又分为色谱标准物、色谱固定相、色谱固定液、色谱担体、高压液相色谱淋洗剂、离子标准液、离子对试剂。　　色谱试剂通常泛指用于色谱分析，包括各种色谱仪器、色谱方法上所用的试剂，对试剂没有强制的纯度或一定数据数值规定，如用于气相色谱固定液、簿层层析用等;色谱纯试剂已经提升到“纯”的要求和规定，就应该有纯度或一定技术数据和数值的规定，至少要有一项标准规范，不然，不同产地的“色谱纯”会得出相同的结果吗?那么为什么有了液相色谱的HPLC溶剂，还要有农残级溶剂，上世纪液相色谱还有用AR级溶剂作流动相的。所以，GB/T 22388—2008 中的3.2.1 甲醇：色谱纯、3.2.2 乙腈：色谱纯，其“色谱纯”应该更明确一些出处或制定配套标准。　　GC级色谱纯与HPLC级色谱纯区别　　色谱纯是指试剂的纯度而色谱试剂是指试剂应用的对象.色谱纯试剂纯度发很高,除要求含量高以外,还对微尘、水分都有很高的要求,属于高纯试剂的范畴.　　而色谱试剂是指用于色谱分析、色谱分离、色谱制备的化学试剂.因色谱种类多,故又把色谱试剂分类成各种不同的色谱试剂如：气相色谱试剂、高压液相色谱试剂、薄层色谱试剂、柱层析色谱试剂、离子色谱试剂、离子对色谱试剂等.而各种色谱试剂中根据用途的不同,又分为色谱标准物、色谱固定相、色谱固定液、色谱担体、高压液相色谱淋洗剂、离子标准液、离子对试剂.　　色谱纯(GC)：气相色谱分析专用.质量指标注重干扰气相色谱峰的杂质.主成分含量高.　　色谱纯(LC)：液相色谱分析标准物质.质量指标注重干扰液相色谱峰的杂质.主成分含量高　　化学试剂有效期　　化学试剂在贮存、运输和销售过程中会受到温度、光辐照、空气和水份等外在因素的影响，容易发生潮解、霉素、变色、聚合、氧化、挥发、升华和分解等物理化学变化，使其失效而无法使用。因此要采用合理的包装，适当的贮存条件和运输方式，保证化学试剂在贮存、运输和销售过程中不变质。对一些对贮存和运输有特殊要求的应按特殊要求办理。有些化学试剂有一定的保质期，使用时一定要注意。　　化学试剂的有效期随着化学品的化学性质的改变，有着很大的区别。一般情况下，化学性质稳定的物质，保存有效期就越长，保存条件也简单。　　稳定性判断原则　　初步判断一个物质的稳定性，可遵循以下几个原则：　　无机化合物　　只要妥善保管，包装完好无损，可以长期使用。但是，那些容易氧化、容易潮解的物质，在避光、荫凉、干燥的条件下，只能短时间(1～5年)内保存，具体要看包装和储存条件是否合乎规定。　　有机小分子量化合物　　一般挥发性较强，包装的密闭性要好，可以长时间保存。但容易氧化、受热分解、容易聚合、光敏性物质等，在避光、荫凉、干燥的条件下，只能短时间(1～5年)内保存，具体要看包装和储存条件是否合乎规定。　　有机高分子　　尤其是油脂、多糖、蛋白、酶、多肽等生命材料，极易受到微生物、温度、光照的影响，而失去活性，或变质fu败，故此，要冷藏(冻)保存，而且时间也较短。　　基准物质、标准物质和高纯物质　　原则上要严格按照保存规定来保存，确保包装完好无损，避免受到化学环境的影响，而且保存时间不宜过长。一般情况下，基准物质必须在有效期内使用。　　小结　　大多数化学品的稳定性还是比较好的，具体情况要由实际使用要求来判定。如果分析数据作为一般了解，或者分析结果没有特定的准确要求，如一般教学实验，对化学试剂的质量级别就可以做一般要求。但工厂化验数据为指导生产而用，化学试剂的质量指标绝对不能含糊。而用于一般合成制备使用用的化学试剂，在大多数情况下，使用工业级别的化学试剂就可以满足。但研究型和某些特种化学品的合成制备，有些情况下，对原料的质量要求非常严格，需要严格把关。　　小编在此还要再次提醒，一定要区分好试剂类型和用途，避免出现该用色谱纯的时候用了分析纯这样的低级错误，而导致实验失败，无形中也浪费了实验试剂，得不偿失哦!

亚甲基蓝的基本信息亚甲基蓝，化学式为C16H18N3ClS，是一种吩噻嗪盐，为深绿色青铜光泽结晶或粉末，可溶于水和乙醇，不溶于醚类。亚甲基蓝在空气中较稳定，其水溶液呈碱性，有毒。亚甲基蓝广泛应用于化学指示剂、染料、生物染色剂和药物等方面。化学式：C16H18ClN3S分子量：319.852CAS号：61-73-4EINECS号：200-525-2制备方法1、由N,N-二甲基苯胺进行亚硝化，经还原生成对氨基二甲基苯胺，再用重铬酸钠、硫代硫酸钠进行氧化、硫化及缩合，然后用氯化锌成盐、盐析、过滤及干燥即得成品。2、在工业次甲基蓝（碱性湖蓝BB）10kg中加入100kg纯水，边搅拌边通蒸汽加热至80～90℃，使之溶解。然后用30min时间缓慢加入20%的碳酸钠热溶液7.5kg，继续搅拌10min，静置半小时后，将溶液加热，温度不超过90℃，趁热过滤，在清亮滤液中加入3kg 1∶1的盐酸，搅拌均匀后，冷却结晶，结晶完全后，离心甩干，于40～50℃干燥，即得成品。亚甲基蓝染色剂的基本用途染色可用于制造墨水和色淀及生物、细菌组织的染色等方面。 与ZnCl2制成复盐，可用于棉、麻、蚕丝织物、纸张的染色和竹、木的着色。  还它可与结晶紫和黄糊精以78：13：9的比例拼混成碱性品蓝。医疗亚甲蓝因为有还原性，其注射液被用来治疗正铁血红蛋白血症。也用于抢救硝基苯、亚硝酸盐和氰化物中毒等。对于一氧化碳轻微中毒者可静脉注射亚甲基蓝进行解毒。临床用于治疗磺胺过敏症。因为其杀菌消毒的作用，口服亚甲蓝或用其溶液冲洗可以治疗膀胱炎和尿道炎。另外，亚甲蓝在进入人体30分钟（注射）至几小时（口服）内会从尿中排出，导致尿液暂时呈蓝色，因此也用来作肾功能测定。观赏鱼养殖中，0.1-0.2ppm的亚甲蓝溶液也被用作消毒，或治疗白点病等疾病。分析鉴定在化学实验中，分析纯亚甲基蓝可用作化学试剂中的吸附指示剂，也可用以沉淀高氯酸盐和铼酸盐，催化光度测定硒和钼等。同时，亚甲蓝还具有氧化性，可以氧化一些还原性较强的物质，自身被还原成无色的还原态亚甲蓝（有人称亚甲基白）。在被还原后，还原态的亚甲蓝便具有一定的还原性，可以被一些氧化性物质，如空气中的氧氧化，又生成氧化态的蓝色亚甲蓝。因此亚甲蓝可用于氧化-还原滴定，也可用来示范氧化-还原振荡反应，最典型的是蓝瓶子实验。

为了做实验，细胞铺匀是常见的一种。然而，有许多人不是很成功，分布也不均匀:要么中间密集，周围稀疏，要么周围密集，中间秃顶。以下是利用96孔板把细胞铺匀，希望对大家有用!方法/步骤1、通常，在96孔板的每个孔中加入100微升细胞悬浮液。 从底部附近的井的左侧添加细胞悬浮液。 加入一半平板后，混合细胞悬液，不要再加入，继续加入剩余的一半平板。 添加完所有板后，盖上板，用左手轻轻握住板的左侧，用右手轻轻轻敲板的右边缘，注意抓力(我通常轻敲三次)。 如果它太强或太多次，细胞就会被浓缩和堆积。 顺时针旋转盘子(逆时针效果不好)，依次敲击剩余的三面，静置约5分钟，放入37度培养箱中。对于6孔板、12孔板或24孔板，我在第一个孔中加入少量无血清培养基，摇动并渗透到整个孔的底部，然后用移液管枪将整个孔的底部吸到第二个孔中。用同样的方法渗透到井底，同时模拟其它井，这样整个井底都是湿的，细胞悬浮液将平放在整个井底。 加入细胞悬液时，可以避免中间加入更多细胞，中间加入更少细胞的现象，细胞分散更均匀。 注意，加入细胞悬液后，细胞悬液应放在工作台上静置。这个方法有点慢，但是当你熟练的时候它并不慢。也可以涂抹，但强度不如96孔板，效果不如96孔板，所以我放弃了渗透井底的方法。2、加入细胞悬液后，抬起细胞培养板，从底部向上观察光线，看细胞是否聚集。然后从底部敲击以分散它。3、如果实验室有平板振荡器，建议用这个仪器轻微振荡。 效果好，即振幅小、频率高。4、细胞应该尽可能分散，大多数细胞处于单一状态。离心后，完全悬浮!有转移到六孔板上的，就是震动!摇晃时，不要让细胞液转向，否则细胞会全部被带到中间而不均匀!5、当一瓶细胞装满后，进行正常处理。 将它均匀地吹进培养瓶中，然后铺上6孔板，每孔2ml。 涂抹后，不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放入培养箱中。 稍微向左三圈，向右三圈，先三圈，然后三圈。基本上，24小时后，每个孔中的细胞将非常均匀。6、计算所有所需的液体和细胞数量，混合均匀，并将其添加到六孔板中。 六孔板呈水平8字形波动。 在显微镜下观察。 如果不均匀，按照上述方法再次摇动。如果细胞没有计数并直接种植，在种植六孔板的过程中随时摇动混合瓶。 我通常顺时针或逆时针转动瓶子。7、先上下移动，然后在水平板上左右移动，每个方向移动5-6次，但关键是摇动后直接放入培养箱，不要做太多的运动，如照镜子，否则很容易在中间再次聚在一起。

肥大细胞(Mast cell)是疏松结缔组织内常见的细胞，常成群的沿着小血管和淋巴管分布，也常见于支气管和胰腺的小叶间导管周围，一般细胞较大，直径约为20-30μm，呈圆形或椭圆形，胞核较小、胞质内充满粗大且具有异染性嗜酸性颗粒。甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)中的阳离子有染色作用, 组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类, 帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。肥大细胞颗粒呈紫红色，其他呈蓝色。操作步骤取新鲜组织立即固定于10%中性福尔马林固定液中，常规脱水包埋。切片厚度4-5μm，常规脱蜡至水。系列乙醇各1min，自来水洗2min。入Toluidine Blue O Stain，浸染15～30min。自来水稍洗。TBO分化液分化，直至细胞核和颗粒清晰，可在显微镜下控制。自来水稍洗，滤纸吸干或吹风机吹干水分。95%乙醇1min，无水乙醇2次，每次2min。二甲苯透明，中性树胶封固。染色结果：肥大细胞颗粒 紫蓝色背景 淡蓝色注意事项：针对于胃粘膜组织、软骨组织等较难着色组织的染色，浸染于甲苯胺蓝染色液的时间应相应延长。应注意组织要新鲜，取出后立即固定。甲苯胺蓝染色后不宜采用低浓度乙醇脱水，否则容易导致褪色。分色后应快速入95%乙醇、无水乙醇、二甲苯的时间不宜过久，否则容易导致褪色。

瑞氏染色法：染色方法和注意事项（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。（2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。（3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。（4）瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇（AR级以上）和甘油组成，Ⅱ液为磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）。瑞氏(Wright)染色液的配制方法瑞氏(Wright)染色液瑞氏染料粉末 0．3g甘油 3ml甲醇 97ml将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可。

实验室PCR 产物的电泳及纯化一、目的(1)了解PCR产物电泳与纯化的原理。(2)熟悉和掌握PCR产物电泳与纯化的操作。二、原理在PCR过程中，部分引物和dNTPs在Taq酶等因子的作用下以DNA模板为指导合成新的DNA分子，当然还有一部分的引物和dNTPs没有完成所期望的任务,以小分子的形式存在于PCR产物混合液中,为了后续分子克隆的工作能够顺利进行,PCR产物就需要进行纯化，以去除PCR产物混合液中残留的Taq酶、BSA、Mgt+、引物dNTPs.buffer中的小分子以及非特异性扩增产物。通过电泳将所需要的PCR产物和其他分子分离,经过EB染色后，在紫外灯激发显色下把目标条带从凝胶中切出来，然后通过相应的缓冲液将其溶解，经异丙醇(乙醇)作用使得DNA分子沉淀，再通过在高速离心让沉淀的DNA分子结(indin)在滤膜上，而后用洗脱缓冲eluton ut其从滤膜上洗脱下来就得到了纯化的PCR产物。三、买验材料、器材和试剂1.实验材料有目标条带的PCR扩增产物。2.实验器材①离心机;②2mL离心管;③移液器;④移液枪头;⑤水浴锅;⑥手术刀片;⑦紫外凝胶观察仪;⑧密封盒;⑨防紫外线眼镜;?橡胶手套;①分析天平;2离心管架;③1.5mL离心管;④水平电泳槽;⑤电泳仪;①⑥微波炉;⑦蓝盖试剂瓶;⑧带有层析滤膜的离心管(QIA quickspincolumn)。3.实验试剂①PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN);②异丙醇;③琼脂糖;④6X上样缓冲液(loading-buffer) ;⑤1X TAE电泳缓冲液;⑥溴化乙锭(EB) ;⑦100bp DNA marker;⑧3M NaAc(pH值为5. 0)。四、操作方法(-)琼脂糖凝胶电泳1.制胶准制脑胶模具，称取128脂期，倒人蓝盖试剂瓶中，然后用量简量取50mL 1xTAE电泳缓冲液倒人蓝盖瓶中。盖紧瓶盖，放人微波炉中，中火2~3min,待琼脂糖完全熔化后,取出蓝盖试剂瓶(取时要戴微波炉手套,以免被烫伤)，于室温下放置5~8min,将凝胶液缓缓倒入制胶模具中,插上样品梳，于室温下静置20~ 30min。2.点样将凝固好的琼脂糖凝胶,放人加有电泳缓冲液的水平电泳槽中，取出样品梳。然后加人15pL有目标条带的PCR扩增产物+1.5pL 6X.上样缓冲液(Loading buffer)的比例进行混合后,把混合溶液加人凝胶的样品槽中,在合适的样品槽中加人2μL100bpDNAmarker.3.电泳盖好电泳槽盖后，接通电源，120V电泳1h 20min左右(在凝胶中只有一排样品槽的情况)。4.凝胶染色电泳完毕后,取出凝胶,放人装有溴化乙锭的密封盒中，染色25min。(二)电泳后PCR产物纯化找出电泳结果出现单一目标条带的对应PCR扩增产物进行纯化。具体步骤如下:(1)在2.0mL的离心管壁上写上准备纯化的PCR产物的相关信息,并称重。(2)切下含目标片段的胶块，切得尽可能小一些,把所得的胶块放人2.0mL的离心管中。(3)称量装有胶块的离心管重量，计算出胶块的重量。(4)加入6倍体积的QG buffer到离心管中(100mg胶相当于100pL)。(5)将含有胶块的离心管放人50°C水浴锅中，温育10min,至胶块完全溶解，为促进溶解，每2~ 3min振荡离心管-一次。(6)胶块全部溶解后,检查混合液的颜色是否为黄色(与未溶解之前的QG buffer 的颜色相似,若混合液的颜色为橙色或紫色,加10pL 3M NaAc(pH值为5. 0)。(7)向离心管中加人1倍凝胶体积的异丙醇,混匀。(8)将溶液转移人QIA quick spin column中,13 000rpm离心1min。(9)弃掉液体,加入750μL PE buffer ，静置2~5min,13 000rpm离心.1min.(10)弃掉液体,13000rpm离心1min(空载离心，除去乙醇)。(11)把QIA quick spin column置于一一个洁净的1. 5mL的离心管中。(12)加人30pL的elution buffer置膜中央,13000rpm离心1min。(13)将洗脱所得溶液置于一20°C中储存。所得到的洗脱液可与克隆载体进行连接，然后转化使重组DNA分子进人大肠杆菌细胞内,经过培养获取克隆子。

引物引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量； 引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。Mg2+较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行最适Mg2+浓度测定。退火温度Tm对于设定PCR退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5℃的温度。合理的退火温度为55-70℃。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。巢式PCR使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度。递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势。热启动PCR通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。最常用的是热启动DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。PCR增强剂包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

(1)直接滴定法：凡能满足滴定分析要求的反应都可用标准滴定溶液直接滴定被测物质。例如用NaOH标准滴定溶液可直接滴定HCl、等试样(2)返滴定法：返滴定法（又称回滴法）是在待测试液中准确加入适当过量的标准溶液，待反应完全后，再用另一种标准溶液返滴剩余的第一种标准溶液，从而测定待测组分的含量。这种滴定方式主要用于滴定反应速度较慢或反应物是固体，加入符合计量关系的标准滴定溶液后，反应常常不能立即完成的情况。例如，铝离子与EDTA（一种配位剂）溶液反应速度慢，不能直接滴定，可采用返滴定法(3)置换滴定法：置换滴定法是先加入适当的试剂与待测组分定量反应，生成另一种可滴定的物质，再利用标准溶液滴定反应产物，然后由滴定剂的消耗量，反应生成的物质与待测组分等物质的量的关系计算出待测组分的含量。这种滴定方式主要用于因滴定反应没有定量关系或伴有副反应而无法直接滴定的测定。例如，用重铬酸钾标定硫代硫酸钠溶液的浓度时，就是以一定量的重铬酸钾在酸性溶液中与过量的KI作用，析出相当量的碘，以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠溶液滴定析出的碘，进而求得硫代硫酸钠溶液的浓度。（4）间接滴定法：某些待测组分不能直接与滴定剂反应，但可通过其它的化学反应，间接测定其含量。例如，溶液中钙离子几乎不发生氧化还原的反应，但利用它与草酸根离子作用形成草酸钙沉淀，过滤洗净后，加入硫酸使其溶解，用高锰酸钾标准滴定溶液滴定草酸根离子，就可间接测定钙离子含量。

几种溶解性能良好的化工溶剂,被称为万/能溶剂.二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂,特别是丙希腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂,作聚氨酯合成及抽丝溶剂,作聚酰胺,聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂,以及芳烃,丁二烯抽提溶剂和合成氯氟/苯胺的溶剂等.四氢/呋喃具有低毒、低沸点、流动性好等特点,是一种重要的有机合成原料和优良的溶剂,具有广泛的用途,四氢/呋喃对许多有机物有良好的溶解性,它能溶解除聚乙/烯,聚丙烯及氟树脂以外的所有有机化合物,特别是对聚氯乙/烯,聚偏氯乙/烯,和叮苯胺有良好的溶解作用,有万/能溶剂之称.1、二甲基亚砜 　　除此之外,在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体.二甲基亚砜本身有消炎止痛,利尿,镇静等作用,亦誉为万灵药,常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中.2、四氢/呋喃 　　四氢/呋喃为常用有机溶剂,有万/能溶剂之称. 　　四氢/呋喃已普遍用于表面涂料,保护性涂料,油墨,萃取剂和人造革的表面处理,四氢/呋喃是生产聚四亚甲基醚二（PTMEG）重要原料,也是制药行业的主要溶剂.3、乙酸/异丙酯 　　乙酸/异丙酯可以与醇、酮、醚等多数溶剂混溶,有万/能溶剂之称,对多种合成树脂及天然树脂有优良的溶解能力。4、二甲基甲酰胺 英文缩写：DMF二甲基甲酰胺(DMF)作为重要的化工原料以及性能优良的溶剂,主要应用于聚氨酯、腈纶、医药、农药、染料、电子等行业.在聚氨酯行业中作为洗涤固化剂,主要用于湿法合成革生产；在医药行业中作为合成药物中间体,广泛用于制取强力霉素、可的松、磺胺类药品的生产；在腈纶行业中作为溶剂,主要用于腈纶的干法纺丝生产；在农药行业中用于合成高效低毒农药杀虫剂；在染料行业作为染料溶剂；在电子行业作为镀锡零部件的淬火及电路板的清洗等；其它行业包括危险气体的载体、药品结晶用溶剂、粘合剂等.　　能与水、醇、醚、酯、酮、不饱和烃、芳香烃等混溶。

一、简介薄层层析法以吸附层析使用最为普遍。常用的吸附剂为硅胶、氧化铝等。薄层层析和其他层析法一样，除吸附法外，也可进行分配、离子交换、分子排阻等机理的层析，即将铺制薄层的材料相应换为涂以固定相的载体、离子交换剂、凝胶等，其操作与吸附法基本相同。二、过程制板铺制薄层板时，要求基底板洁净平整，可用干法或湿法铺制。现常用湿法制板，即将吸附剂和粘合剂（如烧石膏）按一定比例混合，加入适量水调匀，用涂布器将此匀浆缓慢地移过基底板，放置晾干，再经适当烘烤活化后即可使用。如不加粘合剂和水，直接将吸附剂均匀地铺成薄层，则为干法制板。现在市场上已有各种制好的薄层板出售，统称预制板。展开有多种方式，以上行法最为常用。将薄层板垂直或倾斜放置，将展开溶剂加于低部，使之自下向上移动。下行法则为用滤纸将溶剂引至薄层上端，使其自上向下流动。平行展开时，将板平放，溶剂被吸上至薄层板点有样品的一端,进行展开。使用圆形薄层板时,将样品点在圆心附近，使溶剂自圆心向圆周方向移动，称为环形展开或径向展开；将样品点在圆周位置，使溶剂自圆周向圆心移动的为向心展开，适用于f值大的组分的分离。将点样品处附近的吸附剂刮去，使溶剂只能通过样品点附近的较窄部分前进展开，因而溶剂前缘呈弧形的展开方式，也称径向展开，这种方式对较难分离的组分可能效果好些。展开一次后取出薄层板使溶剂挥发，再用同一溶剂或换用其他溶剂再次沿此方向展开的称多次展开。将样品点在方形薄层板的一角，先沿着一个方向展开，然后将板转动90°，再沿着另一方向展开的为双向展开。多次展开和双向展开都可加强分离效果。

药物鉴别的目的和特点1、药物鉴别的目的鉴别定义:就是依据药物的组成、结构与性质通过化学反应、仪器分析或测定物理常数,来判断药物的真伪。鉴别试验仅使用于鉴别药品的真伪对于原料药还应结合外观和物理常数进行确认2、特点A、为已知物的确证试验——供试品为已知物,鉴别的目的是确证供试品的真伪B、鉴别试验为个别分析,非系统分析——一般只作一、二或三、四项试验C、通常采用不同方法鉴别,综合分析D、鉴别制剂,要注意辅料干扰,鉴别复方制剂,注意各成分干扰药物鉴别的常用方法药物鉴别采用的方法应是专属性强、重现性好、灵敏度高并且操作简便、快速。常用的鉴别方法有化学法、光谱法和色谱法。

1.对照法系指取一定量待检杂质的对照液与一定量供试液,在相同条件下处理后,比较反应结果,从而判断供试品中所含杂质是否超过限量。使用本法检查药物的杂质,须遵循平行原则。该法通常不需要准确测定杂质的含量,而是判断药物所含杂质是否符合限量规定,中国药典主要采用本法检查药物的杂质。2.灵敏度法系指在供试品溶液中加入试剂,在一定反应条件下,观察有无阳性反应出现,以不出现阳性反应为合格,即以检测条件下的灵敏度来控制杂质限量。本法的特点是不需要对照物质。如纯化水中的氯化物检查,是在50ml纯化水中加入硝酸5滴及硝酸银试液1ml,不发生混浊为合格。由于50ml水中含有0.mgCl-时,所显混浊已较明显。所以氯化物的限量就是以在测定条件下不产生氯化银的混浊为限。3.比较法系指取供试品一定量依法检查,测得待检杂质的吸收度或旋光度等与规定的限量比较,不得更大。本法的特点是不需要对照物质。如维生素B2中感光黄素的检查:取本品25mg,加无水乙醇三氯甲烷10ml,振摇5min,滤过,滤液照紫外-可见分光光度法,在440nm波长处测定,吸光度不得过0.016。

杂质分析的基本思路和步骤如下:1)产生来源分析起始物料和原料中可能存在的杂质分析,包括异构体杂质。因为起始物料和原料中的杂质与原料结构类似,来源一致、可能共同参与反应,最后残留在目标产物中。这部分的分析,可以从起始物料和原料的生产过程(来源于供应商的信息)、起始物料的原料的理化性质、文献报道方面进行了解与分析。反应副产物分析。包括主原料潜在的副反应、原料中的杂质参与反应的副产物等。这部分的分析,可以从化学反应原理和相关文献报道进行了解与分析。降解产物分析。包括原料、中间体和产物、溶剂(回收溶剂)在工艺条件下可降解产物。这部分,可以从化学反应原理、稳定性研究结果(尤其是影响因素实验)、相关文献报道等方面进行分析。其它副产物分析。其它物料和有机溶剂、试剂(回收物料、回收溶剂)之间,有没有可能产生作用生成杂质。这部分,常常是一些基因毒性杂质产生的来源。可以通过化学原理、化学性质和相关文献报道进行分析。2)药典文献分析分析各国药典中收录的杂质,以及文献报道中该化学原料药中可能存在的杂质。与1)中的分析相结合,分析杂质是否可能存在。3)工艺去除分析在1)和2)的基础上,结合工艺过程的设计(研发阶段)和实施(注册和验证阶段),分析可能存在的杂质在工艺中的去除方法(步骤、参数控制)和去除能力。4)对照制剂杂质谱对于仿制药,用原研参比制剂进行有关物质研究,分析杂质谱。5)确定杂质谱在1)-4)的基础上,制定药品的杂质谱,列出所有可能的杂质及来源、结构、预估水平。6)杂质研究对5)确定的杂质谱进行分析和研究,建立分析方法,判定各杂质的消除途径和控制水平、要求的控制限度。7)控制策略在6)的基础上,建立杂质限度(质量标准),并确定杂质控制策略(物料控制、工艺控制、分析方法)。

做细胞生物学实验，细胞铺板大概是我们最常见的一个实验。但有时候铺得不是很均匀：下面为大家分享几点经验。1、尽量消化细胞分散成单细胞悬液。对于易于消化的细胞，我一般DPBS清洗一遍，加0.5ml胰酶润洗一遍（25cm2培养瓶或6孔板），弃掉胰酶，37度消化2-3分钟或室温消化5min左右，镜下观察是否细胞消化较为分散。2、96孔板一般以100 微升每孔接种，直接用100 微升移液器吸取细胞悬液，沿孔壁（稍离开一点孔底即可，不要离底太高）直接接入，移液器不需完全打到最大，轻轻按下即可，每铺完一行换一次枪头同时轻轻混匀细胞悬液。都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。3、6孔板、12孔板或24孔板，可采用将每个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔依此类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好。4、培养瓶里面加好细胞以后(比如传代好/分好细胞以后)，先顺时针摇晃3次，马上逆时针摇晃3次。然后延X轴Y轴分别水平摇动3次。放入CO2培养箱后,平放着培养瓶重复延X轴Y轴分别水平摇动3次。

血清，在实验中经常用到，而且在实验中用到的还是比较广的，而且血清的实验作用还是可圈可点的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的，那么除此之外血清还有其它作用吗？今天就跟远慕生物一起来看看血清的具体实验作用：①有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。②是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。③提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。④起酸碱度缓冲液作用。⑤提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。⑥提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。血清性状、外观：浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。血清指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。

一、细菌污染状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。预防和补救：1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。3.若细胞一旦污染，建议加支原体清除剂，能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。二、霉菌及真菌污染状态：肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。预防和补救：1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。2.控制外来人员进出实验室。3.对实验室及培养箱进行彻底消毒。4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，丢弃，重复此操作数次。三、支原体感染状态：镜下黑色，多为多形，培养液一般会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死亡。预防和补救：预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加预防支原体的抗生素。补救：向培养基中添加抗生素，（如氧氟沙星10 μg/ml、环丙沙星10 μg/ml、卡那霉素20~50 μg/ml、四环素10~50 μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素），或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。四、黑蛟虫状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。预防和补救：一般黑胶虫不会影响细胞的生长状态，可以尝试改变培养基的品牌。血清冻融采取逐级冻融的方法。五、原虫感染状态：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可用生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生，但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。除以上污染源外，配液消毒问题、操作问题也是污染原因之一。关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作及细胞培养箱环境的问题。

01、复苏细胞复苏的原则： 快速融化必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。实验前准备将水浴锅提前预热至37℃。细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。取出冻存管根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。迅速解冻迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。平衡离心用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3分钟。制备细胞悬液吸弃上清液。向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。细胞计数细胞浓度以5×10 5 /ml为宜。培养细胞将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO 2 的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。记录复苏日期结果分析判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。×× 初学者易犯错误 ××水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。02、传代1.传代密度过高一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）。解决方案尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。2.传代密度过低哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到 80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。解决方案细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。如何确定细胞的正确初始接种密度?美国细胞库（ATCC）建议各类不同细胞株接种密度：细胞类型 接种密度常见肿瘤细胞株 2-4 x 10 6 viable cells/25cm 2成纤维细胞株 2-4 x 106 viable cells/25 cm2淋巴细胞/悬浮细胞 3-4 x 10 5 viable cells/ml杂交瘤 2 x 105 viable cells/ml成肌细胞 1-2 x 10 4 viable cells/ cm2 03、冻 存细胞冻存的基本原理： 慢冻手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。大家可以根据自身情况或者实验条件选择不同的冻存方式。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，可以长期保存。因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。这时，低温保护剂就发挥出它的作用了。低温保护剂可保护细胞不受细胞内冰冻影响，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等渗透型低温保护剂。它们的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但它们也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，血清是用来降低细胞毒性的，但血清也不是完美的。

　　实验概要　　本实验从乙醇浸泡的鱼苗中提取DNA，并利用直接PCR进行了鉴定。　　实验原理　　在实际的研究工作中，野外取样的地点一旦较为偏远，受条件的限制，很难保证得到的样品活体或能够快速冷冻；另外，对一些稀有物种和濒危种，鲜活样品的采集十分困难，一般为了解决这些问题，常采用乙醇和甲醛固定的方法来处理样品，再对样品DNA 进行提取以及扩增。使用乙醇固定样品具有硬化，固定，脱水作用，对组织渗透迅速，特别适合组织中核酸的保存，相比于甲醛等其它固定方法，此法更简单，保存时间更长质量更好，也更加清洁无害。乙醇固定样品主要应用于水产种质资源鉴定，医院或兽医病理样品保存，法医样品保存等方面，在特定物种基因保护，生物多样性，动物分子标记，司法鉴定等方面有广泛的应用。　　Omega Bio-Tek 相应试剂盒既能够快速有效的抽提得到乙醇保存多年的样品基因组DNA，又可以利用直接PCR 系统，快速的对乙醇保存样品进行PCR 鉴定，为您的研究提供最有力的工具。　　实验材料　　乙醇浸泡的鱼苗　　实验步骤　　1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit　　1) 分别取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中，混合均匀。对于有较多样品需要操作的，可以先将AT1 和AT2 用量计算好，混合均匀后再分装到每一管中。　　2) 取鱼苗一条，在AT4 中浸泡约5-10min，滤纸吸干水份。　　3) 将鱼苗浸没在上一步准备的AT1 中56℃水浴或者PCR 仪上消化10-20min，中间可以涡旋混匀一次。　　4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 仪上5min，稍微冷却后加入50ul AT3 涡旋混匀。　　5) 以上裂解液就可以作为PCR 的模板直接使用，PCR 体系中建议加入5ul 左右。　　6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一条鱼苗的DNA 作为模板，客户提供的引物Y-30-R/F 作为引物，PCR 扩增。　　7) PCR 扩增程序：　　94℃ 2min；　　94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles；　　72℃ 5min；　　25℃ forever。　　2. E.Z.N.A.? MicroElute? Genomic DNA Kit　　1) 称量10mg 组织，加入200ul Buffer TL；　　2) 加20ul OB，55℃孵化至完全降解；　　3) 13,000xg 离心2min，转移上清至新管；　　4) 加220ul Buffer BL 涡旋混匀，70℃孵化10min；　　5) 加220ul 无水乙醇，最大速度涡旋15s；　　6) 将混合液过柱吸附，13,000xg 离心30-60s，弃滤液；　　7) 加500ul Buffer HB，离心；　　8) 700ul DNAWash Buffer（加乙醇）；　　9) 13,000xg 离心2min，干燥柱子；　　10) 加25ul 70℃预热的Elution Buffer 洗脱。

实验材料： Taq DNA多聚酶引物 阳性对照 DNA脱氧核苷三磷酸 混合物三磷酸 琼脂糖1.3%TAE胶试剂、试剂盒： 磷酸缓冲盐溶液液 Tris醋酸 EDTA6×加样缓冲液 引物储备液仪器、耗材： DNA抽提和纯化系统基质的DNA抽提试剂盒 热循环仪实验步骤一、DNA 标本的收集和制备1. 需要检测支原体污染的细胞系，在收集样品前数天或至少在解冻后两周内，不能加任何抗生素。应保证支原体在培养上清中的效价在 PCR 测定范围之内。2. 收集 1 ml 贴壁细胞或悬浮细胞的培养上清液。这样收集的标本包含活的或死的细胞，其优点是一些支原体会明显地黏附在真核细胞上，甚至侵入细胞中。上清液可贮存在4°C 数天或 -20°C 数周。在样品溶化后，应立即操作。3. 上清液在 13000 g 离心 5 min，将沉淀用 1 ml D-PBSA （D-PBSA （磷酸缓冲盐溶液液）：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.2；121℃，20 min 高压灭菌）重悬浮，涡旋混匀。4. 再次离心悬浮液，用 D-PBSA 冲洗一次以上，如步骤3。5. 离心后的沉淀用 100 μl D-PBSA 重新悬浮，涡旋混匀，然后加热至90°C，15 min。6. 在分解细胞后，采用标准酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法或其他 DNA 抽提方法立即抽提 DNA 。二、PCR 反应建立规则以避免 DNA 加入过多，严格按照以下步骤进行：①DNA 抽提的地方和 PCR 进行的地方及 PCR 之后走胶的地方应分开；②所有试剂应以最小量分装以保证能恒定提供无污染的试剂；③避免重复扩增（reamplification）；④贮存只用于 PCR 操作的吸量管、吸头、试管，经常用紫外线照射；⑤连续进行 PCR 操作，应严格按以下步骤进行；⑥在样品制备及 PCR 进行的全过程，应戴手套操作；⑦应包括相应的对照反应，内对照、阳性对照、阴性对照及水溶液对照。1. 用以下溶液对每个样品进行二次测定仅用于样品：1 μl NTPs，1 μl Myco-5'，1 μl Myco-3'，1.5 μl 10× PCR 缓冲液，9.5 μl 蒸馏水。用于样品和内对照 DNA：1 μl NTPs，1 μl Myco-5'，1 μl Myco-3'，1.5 μl 10× PCR 缓冲液，8.5 μl 蒸馏水，1 μl 内对照 DNA，事先混合后贮存多份样品，三个样品用于无内对照反应（包括阳性、阴性及水溶液反应），两个样品用于有内对照反应，包括阳性、阴性对照，总体积要富余一些以弥补吸取过程的损失。2. 将 14 μl 已混合好各种贮备液加入到 0.2 ml PCR 反应管，加入 1 μl 蒸馏水用作水对照反应。3. 制备多聚酶混合液（每个反应 10 μl，再加额外 10 μl，以保证吸取足够量）。每个反应中含有 1 份 PCR 缓冲液和 1 单位 Taq 多聚酶。4. 移去所有用于制备事先混合贮备液的试剂。5. 取出欲测试 DNA 样品和阳性对照 DNA ，不要同时处理试剂和样品。6. 加 1 μl DNA 制备液至一个不包含内对照 DNA 反应管内，另加 1 μl DNA 制备液至一个包含内对照 DNA 反应管内。7. 进行热启动 PCR，将反应混合物（未加多聚酶）转移至加热反应器中，依照下面步骤进行一个加热周期；第一步：95°C，7 min；第二步：72°C，3 min；第三步：65°C，2 min；第四步：72°C，5 min 。在第二步时，打开加热器盖子，加入 10 μl 多聚酶混合液至每个管内，如有许多样品则操作时间可能延长。打开或关闭反应管应分开进行，以避免样品的挥发。在继续进行下个周期步骤前，在加入 Taq 多聚酶至最后一个反应管和关闭加热器盖前至少应有 30 s 以平衡温度以及移去盖上冷凝物。8. 在开始笫一个周期后，按照以下参数进行 32 个加热周期：笫一步：95°C，4 s；笫二步：65°C，8S；笫三步：72°C，16s；每个周期再另外延 1 s 。9. 72°C，10 min 完成最后的扩增步骤，结束反应，然后将样品冷却至室温。10. 制备一个含有 0.3 μl 溴化乙啶 /ml 的 1.3% 琼脂糖-TAE 胶，胶上用 1×TAE （50× TAE（Tris 醋酸 EDTA）： 2 mol/L Tris 基液，5.71% 冰醋酸（V / V），100 mmol/L EDTA，调节 pH 至 8. 5）覆盖，每孔加入 12 μl 扩增产物（10 μl 反应混合物，2 μl 6× 加样缓冲液（6× 加样缓冲液：0.09% （W / V），溴酚蓝，0.09% （W / V）二甲苯蓝FF，60 % 甘油（V / V )，60 mmol/L EDTA）），10 V/cm 开始电泳。11. 紫外线扫描显示特异产物，记录扩增结果。

　　植物组织培养技术的优点：　　1、占用空间小，不受地区、季节限制；　　2、培养脱毒作物；　　3、培养周期短；　　4、可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品；　　5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物；　　6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽；　　7、解决有些植物产种子少或无的难题；　　8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征；　　9、投资少，经济效益高；　　10、繁殖方式多，试用品种多。

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。　　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T)　　复性温度=Tm值-(5～10℃）　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

紫外可见分光光度计是常用的分析仪器，因使用广泛且频率较高，所以经常会出现故障。了解紫外可见分光光度计的常见问题与处理方法有利于及时解决故障，以保证实验顺利进行。1. 读数向增大或减小，单方向不停地漂移-预热时间不够：预热时间至少30分钟。-仪器受环境因素影响，机内受潮：延长预热时间并降低环境湿度。2. 不能调0.000A或不稳-样品室内有挡光物体：去掉挡光物体 若样品架挡光，则调整样品架位置。-用来校零的空白溶液与空气的吸光度之差超过 0.4Abs：更换低浓度的空白溶液。-前置放大板坏：修理前置放大板。-轮胎镜老化：更换轮胎镜。-滤色片组件的定位出现偏移：调整滤色片光电开关位置。-光源灯老化：更换新的光源灯。-注意：在开始自检时，要求滤色片组件的空挡处于狭缝前方的对称位置。3. 测量数据不准-比色皿污染：洗液浸泡后擦净比色皿内外透光面。-比色皿配对值差：校准配对比色皿，或更换新比色皿。-因为时间或者温度的原因，溶液样品 本身的波动：严格按照样品测试规程进行。-试样误差大：重新配置试样。-仪器本身不稳定：修复仪器。4.读数跳动不稳定-环仪器受环境因素影响，仪器受潮：延长预热时间并降低环境湿度。-电源线接地不良：使电源线安全接地。-供电电源不稳定：使用交流稳压电源。-高温环境、仪器附近有阳光直射、非预期的震动：改善环境以适应仪器正常使用。-在紫外波段使用玻璃比色皿：使用正确的比色皿。-样品的挥发性太大：使用比色皿盖。-光源灯老化：更换光源灯。-前置放大板损坏：修理或者更换。-光路被非预期移动：重新调试光路。

紫外可见分光光度法自测题1. 什么是分光光度中的吸收曲线？制作吸收曲线的目的是什么？2. 什么是分光光度中的校准曲线？ 为什么一般不以透光度对浓度来制作校准曲线？3. 试比较通常的分光光度法与双波长分光光度法的差别，并说明其理由。4. 影响显色反应的条件有那些？怎样选择适宜的显色条件？5. 浓度为1.02×10-4 mol/L的酸碱指示剂HIn（Ka=1.42×10-5）水溶液，取2份，分别用等容的0.2 mol/L NaOH与HCl 0.2 mol/L稀释后，用1.0cm吸收池在430nm处测得吸光度为1.51(碱性液)，与0.032(酸性液)。计算此指示剂的纯水溶液浓度分别为2×10-5 、4×10-5 、12×10-5mol/L时在430nm处的吸光度。                                                 6．已知：Zn2+ 与螯合剂Q2-生成的配阴离子ZnQ22-在480nm有最大吸收。当螯合剂的浓度超过阳离子20倍以上时，可以认为Zn2+全部生成ZnQ22-。Zn2+或Q2-对480nm的光都不吸收。现有含Zn2+2.30×10-4mol/L与含Q2- 9.60×10-3 mol/L的溶液，用1.00cm 吸收池于 480nm处测得吸光度为0.690。同样条件下，只把螯合剂浓度改变为5.00×10-4mol/L，测得的吸光度为0.540。计算ZnQ22-的稳定常数。7．某指示剂HIn的离解常数是5.4×10-7，HIn  的λmax是 485nm，In-的λmax=625nm，今制成 5.4×10-4 mol/L 溶液用 1.00cm 的吸收池在酸性与碱性下测得吸光度如下：                       吸光度（A）                         主     要  pH                                   485nm              625nm                  存在形式1.00          0.454               0.176                        HIn13.00        0.052               0.823                         In-问:(a)指示剂浓度不变而H+浓度为5.4×10-7mol/L时,在485nm与625nm处的吸光度将是多少? (b) 指示剂浓度不变,改变溶液的pH值,在625nm处的吸光度是0.298,求溶液的H+浓度。