以MS培养基为例,其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类。1 大量元素和微量元素母液的配制按规定用量,称取所需的各种药品,在配制时为减少工作量,可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中。但由于各种药品的混合,可能发生反应,生成沉淀物,以致母液失效。为避免类似现象发生,在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时,可采用如下2种做法加以解决：①将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物,按先后顺序溶解药品,待前一种药品完全溶解后再加入后一种化学药品,以此类推；②使每种成份分别完全溶解,再把它们彼此混合。2 铁盐母液的配制铁盐的成份含硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）。这两种化合物的溶解和混合较为严格,必须按如下方法配制,否则将会产生沉淀。该方法是：分别溶解FeSO4·7H2O和 Na2-EDTA,加热并不断搅拌,使之完全溶解,冷却,将2种溶液混合,调PH至5.5,用蒸溜水加至所需容积,棕色瓶保存于冰箱之中。3 植物生长调节物质母液的配制植物生长调节物质是培养基的重要组分之一,一般是植物激素类物质,如生长素类的IAA、IBA、NAA,赤霉素类的GA3,细胞分裂素类的2,4-D、KT和6-BA等。由于大多数生长调节物质难溶于水,因此配制方法也各不相同：①IAA,IBA和GA3先用少量95%酒精溶解,再加水定容,摇匀后贮于试剂瓶中、贴上标签后,存放在冰箱中；②NAA可用热水或少量95%酒精溶解,再加水定容至所需容积；③2,4-D可溶于少许1mol/L的NaOH溶液中,然后加水定容；④KT和6-BA可用少量1mol/L的HCl溶解,再加水定容；⑤玉米素先溶于少量95%酒精中,然后加水定容。植物生长调节物质浓度通常用ppm（mg/ml）和mol/L表示,在配制母液时,常以ppm较为方便,一般配制成0.5ppm的母液,这个浓度既便于计算,也可避免冷藏时形成结晶。4 有机附加物母液的配制在植物组织培养时,培养基中往往要加入一些有机附加物,如椰子汁,以促进组织培养活性。由于椰子汁的活性成分是耐热的,在配制时,要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质,过滤,然后置塑料瓶中贮存于的-20℃的低温冰箱内。

分子诊断是以核酸作为检测对象，主要应用于临床各科的诊断中，如肿瘤、感染、遗传等各方面，而核酸提取是分子诊断实验的“第一步”。近年来，磁珠已成为核酸提取过程中最常用的工具之一。磁珠的概念和分类根据不同的表面处理与标记，可将磁珠分成各种不同的应用类型：TiO2磷酸化多肽富集磁珠磁珠表面覆盖有一层TiO2材料，可以选择性的与磷酸化的氨基酸残基：丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)结合，而与酸性的氨基酸残基的非特异性结合最小。与传统的IMAC技术相比，其灵敏度提高了1000倍，富集后磷酸化蛋白的质谱检出限达100 fmol。谷胱甘肽(GSH)磁珠该磁珠表面包被有琼脂糖，并偶联有谷胱甘肽，可以特异性的与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)结合，因而可用于纯化带有GST标签的重组蛋白。TALON"磁珠。TALON磁珠的原理是基于采用Co离子的固定化金属离子亲和技术(IMAC)，可用于纯化带有组氨酸标签(6xHis)的重组蛋白。Protein A和Protein G磁珠带有Protein A或Protein G基团的磁珠，可广泛应用于IgG的纯化、免疫沉淀(IP)和免疫共沉淀(Co-IP)等。硅质膜磁珠这是一类最早出现的产品，广泛应用于DNA、RNA的纯化。其原理类似于使用硅质膜的离心柱，磁珠在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境下被洗脱，可用于全血、组织、细菌、病毒、植物等的核酸纯化。反相RPC磁珠类似于反向层析的原理，可用于多肽的分离纯化。Jimenez等使用KingFisher96和Dynabead? RPC 18磁珠仅需20min就可以平行处理96个样品，用于与疾病相关的血清中肽段表达谱的研究。ChargeSwitch磁珠ChargeSwitch磁珠的原理类似于离子交换技术，磁珠在pH & 6.5的缓冲液中带正电，可与带负电的核酸结合；在pH核酸提取新兴力量——磁珠法自沃森、克里克的DNA双螺旋模型诞生，生物学进入到了一个全新的时代，在生物学界言必DNA，论必中心法则，对DNA的提取成为生物医药领域甚至农林牧渔等领域内所有学科科学研究的基础，随着基因诊断、转基因食品检测、个性化医疗等的快速发展，现在的核酸提取技术已经不能够满足当今生物技术的需要，急需能够高通量、自动化的核酸提取方法。在这种背景下，磁珠法核酸提取应运而生。核酸提取法的原理核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。细胞或组织在裂解液作用下，其中的DNA/RNA被释放出来。此时经过表面修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠即与核酸进行“特异性结合”，形成“核酸-磁珠复合物”。然后在外加磁场的作用下，复合物即分离出来。最后经过洗脱液洗去非特异性吸附的杂志、去盐、纯化后，即得到欲提取的核酸物质。磁珠法核酸提取的优势随着基因检测、个性化给药、产前诊断等的普及，在生物行业各领域都追求高通量、自动化的今天，传统DNA提取方法的局限愈来愈明显，而磁珠法DNA提取的优势则愈来愈明显：能够实现自动化、大批量操作；操作简单、用时短；不使用传统方法中的苯、@@@@@@@@@@@@@@@@@22等有毒试剂，安全无毒完全符合现代环保理念；与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。磁珠法提取DNA试剂盒要比传统的方法（Chelex100 法、有机法、二氧化硅法、盐析法等）更为简单、方便，转移离心管的次数较少，不易污染等。远慕生物可为您提供健全的全自动核酸提取实验方案！

核酸分为两大类：一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DNA）。核酸的分子量极大，从数万到亿万。核酸是两性化合物，在一定的等电点溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中 的溶解度有显著区别，在一定浓度范围的氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度的增加而逐渐下降，当氯化钠浓度为0.14mol/L时，其溶解度仅为水中溶解度的1/100，但当氯化钠浓度在增加时，脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化钠浓度增加到0.5mol/L时，其溶解度与水中溶解度相似，当氯化钠浓度增加到1mol/L时，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化钠溶液提取核糖核蛋白。而提取脱氧核糖核蛋白时，则用1mol/L氯化钠溶液。两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关，当pH值为4.2时，脱氧糖核蛋白的溶解度zui低，而pH值为2.0~2.5时，核糖核蛋白的溶解度z最di。所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。RNA的提取RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化钠溶液将组织做均浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的细胞核物质，然后用10%醋酸调至pH值为4.2时，产生沉淀，离心，弃去上清液，先用0.5mol/L氯化钠溶液，后用水洗涤沉淀，将核糖核蛋白溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中，离心在取上清液，调节pH值为4.2的沉淀，沉淀用0.5mol/L氯化钠溶液洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氢钠水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来。DNA的提取DNA主要存在于细胞核中，天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在的。从人体细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖核蛋白，再将蛋白质除去，从中分离DNA。常用的方法是以1mol/L氯化钠溶液抽提，得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊酸的氯仿一起振荡，除去蛋白质；或者在组织细胞破碎后以低浓度0.14mol/L氯化钠溶液（也可用0.1mol/L氯化钠加0.05mol/L柠檬酸代替）反复洗涤除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化钠抽提脱氧核糖核蛋白，提取是用氯仿-戊酸抽提法除去蛋白质。两种方法比较，后一种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA时，加入适量去污剂更有助于蛋白质与DNA的分离。

一. 目的学习用浓盐法从酵母中提取RNA掌握用等电点法沉淀RNA观察核酸的颜色反应，了解核酸定性与定量测定的原理熟练掌握普通离心机的使用方法二. 原理酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。将RNA从细胞中释放出来在工业上主要有三种方法—稀碱法、浓盐法和自溶法。本实验采用浓盐法，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中。同时，90～100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在30～70°C时这两种酯酶的作用活跃，提取时应避免在此温度范围内停留时间过长。由于核膜内的DNA分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，所以采用离心技术，可使RNA 溶液与菌体残渣以及DNA分离。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH至2.0～2.5，RNA以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。最后用乙醇洗涤沉淀，溶解和去除脂溶性杂质和色素以及盐分杂质。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗涤还可以使RNA沉淀物脱水，变得疏松，便于干燥，提高了RNA产品的纯度。DNA和RNA的鉴别，较常用的方法是利用两类核酸中不同的戊糖各自具备的不同的颜色反应，而得以定性鉴别。其中鉴定DNA的方法称为2苯/胺法，鉴定RNA的方法称为地衣酚（苔黑酚，3,5-二羟甲/苯）法。具体反应式如下：三. 实验材料及设备1. 材料干酵母2. 仪器离心机电子天平 沸水浴烘箱 抽滤装置 冰浴3. 器材普通试管： 20mL×4（干燥）锥 形 瓶： 100mL×1量 筒： 50mL×1移 液 管： 1mL×2烧 杯： 250mL×1 100mL×1 50mL×1离 心 管： 100mL×1温 度 计： 50℃×1表 面 皿： f9cm滴 管： 2洗 耳 球： 2加 样 器pH试纸： pH0.5～5.0滤 纸： f7cm洗瓶、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四. 试剂的配制1. NaCl溶液（C.P.）（10%）2. HCl溶液（6N）取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。3. 乙醇（C.P.）（95%）4. 苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）将200mg苔黑酚溶于 100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。（低温贮藏一周）5. 2苯/胺试剂将1g2苯/胺溶于98mL冰醋/酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。（临用时配制，用前可加几滴乙/醛。）五. 操作步骤1. 取材在天平上准确称取干酵母3.00g，转移至100mL锥形瓶中。2. 浓盐浸提取 27mL 10%NaCl溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分钟；冷却。3. 离心将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mL H2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心 15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。4. 沉淀RNA(1) 冷却：将50mL烧杯置于放有冰块的250mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10°C以下时，取出温度计。(2) 调pI：缓慢滴加 6NHCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.0～2.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量最多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。（注意：①严格控制pH；②若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。）5. 离心将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。6. 洗涤与抽滤(1) 洗涤：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡5分钟。(2) 抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。7. 干燥用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80°C烘箱内干燥。8. 称重取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。9. 颜色反应(1) 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。颜色反应：取4支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作六. 结果处理 1. 写出核酸产品的颜色和外形。 2. 计算RNA的粗产品的得率。 3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。

EM菌种培育菌液的方法挺简单的，就是加水加红糖密封发酵就可以了 下面远慕生物为您详细做下培育方法介绍EM活性液制作方法：[原料准备]①至少可以容纳10公斤水的容器（最好是可以密封的朔料桶）.②红糖0.5公斤.③10公斤无菌干净的水(深井水、凉开水、或者放置24小时的自来水).④益富源发酵床专用菌种1瓶步骤1、先把塑料桶装入7～8公斤无菌干净的水。步骤2、把剩余的2～3公斤水烧开把0.5公斤红糖完全融化，溶化后倒进步骤1中的塑料桶内。步骤3、将益富源发酵床专用菌种倒入塑料桶中，搅拌菌液，密封起来。步骤4、温度控制在30--40度之间发酵4天左右。如果温度在20--30度之间，发酵时间为7天。步骤5、购买ph试纸5天后打开容器【测试PH值，PH值在3.5-6】范围内，即发酵成功。如果没有ph试纸，可以倒些发酵原液口尝，有酸香味即表明发酵成功。一般发酵7天后使用效果更好。注意：融化红糖的水，可以根据条件自由配比，总重量为10公斤即可。

稳定细胞系是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中，使外源基因能够在宿主细胞中长期稳定表达，这样的细胞系称为稳定细胞系。其原理是将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上，通过转染宿主细胞，外源基因整合到宿主染色体上，用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞。在试验过程中，常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)等。通过筛选可得到符合实验要求的稳定高表达目的蛋白细胞株或者稳定沉默目的基因的细胞株。其建立的原理是，将我们所要的目的基因真核到宿主细胞上，随着细胞的生长繁殖，目的基因可以稳定的表达，在通过抗生素的不断加压筛选，得到构建稳定细胞系的过程。相对于瞬时转染，稳定转染技术持续周期长，细胞整合稳定，能够满足后期对蛋白的大量需求。以下情况需要使用稳定细胞系：1、实验周期长，要求外源DNA在分裂细胞中长期表达，>2周。2、需要构建诱导表达系统。当目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性，或者会引起细胞毒性等不利影响。3、基因敲除/插入等修饰宿主细胞基因组的实验。4、筛选拷贝数适宜的细胞。5、对于某些很难转染的细胞种类。即使病毒载体也无法实现高效率转导。6、通过构建稳定细胞株实现更好的基因干扰效果。7、后续实验中需要将转染细胞注射进入动物体内。8、需要构建单克隆细胞株可以去除个体差异。

要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃条件下维持15-30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在0.56kg/ cm2，112.6℃15-30分钟进行灭菌，某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀，常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变(一般使pH降低)，可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。在配制培养基过程中，泡沫的存在对灭菌处理极不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使泡沫中微生物难以被杀死。因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭菌温度。培养基的灭菌方法1、高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。培养基在爱制备过程中混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌工作。灭菌时一般是在0.105MPa压力下，温度121℃时，灭菌15~30min即可。消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范围，否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解，失去营养作用，也会使培养基变质、变色，甚至难以凝固。将蒸馏水或自来水装在三角瓶中，装水量一般不超过瓶的2/3，用牛皮纸或硫酸纸包扎封口，然后放入高压锅中灭菌后即为无菌水。 灭菌后的培养基可放到培养室中预培养3d，若无污染现象，则证明灭菌是彻底的，可以使用。暂时不用的培养基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培养基应在1周内用完，其他培养基最多也不要超过1个月。2、过滤灭菌：一些植物生长调节剂及有机物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇热容易分解，不能与培养基一起进行高温灭菌，而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌。细菌过滤器与滤膜（孔径0.45微米）使用之前要先进行高压灭菌。过滤后的溶液要立即加入培养基中，若为液体培养基，可在培养基冷却至30℃时加入；若为固体培养基，必须在培养基凝固之前（50-60℃）加入，振荡使溶液与其他成分混合均匀。

一、目的：建立培养基适用性检查操作规程，保证培养基的质量，确保检验结果的准确性。二、适用范围：本规程规定了培养基适用性检查方法和操作要求，适用于微生物实验室计数用培养基、控制菌检查用培养基的适用性检查。三、内容：1、简述1.1 培养基适用性检查试验可用于确定实验室所使用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基、按处方自行配制培养基所用不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查要求。1.2 计数用培养基适用性检查包括需氧菌、霉菌及酵母菌总数计数。1.3 控制菌检查用培养基适用性检查包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。2 计数用培养基适用性检查微生物限度检查中计数用培养基有5种，胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基、平板计数培养基。2.1 培养基及配制2.1.1 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基；R2A琼脂培养基、R2A琼脂对照培养基；平板计数培养基。2.1.2 配制：照《培养基配制标准操作规程》配制。2.2 试剂及稀释剂配制2.2.1 试剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、聚山梨酯80、氯化钠。2.2.2 稀释剂配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：称取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g,加水1000mL溶解，分装，灭菌（121℃、15min）。0.05％（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取已经灭菌好的聚山梨酯80（1mL），加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀，即得。0.9％无菌氯化钠溶液：称取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000mL，分装，灭菌（121℃、15min）。3 试剂及消毒液配制3.1 试剂新洁尔灭溶液、84消毒液、ben酚、75％医用消毒酒精。3.2 消毒液配制3.2.1 84消毒液：取84消毒液1ml，加水60ml(1：60)，摇匀即得。3.2.2 0.1％新洁尔灭溶液：取新洁尔灭溶液20.4ml，加水至1000ml，摇匀，即得。3.2.3 5％的ben酚溶液：称取ben酚5g，加水至100ml,摇匀，即得。3.2.4 75％酒精棉球：取灭菌脱脂棉撕成小块并揉捏成团，置于广口瓶内，加入75% 医用消毒酒精，充分浸润，即得。4 试验用菌株及菌液制备4.1 试验用菌株金黄se葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］枯草芽孢杆菌（Bacillus s aureus）［CMCC(B)63501］白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC(F)98003］4.2 菌液制备4.2.1 仪器与用具仪器：生化培养箱（30～35℃）、霉菌培养箱（20～25℃）、恒温水浴锅。用具：酒精灯、打火机、吸耳球、试管架、大试管（20×200mm、15×200mm）、锥形瓶、硅胶塞、刻度吸管（1mL、2mL、5mL/10mL）、吸管桶、接种环、培养皿（90mm）、不锈钢培养皿桶、不锈钢吸管桶、玻璃专用笔。5 菌液制备方法5.1 金黄se葡萄球菌菌液制备方法5.1.1 用无菌接种取金黄se葡萄球菌斜面中底部菌落一环，在装有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL的试管内壁上轻轻摩擦，使环上的菌苔全部洗于溶液中，振摇混匀。5.1.2 用1ml无菌吸管吸取上述均匀菌液0.1mL加入装有9.9mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，作为10-1级。5.1.3 以此类推，10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。5.2 枯草芽孢杆菌菌液制备方法照金黄se葡萄球菌菌液制备方法同法操作。5.3铜绿假单胞菌菌液制备方法照金黄se葡萄球菌菌液制备方法同法操作。5.4 白色念珠菌菌液制备方法。5.4.1 用无菌接种取白色念珠菌斜面中底部菌落一环，在装有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml的试管内壁上轻轻摩擦，使环上的菌苔全部洗于溶液中，振摇混匀。5.4.2 用1ml无菌吸管吸取上述均匀菌液0.1ml加入装有9.9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，作为10-1级。5.4.3 以此类推，10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。5.5 黑曲霉液制备方法5.5.1 取黑曲霉的斜面一支，加入20ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液于上述斜面培养物中，将孢子洗脱。5.5.2 用管口带有薄的无菌棉花的无菌吸管吸出全部孢子悬液，装入另外一支无菌试管中，混匀，作为原液。5.5.3 用1ml无菌吸管从试管中吸取0.1ml至另一支装有9.9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，作为10-1级。5.5.4 以此类推，10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的孢子悬液，备用。5.6 注意事项5.6.1 每一稀释级，均需制备2个菌数计数平皿。（每一稀释级取2个无菌平皿，每皿接种1ml菌液，铜绿假单胞菌、金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后于30～35℃培养箱培养18～24h，计数；白色念珠菌、黑曲霉倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基中，混匀，凝固后于20～25℃培养箱培养96h，计数。5.6.2 每递增一稀释级，必须另换一支吸管。5.6.3 稀释时，吸管插入上一级试管内不低于液面2.5cm，反复吸吹数次。5.6.4 吸液时，应先吸至高于吸管刻度上部少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至下一稀释试管的内壁近液面处（切勿接触液面）缓慢地放出全部试液。5.6.5 所用稀释菌液吸管均需放入装有5％苯fen溶液的消毒缸内，24小时后才能洗涤。5.6.6 菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若在2～8℃冰箱保存的菌悬液可以在24h内使用。黑曲霉孢子悬液可在2～8℃冰箱保存，在验证过的贮存期内使用。6 计数用培养基的适用性检查6.1 实验操作6.1.1 胰酪大豆胨琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的金黄se葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液于无菌平皿中，倾注约20ml胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种金黄se葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不超过3天；将接种白色念珠菌、黑曲霉的培养皿、对照培养皿于20～25℃培养不超过5天。6.1.2 沙氏葡萄糖琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液于无菌平皿中，倾注约20ml沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种白色念珠菌、黑曲霉培养皿、对照培养皿于20～25℃培养不大于5天。6.1.3 R2A琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液于无菌平皿中，倾注约20mlR2A琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不大于3天。6.1.5 平板计数琼脂培养基接种方法分别接种不大于100cfu的金黄se葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液于无菌平皿中，倾注约15ml该培养基，每株试验菌平行制备2个平板，轻轻摇匀。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查将接种金黄se葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不超过3天；将接种白色念珠菌、黑曲霉的培养皿、对照培养皿于30～35℃培养不超过5天6.2 观察与计算观察被检培养基上铜绿假单胞菌、金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形态、大小与对照培养基上铜绿假单胞菌、金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落形态、大小是否一致。依次计算被检培养基上铜绿假单胞菌、金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均数与对照培养基上铜绿假单胞菌、金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆、白色念珠菌、黑曲霉的菌落平均数的比值。6.3 结果与判断若被检固体上的菌落数平均数与对照培养基菌落数平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，各菌适用性检查符合规定。若被检固体上的菌落数平均数与对照培养基菌落数平均数的比值低于0.5～2范围，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落不一致，则判断该培养基的适用性查不符合规定。7 控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用培养基有液体培养基和固体培养基。7.1 培养基及制备培养基：脱水培养基、对照用培养基。制备：照培养基配制规程新鲜配制。7.2 试验用菌株及菌液制备试验用菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B)44102］金黄se葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003］枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCCB(B)63501]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10104］沙门菌（Salmonella paratyphi B）［CMCC(B)50094］白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F)98001］7.3 控制菌检查用培养基需要测试的能力及判断指标7.3.1 液体培养基促生长能力检查取不大于100CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊。指示特性检查取不大于100CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基中试验菌生长情况/指示剂反映情况应与对照培养基一致。抑制能力检查取不大于100CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最长培养基时间下培养，试验菌应不得生长。7.3.2 固体培养基促生长能力检查取试验菌液（含菌数不大于100CFU）分别接种于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃或（42～44℃））及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。指示特性检查取试验菌液（含菌数不大于100CFU）分别接种于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最短培养基时间下培养。被检培养基上试验菌的菌落形态特征、菌落颜色及指示剂反应情况应与对照培养基一致。抑制能力检查取试验菌液（含菌数不少于100CFU）分别接种于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度（30～35℃）或（42～44℃）及最长培养基时间下培养，试验菌应不得生长。7.4 培养基能力测试列表控制菌检查用培养基适用性检查项目、菌株及判断指标培养基    测试菌株    测试特性    测试指标胰酪大豆胨液体培养基    铜绿假单胞菌    促生长能力    浑浊金黄se葡萄球菌    促生长能力    浑浊枯草芽孢杆菌    促生长能力    浑浊沙氏葡萄糖液体培养基    白色念珠菌    促生长能力    浑浊RV沙门菌增菌液体培养基    沙门菌    促生长能力    浑浊金黄se葡萄球菌    抑制能力    不得生长麦康凯液体培养基    大肠埃希菌    促生长能力    浑浊金黄se葡萄球菌    抑制能力    不得生长麦康凯琼脂培养基    大肠埃希菌    促生长能力+指示特性    大小颜色形态同对照木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基    沙门菌    促生长能力+指示能力    大小颜色形态同对照三糖铁琼脂培养基    沙门菌    指示能力    大小颜色形态、指示剂反应同对照甘露醇氯化钠琼脂培养基    金黄se葡萄球菌    促生长能力+指示特性    大小颜色形态同对照大肠埃希菌    抑制能力    不得生长溴化十六烷基三甲铵琼脂    铜绿假单胞菌    促生长能力    大小颜色形态同对照大肠埃希菌    抑制能力    不得生长肠道增菌液体培养基    大肠埃希菌    促生长能力    浑浊铜绿假单胞菌    促生长能力    浑浊金黄se葡萄球菌    抑制能力    不得生长念珠菌显色培养基    白色念珠菌    促生长能力+指示能力    大小颜色形态、指示剂同对照大肠埃希菌    抑制能力    不得生长MUG培养基    大肠埃希菌    促生长能力+指示能力    大小颜色形态、指示剂同对照7.5 实验操作7.5.1 胰酪大豆胨液体培养基促生长能力检查接种方法：分别接种金黄se葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液于该培养基中，接种量不大于100cfu，摇匀，培养。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查：30～35℃培养不超过3天。7.5.2 沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力检查接种方法：接种白色念珠菌于该培养基中，接种量不大于100cfu，摇匀，培养。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。适用性检查：20～25℃培养不超过3天。7.5.3 RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力检查接种方法：分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，与对照培养基管比较。抑制能力检查接种方法：分别接种不少于100cfu的金黄se葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基管比较。7.5.4 麦康凯液体培养基适用性检查促生长能力检查接种方法：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在42～44℃条件下培养18～24h，与对照培养基管比较。抑制能力检查接种方法：分别接种不少于100cfu的金黄se葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在42～44℃条件下培养24h，并将被检培养基与对照培养基管比较。7.5.5 麦康凯琼脂培养基适用性检查促生长能力+指示特性的检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。7.5.6 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力+指示特性的检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。7.5.7 三糖铁琼脂培养基、指示能力接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基高层斜面上，便进行穿刺。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。7.5.8 甘lu醇氯化钠琼脂培养基促生长能力+指示特性的检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的金黄se葡萄球菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。7.5.9 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基促生长能力检查接种方法：用涂布法接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，与对照培养基比较。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。7.5.10 肠道菌增菌液体培养促生长能力检查接种方法：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，与对照培养基管比较。抑制能力检查接种方法：分别接种不少于100cfu的金黄se葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基管比较。7.5.12 平板计数琼脂培养基促生长能力检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基对照培养基比较。7.5.13 念珠菌显色培养基促生长能力检查接种方法：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基与对照培养基比较。抑制能力检查接种方法：用涂布法分别接种不少于100cfu的金黄se葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于被检培养基和对照培养基平板上。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h，并将被检培养基对照培养基比较。7.5.14 MUG培养基促生长能力+指示特性的检查接种方法：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板中。适用性检查：在30～35℃条件下培养18～24h。8 注意事项8.1 培养基的配制方法和灭菌程序发生变更时，应再次对培养基进行适用性检查。8.2 培养基批号发生变更时，应再次对培养基进行适用性检查。8.3 培养基供应商发生变更时，应再次对培养基进行适用性检查。9 记录每一次进行培养基的适用性检查后在《培养基适应性验证记录》上记录。

也许好多人对菌种的鉴定方法不了解，尤其是发酵罐的。下面远慕生物就来给大家介绍如何鉴定发酵罐中的菌种种类：1.糖发酵试验糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。具体实验步骤：① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。③ 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。2.发酵罐菌种蛋白质分解实验① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。③24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。3.淀粉水解实验① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 .③ 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。以上是三种可以给发酵罐菌种做鉴定的方法，大家可以选择适合自己的那个使用。

免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)与相应抗体（或抗原）以化学的方法结合，将荧光标记抗体（或抗原）与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体- 抗原复合物，用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已 知的抗体（或抗原）即可推知另一个未知抗原（或抗体）的存在。1. 直接免疫荧光法　直接免疫荧光法是利用荧光色素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原。本法具有操作简单、时程短、特异性高的优点，但也 存在缺点如不能检查抗体，敏感性较差。（1）在标本上滴加荧光素标记抗体，放入湿盒中。37℃温育30min。（2）PBS 冲洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。（3）PBS浸泡1～2min，风干。（4）缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察。进行直接免疫荧光法时应注意：①温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。②用PBS浸泡时应不断振荡。2. 间接免疫荧光法　间接免疫荧光法以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗原或抗体的 存在。间接荧光技术可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体测出未知抗原。现以检测流行性出血热病毒抗体（IgM）为例介绍如下：（1）将待测病人血清加至抗原片（流行性出血热病毒感染的Vero-E6细胞片）上，每个稀释 度加2孔，最后2孔加PBS做对照。将玻片放置湿盒中，37℃温育 60min。取出玻片，弃去反应液，用PBS洗涤5min，风干。（2）加入1∶40稀释的FITC标记的羊抗人IgM，37℃温育60min。取出玻片，按步骤2洗涤，风干。（3）PBS甘油封片，荧光显微镜下观察。阳性结果：在细胞膜及细胞质中可见颗粒状荧光颗粒，细胞核 呈红色。注意事项：温育时将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。选择低温、干燥、洁净的环境风干。

实验概要本实验介绍了根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备及冻融法转化。主要试剂利福平，LB培养基，NaCl，CaCl2，YEP培养基，卡那霉素主要设备摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅实验材料根癌农杆菌GV3101单菌落实验步骤1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。2. 冻融法转化农杆菌1) 冰浴融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞；2) 加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37℃水浴5min；3) 加入950uL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；4) 1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100uL YEP回溶菌体；5) 将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36-48h。菌液PCR检测阳性克隆。

做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很困难的，1 个月做 100 个克隆那都是 小 case，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较稀有的基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面远慕生物就和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人！1. 准备工作俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。 推荐两个工具，一个是 oligo 软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是 DNAstar 软件，工具极强大，一款全面的生物医学软件，用作 DNA 和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。2. 设计引物1) 注重要：看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来 结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1 质粒，注意阅读框，要是移码了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！其他需要注意：*设计酶切位点时要加保护碱基（大家要用 T 载体就当我没说）;*酶切位点设计原则：尽量用粘性末端，实在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算 TM 值的时候要减去这些不匹配的序列；*注意 KOZAK 序列的问题，很多质粒没有提供 KOZAK 序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。*擅用 Gene Overlap，比方说加个 flag 标签，his 标签，my 标签之类的，直接设计三引物 overlap 一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（两步法），尤其是对 GC 比高的序列，有时候引物不长 PCR 根本不出结果，注意如果 GC 比较高，这个时候 Gene Overlap 就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。*没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧。3. PCR 扩增如果没有现成的质粒可供酶切，PCR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可选择的 PCR 酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的 taq 酶都能满足需求。但如果遇到难 PCR 的高 GC 基因，可以换不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，实在不行可以考虑 Clontech 的 2 GC rich kit，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化 PCR 产物， 去除一些非特异性条带。4. 酶切强烈推荐 NEB 的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用 NEB 的酶，切个七十二小时仍旧一切 OK，尤其现在 NEB 还推出了 HF 的内切酶，没有星活性而且统一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也还可以。5. 连接常用的是 NEB 的 T4 连接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反复冻融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分装，10uL/管，一次性使用。载体总量：一般来说，载体浓度在 20-100ng/uL 较好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从 50-100ng 就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用 10-15uL。载体和插入片段比例：载体和插入片段比例一般是 1:7，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高片段浓度，同时加大比例 1:10。6. 转化按照 SOP 做就行，话说实验室原来从 takara 买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高（protocol 免费索取）。要注意的是 LB 必须无菌而且没有抗生素。7. 鉴定想要快速鉴定，建议用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定讲究的，很多人做菌液 PCR 鉴定假阳性特多，为什么？因为你 PCR 引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR 方法鉴定是极其准确的，数百次菌液 PCR 经验。PCR 鉴定做起来也很简单， 拿个 2mL tube，装 0.5mL 加入相应抗生素的 LB，摇个三小时左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不错，效果一样。8. 测序拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。

单细胞测序的兴起，不仅是新概念炒作，而是在相关领域，长时间由于技术的瓶颈很多生物学问题没有解决，现在突然有一个技术可以高性价比地解决这些问题，导致这个技术被大量应用。以单细胞转录组测序技术为例开展探讨，单细胞转录组主要包括以下四个步骤，其中关键的一点就是如何进行单细胞的捕获/分选，这是决定单细胞检测成本和通量的关键步骤。主要步骤：在细胞分选的方法里，主要包括特异性分选和非特意性分选两类方法，两类方法的关系有点类似定量（只针对特定目标基因进行检测）和转录组测序，用特定标志对特定目标细胞进行挑选，然后对目标细胞开展测序，所以特异性选择的方法通常通量很低。非特异性选择的方法则通常都是高通量的方法，一般是用特定的技术随机从样本中捕获的大量细胞单体，然后直接平行对大量细胞进行独立的测序，再从大量单细胞数据中寻找自己感兴趣的细胞类型进行后续分析。反转录扩增过程中，每个细胞的cDNA会被接上特异的接头序列，保证后续混合测序后还能重新独立拆分每个细胞的数据，芯片由于可以平行进行96个细胞的建库测序，降低了成本。单细胞测序进行目标组织细胞图谱全景扫描这样的研究，一般要求检测至少数千个甚至几十万个细胞，而芯片通量只有96个细胞，则意味着要进行多次芯片捕获，这会提高芯片耗材的投入成本，因此，我们还需要更高通量的技术。单细胞转录组测序是在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术，针对单个细胞研究其整体水平的基因表达情况，成功解决细胞分子机制研究中常见的细胞异质性、细胞量少而无法进行常规高通量测序等难题。

单克隆抗体制备的原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力、B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的、将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术。单克隆抗体制备的过程：免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。单克隆抗体制备的意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离.（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 .（7）免疫印记（western blotting)（8） 免疫沉淀：（9） 亲和层析：分离蛋白质（10） 磁珠分离细胞（11）临l床疾病的诊断和治疗

荧光原位杂交技术（ fluorescence in situ Hybridization,FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊的荧光素标记核酸探针，在细胞或组织切片标本上进行杂交，以检测细胞内 DNA 或 RNA 特定序列存在与否。FISH 实验操作与用非荧光标记探针的原位杂交基本相似。在组织准备方面，新鲜组织、冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞爬片等材料均可以用于进行FISH 实验检测。以下谈谈用细胞爬片进行 RNA FISH 检测的一些总结。一、实验流程1. 细胞在盖玻片上进行培养，细胞长好后用 CSK 缓冲液简单洗涤。2. 细胞爬片用 4% 多聚甲醛在 4℃ 固定 10 min。3. 用含有 0.5% TritonX-100,，10 mM VRC 的 CSKBuffer 溶液在 4℃ 处理 10-12 min。4. 用 70% 酒精，4℃，孵育 10 min。5. 在-20℃, 分别用 70%，85% 和 100% 的酒精处理 5 min，进行脱水，最后风干。然后用中性树胶将细胞爬片粘在载玻片上 （正面朝上）。6. 探针的准备，将加了探针的杂交缓冲液置于 76℃ 变性处理 10 min。7. 将 5ul 杂交混合液滴在爬片上，盖上盖玻片，经 Rubber Cement 橡胶封片，置于潮湿暗盒中 37 ℃ 杂交过夜。8. 杂交后，去除橡胶和盖玻片，爬片用 50% 甲酰胺 (2XSSC 配) 在 42℃，洗 5 minX3，然后用 2XSSC 在42℃，洗 5 minX3。9.DAPI 复染，取适量 DAPI 储存液用 PBS 稀释至 1ug/ml 的工作液，吸 5μL 滴爬片上，盖上盖玻片，黑暗室温孵育 5min。去掉盖玻片，在 PBS 中洗涤 2 次。去掉过量液体，滴加 antifade reagent 封片。10. 荧光显微镜下观察二、注意事项1、做 RNA FISH 实验，首先要防止 RNA酶的污染。操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换。所有实验用到玻璃制品都要高温灭菌，且各种溶液要用 DEPC 水配制。2、去污剂 triton X-100 处理的目的是增加细胞的通透性，利于杂交探针进入细胞，其处理时间因应不同的细胞而有所不同。注意：过度的去污剂处可能会引起靶核酸的丢失。3、荧光见光就会淬灭，因此操作过程要做好避光。4、将细胞爬片粘在载玻片上，确保有细胞的那面朝上。5、实验所用探针是双链 DNA 探针，而杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。因此在做 RNA FISH 杂交前，探针必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。6、探针的浓度因其种类和实验要求而有所不同，一般为 0.5-5ng/ul。合适的探针浓度要通过实验才能确定。7、杂交反应时，盖玻片不可有气泡，不然妨碍探针与细胞的接触。8、玻片经 antifade reagent 封片后可在 4℃ 暗处保存 2-3 星期而不失去全部荧光，但 FISH 操作完成后要及时观察采图。9、如果镜检时，观察到有非特异结合造成的高背景。可能原因有：不合适的探针量，不适合的杂交后洗涤，又或者是样本中有过多的重复序列。解决方法：1）使用合适的探针量；2）改善杂交后的洗涤，如洗涤液要新鲜配制，增加洗涤液的量，延长洗涤时间等；3）使用 DNA 阻断剂，在探针中加入一定量的 DNA 竞争性阻断剂如 COT-1 DNA 或鲑精 DNA 来竞争性结合基因组中重复性片段。

什么叫细胞爬片?细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等.细胞爬片经验总结：1.爬片可用一般的盖玻片，也可用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于 6 孔板、12 孔板或 24 孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。 如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切 开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗 20 遍，再置于无 水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲洗 3 遍（主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。细胞爬片：1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使 玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可 4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出 就可以了。如果要做诸如 24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。细胞爬片的固定：细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是 一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会 脱落。 另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬 片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶 带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存 2-3 个月的片子做免疫组化是没有问题的。以下为常用的固定液1.冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。 将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬 片取出后，PBS洗 2 遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮 和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定 10 分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇 (CD)、主要组织相容性抗原等 室温固定 15 分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存。3.95％乙醇，可用于免疫组化。优点：穿透性强、抗原性保存较好。 缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻， 固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 室温固定 15 分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存4.甲醛(福尔马林)应用zui广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格 结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 室温固定 15 分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存 。

细胞爬片免疫荧光步骤：1.远慕生物细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系真核基因在大肠杆菌中表达,必须有合适的表达载体(Vector),常用载体:pBV220,pET系统目的基因在大肠杆菌中表达的情况:大肠杆菌更适合原核基因的表达,外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的,而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率,外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡,单个细胞的产量又与外源基因拷贝数,基因表达效率,表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。大肠杆菌的菌落形态大肠杆菌在普通琼脂培养基上面都是一样的,圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定条件下引起疾病 。大肠杆菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。:大肠杆菌在生物技术中的应用

　　1：DH5a菌株　　DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。　　基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1　　2：BL21(DE3)菌株　　该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。　　基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）　　3：BL21(DE3)pLysS菌株　　该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。　　基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr　　4：JM109菌株　　该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株　　基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’　　5：TOP10菌株　　该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。　　基因型：F-，mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG　　6：HB101菌株　　该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验　　基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1M110或SCS110　　大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI,BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：　　（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；　　（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

一、平板划线分离法 由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 二、稀释倒平板法 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 、 1 ∶ 10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 稀释涂布法： 优点：可以计数，可以观察菌落特征。 缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。 一般用于平板培养基的回收率计数！！ 稀释混合平板法： 优点：可以计数，吸收量为1ml，较方便。 优点：不能观察菌落特征。 一般用于菌落总数的计数！！平板划线法： 优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离！！缺点：不能计数

　　根据培养基名称来看,平板计数琼脂培养基即PCA,是在08版GB中用于菌落总数测定的,配方:胰蛋白胨0.5%,酵母浸粉0.25%,葡萄糖0.1%,琼脂1.5%,蒸馏水配制;pH 6.8~7.2。营养琼脂培养基即NA,配方:蛋白胨1%,牛肉膏0.3%,氯化钠0.5%,琼脂1.5%~2.0%,蒸馏水配制。pH 7.2~7.4。两者配方成分不一样,名字也不一样;但是都是可以用来做菌落总数的测定,所以说这两者从用途的本质上并没有太大的区别。　　但是从实验结果来看,对于检测结果,偶尔几次试验两者的区别不大。只是国际上有说法,在重复几百次试验后,PCA的结果略好些。　　另外,从操作流程来看,用平板计数琼脂来做菌落总测定,有以下这些变化:　　1、试剂从营养琼脂变成了平板计数琼脂。　　2、添加了细菌总数检验测试片。　　3、修改了计数计算公式。　　4、添加了均质器或等效设备。　　一般来说,营养琼脂(NA)和平板计数琼脂(PCA)都是用作嗜温性细菌的培养基,二者成分大同小异,通常情况下可以互相替代。当然如果是按照标准来做检测的话,尽量还是用与检测标准上相同的培养基。

印迹法(blotting)即转移电泳，是20世纪70年代发展起来的一种新方法。Southern于1975年建立了检测特异DNA片段的DNA- RNA杂交法，称作Southern印迹法。1977年Alwine等把此方法应用到RNA的研究方面，称作Nouthern印迹法。1979年Towbin等则把该方法扩展应用到蛋白质分析方面，称作Western印迹法。1982年 Reinhart报道的双向蛋白质印迹法，称作Eastern印迹法。目前，有人把Southern，Nouthern，Western印迹法分别称作DNA印迹法，RNA印迹法和蛋白质印迹法。而每一种印迹法又可以分为斑点印迹法和电泳转移印迹法。前者是将样品直接吸附于固相载体上，而后者则是将样品先经过电泳后在转移到固相载体表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白质等大分子物质印迹到固相载体，容易和各种探针发生化学或免疫反应，因而对检测样品(尤其是粗样品)中某些组分的理化性质是有益的。其操作过程所需的试剂量少，灵敏度高，所以应用较为普遍。印迹法的基本原理(一)概念1．探针 用化学方法将有识别能力的物质(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根过氧化物酶)或核素(如3H、35S、32P)，或荧光物质(如异硫氰荧光素、地gao辛等)结合成的复合物称作探针。2．固相载体 即用于吸附生命大分子物质的固体材料。这类材料有硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，尼龙膜(nylon- membranes，NDM)，重氮苄氧甲基(yloxymethyl，DBM)膜和重氮苄硫醚(diazophenylthiaether，DPT)纸等。最常用的是孔径为0．45／lm的NC膜，因为它成本低廉，结合力强，背景较清晰。而对于检测核酸和酸性蛋白质来说，理想载体是带正电的尼龙膜，它与负电荷物质结合力很强，操作亦简单。但因为其与负离子型染料也易结合，背景值高，故使用受到一些限制。3．封阻 用一种与待测物不反应的物质(如蛋白质、核酸、吐温20等)封阻载体印迹区域以外的剩余吸附位点，使探针与印迹物反应，且不吸附到载体上，此过程称为封阻，从而使印迹结果背景干净，印迹的斑点或谱带更为清晰。4．印迹 把经过凝胶电泳后的组分，通过吸附或电泳方法转移或者以直接点样方式吸附到固相载体上，此过程称电泳印迹，或称点印迹。5．放射自显影 将含放射性核素的复合物置X线感光胶片上压片，当放射性核素电离辐射时，胶片上会发生化学“感光”作用，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带，此法较灵敏。(二)原理生命大分子物质(如核酸或蛋白质)印迹到固相载体上，经淬灭试剂处理后，可与相应的探针(酶标记)反应，接着用适当的溶液漂洗，置含底物的溶液中显色，即可现出谱带。如所用探针为放射性核素标记物时，则应将漂洗后的载体进行放射自显影，即可检测出样品中特异的成分。印迹法的应用(一)分析和制备特异成分一般生命大分子如蛋白质等的粗制品经过凝胶电泳后，常常产生许多谱带。但它再经印迹转移程序分析后，就可以从中找出所需的某一特殊成分，而这种特殊成分又可以从相应的凝胶区段回收。用此方法得到的物质纯度较高，纯化步骤也较简单。(二)检测生命大分子之间的相互作用不同生命大分子之间的相互作用是经常发生的，特别是在有机体内。因此，建立一种检测生命大分子物质之间相互作用的有效方法一直是人们研究的重要课题。而用印迹法就可以检测出如DNA-RNA、DNA-蛋白质、RNA-蛋白质、酶—底物、糖蛋白—凝集素、激素—受体等物质之间的相互作用，同时也可用此方法寻找各种大分子物质的相应配体。

随着蛋白类生物制品的发展，蛋白质纯度已经成为药品管理的重大问题。在生物制品的质量指导原则中指出：除了评价原料药和药物产品的纯度，可能由预期产品和多种产品相关物质组成之外，还应评价可能出现的杂质成份。这些杂质可能是在生产过程中产生的或者是与产品相关，它们的结构可能是已知的、定性的，亦或是未知的。在评价样品纯度之前，首先要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在待测溶液中，能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化性质(化学分析或物理特征)。纯化过程中可能已将某一杂质的浓度降低到检测限以下，但色谱峰中还有残留。毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。大多数的分离方法都能有效的去除非蛋白类杂质，下面远慕生物简单介绍蛋白质样品中蛋白类杂质的检测方法。1、电泳法电泳法最简单、成本最低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高，因此最为常见。通常被用于蛋白质纯度鉴定的第一步筛选，甚至应用于初期高异质性的样品鉴定。如果预期杂质与目标蛋白的分子量有差距，SDS凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子量相近但氨基酸组成不同的分子，SDS凝胶电泳一般分不开，但在非变性凝胶电泳中可以根据其不同的电泳迁移率进行鉴定。然而，在采用该方法时也需要注意一些潜在的问题。对于变性凝胶，可能出现假阴性和假阳性现象。如果发生杂质共迁移或杂质无法进入凝胶的情况，会出现假阴性。因此应该将整块胶，包括浓缩胶和分离胶都染色，并且需要检验蛋白质燃料是否合适。而假阳性的产生，可能是由于在样品制备时发生共价修饰，或者胶不均一或氧化剂残留。同时在非变性凝胶中也会出现类似问题。如果杂质的静电荷为零或者与目标蛋白相反，杂质将不会出现在胶上，可以通过加宽非变性凝胶电泳的PH范围来解决。2、色谱法2.1 凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法是检测与目的蛋白分子量大小不同杂质的最简单方法之一。此方法无破坏性并且非常快速。因为此方法为样品区分法，样品通过凝胶柱时会被稀释，因此检测的样品需要有一定的起始浓度。而具体的检测量则取决于检测杂质时的灵敏度。凝胶过滤色谱法检测分子大小的灵敏度低于电泳法，实验需要的材料量大于电泳法。由于凝胶过滤色谱通常在天然状态下进行，结果可以反映样品的异质性。但如果蛋白质以稳定的寡聚物形式存在(如脂肪酸酶)，在凝胶过滤色谱时将表现出异质性。同时，快速、可逆自联作用的蛋白质也会表现出异常浓度的洗脱谱。在出现这样情况的时候，可以从不对称或加宽峰中选取不同部分来重复凝胶过滤色谱。2.2 反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法（reversed phase HPLC），是利用如改性硅介质等非极性基质作为固定相，通过流动相中的有机溶剂减少了蛋白质与固定相的亲和力，进行极性递减的梯度洗脱，从而将蛋白洗脱下来。由于该方法简单并且迅速，同时有现成的仪器设备，能够灵活应用于多种不同特性的蛋白质分离，因此此方法已普遍用于蛋白质样品的纯度测定。如果有需要，还可以通过改变流动相使样品在不同梯度及条件下分离，来确定主要目标物的纯度。3、沉降速率测定法沉降速度法，能够简单并且快速非破坏性的来测定蛋白质的纯度，同时对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。该方法的优点在于，测定范围非常的广；但局限在于，对相对分子质量相差小的样品做测定时，灵敏度低于电泳技术。4、质谱法质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布，此方法能够方便简便、灵敏的测定杂质。质谱法不仅可以检测杂质的存在，还可以描述杂质的质量特征，因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。通过串联质谱法（MS/MS），可以鉴定共价改性修饰特征和位点。由于杂质可能与主要目标物有相似的质荷比，将质谱法与其他方法(如凝胶分离色谱)联用，可以增加样品纯度测定的准确性，达到最佳的效果。5、光散射法目前一些仪器能够通过静态或动态光散射来测定单个样品，或者监测高效液相色谱和场级分离过程。通过对分子大小和表观分子质量的连续测定，增强鉴定洗脱蛋白质的能力，以区分待分析物、待分析物的多聚体或杂质。光散射法非常简单且无破坏性，同时能够提供洗脱时间函数的分子质量图。如果紫外检测峰不对称，通过多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析，有可能表现峰的主要部分表观分子量为mol/L，而边缘为2mol/L，说明可能存在二聚体。但出现倍数分子质量不一定能证明一定存在自身结合，还需要采用不同的方法验证此结果。任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。通常情况下，蛋白质纯度测定涉及评价待定杂质的含量或仅仅验证蛋白质样品中是否存在杂质。无论最终目的是为了解释分析数据、验证过程质量，还是为了确保生物制剂产品的安全性，样品纯度的测定都是至关重要的环节。

　　滴定误差要求：以不确定度表示，≤ ± 0.2% 。　　滴定误差分类：主要包括称量误差、量器误差、方法误差。　　（1） 称量误差　　每次称量误差：± 0.0001g，一份试样称量误差±0.0002g。　　若相对误差 ±0.1%，则每一份试样的称量至少为0.2g。　　（2）量器误差　　滴定管读数误差：± 0. 01ml,一份试样量取误差± 0. 02ml。　　若相对误差±0.1%，则每一份试样体积量至少为±20 ml　　（3）方法误差：主要是终点误差。其原因有：指示剂不能准确地在化学计量点时改变颜色；标准溶液的加入不可能恰好在指示剂变色时结束；接近终点时半滴半滴加入 控制不好；指示剂本身会消耗少量标准溶液做空白试验；杂质消耗标准溶液。

先来认识下标准溶液与基准物质标准溶液：已知准确浓度的溶液，在各种滴定分析方法中都要用到标准溶液，可根据溶质的性质、特点，按不同方法配置，配制方法有直接配置法和间接配置法。基准物质：能用来配制标准溶液或测定标准溶液浓度的物质。应具备如下条件：1、组成恒定并与化学式相符，若含结晶水，其结晶水的实际含量也应与化学式严格相符。2、纯度足够高(达99.9%以上)，杂质含量应低于分析方法允许的误差限。3、性质稳定，不易吸收空气中的水分和二氧化碳，不分解，不易被空气氧化。4、有较大的摩尔质量，以减少称量时的相对误差。5、试剂参加滴定反应时，应严格按反应式定量进行，没有副反应。如何配制标准溶液？标准溶液是指已知准确浓度的溶液，它是滴定分析中进行定量计算的依据之一。不论采用何种滴定方法，都离不开标准溶液。因此，正确地配制标准溶液，确定其准确浓度，妥善地贮存标准溶液，都关系到滴定分析结果的准确性。配制标准溶液的方法一般有以下两种：1、直接配制法用分析天平准确地称取一定量的物质，溶于适量水后定量转入容量瓶中，稀释至标线，定容并摇匀。根据溶质的质量和容量瓶的体积计算该溶液的准确浓度。能用于直接配制标准溶液的物质，称为基准物质或基准试剂，它也是用来确定某一溶液准确浓度的标准物质。作为基准物质必须符合下列要求：1)试剂必须具有足够高的纯度，一般要求其纯度在99.9%以上，所含的杂质应不影响滴定反应的准确度。2)物质的实际组成与执业医师网它的化学式完全相符，若含有结晶水（如，硼砂Na2B4O7·10H2O)，其结晶水的数目也应与化学式完全相符。3)试剂应该稳定。例如，不易吸收空气中的水分和二氧化碳，不易被空气氧化，加热干燥时不易分解等。4)试剂最好有较大的摩尔质量，这样可以减少称量误差。常用的基准物质有纯金属和某些纯化合物，如，Cu, Zn, Al, Fe和K2Cr2O7，Na2CO3, MgO, KBrO3等，它们的含量一般在99.9%以上，甚至可达99.99%。应注意，有些高纯试剂和光谱纯试剂虽然纯度很高，但只能说明其中杂质含量很低。由于可能含有组成不定的水分和气体杂质，使其组成与化学式不一定准确相符，致使主要成分的含量可能达不到99.9%，这时就不能用作基准物质。2、间接配制法（标定法)需要用来配制标准溶液的许多试剂不能完全符合上述基准物质必备的条件，例如：NaOH极易吸收空气中的二氧化碳和水分，纯度不高；市售盐酸中HCl的准确含量难以确定，且易挥发；KMnO4和Na2S2O3等均不易提纯，且见光分解，在空气中不稳定等。因此这类试剂不能用直接法配制标准溶液，只能用间接法配制，即先配制成接近于所需浓度的溶液，然后用基准物质（或另一种物质的标准溶液)来测定其准确浓度。这种确定其准确浓度的操作称为标定。例如欲配制0.1mol/L HCl标准溶液，先用一定量的浓HCl加水稀释，配制成浓度约为0.1mol/L的稀溶液，然后用该溶液滴定经准确称量的无水Na2CO3基准物质，直至两者定量反应完全，再根据滴定中消耗HCl溶液的体积和无水Na2CO3的质量，计算出HCl溶液的准确浓度。大多数标准溶液的准确浓度是通过标定的方法确定的。在常量组分的测定中，标准溶液的浓度大致范围为0.01mol/L至1mol/L，通常根据待测组分含量的高低来选择标准溶液浓度的大小。为了提高标定的准确度，标定时应注意以下几点：1）标定应平行测定3～4次，至少重复三次，并要求测定结果的相对偏差不大于0.2% 。2）为了减少测量误差，称取基准物质的量不应太少，最少应称取0.2ｇ以上；同样滴定到终点时消耗标准溶液的体积也不能太小，最好在于20mL以上。3）配制和标定溶液时使用的量器，如滴定管，容量瓶和移液管等，在必要时应校正其体积，并考虑温度的影响。4）标定好的标准溶液应该妥善保存，避免因水分蒸发而使溶液浓度发生变化；有些不够稳定，如，见光易分解的ＡgNO3和KMnO4等标准溶液应贮存于棕色瓶中，并置于暗处保存；能吸收空气中二氧化碳并对玻璃有腐蚀作用的强碱溶液，最好装在塑料瓶中，并在瓶口处装一碱石灰管，以吸收空气中的二氧化碳和水。对不稳定的标准溶液，久置后，在使用前还需重新标定其浓度。什么是“有证”标准物质？附有证书的标准物质，其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的用于表示该特性值的计量单位，而且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。注：1、有相应的标准物质证书。2、有证标准物质一般成批制备，其特性值是通过对代表整批物质的样品进行测量而确定，并具有规定的不确定度。3、当标准物质与特制器件相结合时，例如，已知三相点的物质装入三相点瓶，已知光密度的玻璃装入透射滤光片、均匀粒子尺寸板装在显微镜玻璃板上，有证标准物质的特性有时可方便地和可靠地确定，上述这些器件也可以认为是有证标准物质。4、所有有证标准物质应符合中给出的“计量基准标准”的定义。5、有些标准物质和有证标准物质有这样的特性，它们与已确定的化学结构不相关，或由于其他原因不能用精确的物理和化学测量方法确定。基准物质标定法与标准溶液标定法1、 基准物质标定法：称取一定量的基准物质，溶解后用待标定的溶液滴定。根据基准物质的质量和溶液的消耗体积，计算待标定溶液的准确浓度。2、 标准溶液标定法：准确吸取一定量的待标定溶液，用另一种已知准确浓度的标准溶液滴定；或准确吸取一定量的已知准确浓度的标准溶液，用待标定的溶液滴定。根据两种溶液的消耗体积及已知的标准溶液浓度，计算待标定溶液的准确浓度。此法若标准溶液浓度不准确会直接影响待标定溶液浓度的准确性。因此，标定时应尽量采用基准物质标定法。无论用哪种方法标定，一般要求平行做3～4次实验，至少2～3次。相对偏差小于0.2%。标定好的标准溶液应妥善保存。放置一段时间后，标准溶液要先摇匀，再使用，若不稳定的溶液，还要定期标定。标准物质的正确使用包括正确的选择、正确使用（防止误用）和使用的注意事项：1） 标准物质应根据不同的用途、目的，选择不同的标准来源，如，从相应的标准品供应处购买、购买相应的商品或从特殊途径获得。2）目的不同，标准品级别要求则不同。应选用标准物质特性量值与预期应用测试值水平相适应的标准物质。使用者不应选用不确定度超过测量值与预期应用测量程序所容许水平的标准物质，一般工作场所可以选用满足要求的标准物质。对实验室认证、方法验证、产品评价与仲裁等可以选用高水平的标准物质。3）使用者在使用标准物质前应仔细、全面地阅读标准物质证书，只有认真的阅读证书中所给出的信息，才能保证正确使用标准物质。4）选用的标准物质稳定性应满足整个实验计划的需要。凡已超过稳定性的标准物质切不可随便使用。5）使用者应特别注意证书中所给该标准物质的最小取样量。最小取样量是标准物质均匀性的重要条件，不重视或者忽略了最小取样量，会影响测量结果的准确性和可信度。6）所选用的标准物质数量应满足整个实验计划使用，必要时应保留一些储备，供实验计划后必要的使用。7）选用标准物质除考虑其不确定度水平外还要考虑到标准物质的供应状况、价格以及化学的和物理的适用性。有的使用者不顾花费昂贵的价格与手续非要从国外进口标准物质来使用，这也是标准物质的误用。

 　　我国将标准物质分为一级与二级，它们都符合“有证标准物质”的定义。　　（1） 一级标准物质　　一级标准物质是用绝对测量法或两种以上不同原理的准确可靠的方法定值，若只有一种定值方法可采取多个实验室合作定值。它的不确定度具有国内最高水平，均匀性良好，在不确定度范围之内，并且稳定性在一年以上，具有符合标准物质技术规范要求的包装形式。一级标准物质由国务院计量行政部门批准、颁布并授权生产，它的代号是以国/家级标准物质的汉语拼音中“Guo”“Biao”“Wu”三个字的字头“GBW”表示。　　（2） 二级标准物质　　二级标准物质是用与一级标准物质进行比较测量的方法或一级标准物质的定值方法定值，其不确定度和均匀性未达到一级标准物质的水平，稳定性在半年以上，能满足一般测量的需要，包装形式符合标准物质技术规范的要求。二级标准物质由国务院计量行政部门批准、颁布并授权生产，它的代号是以国/家级标准物质的汉语拼音中“Guo”“Biao”“Wu”三个字的字头“GBW”加上二级的汉语拼音中“Er”字的字头“E”并以小括号括起来――GBW（E）。　　标准物质的作用　　⑴ 保存和传递特性量值，建立测量溯源性　　标准物质是特性量准确、均匀性和稳定性良好的计量标准，具有在时间上保持特性量值，在空间上传递量值的功能。通过使用标准物质，可以使实际测量结果获得量值溯源性。　　⑵ 保证测量结果的一致性、可比性　　通过校准测量仪器，评价测量过程，由标准物质将测量结果溯源到国家单位制(SI)，保证测量结果的一致性、可比性，从而达到量值统一。　　⑶ 研究与评价测量方法　　标准物质可作为特性量值已知的物质，用于研究和评价测量这些成分或特性的方法，从而判断该方法的准确度和重复性，并通过验证和改进测量方法的准确度，评价检测方法在特定场合的适应性，促进测试技术的发展。　　⑷ 建立测量系统的质量保证　　检测机构通过使用标准物质进行质量控制，实现质量保证，这是确保检测数据准确、可靠，具有可比性的做好方法。 

　　滴定的操作方法　　进行滴定时，应将滴定管垂直地夹在滴定管架上。　　如使用的是酸管，左手无名指和小手指向手心弯曲，轻轻地贴着出口管，用其余三指控制活塞的转动。但应注意不要向外拉活塞以免推出活塞造成漏水；也不要过分往里扣，以免造成活塞转动困难，不能操作自如。　　如使用的是碱管，左手无名指及小手指夹住出口管，拇指与食指在玻璃珠所在部位往一旁（左右均可）捏乳胶管，使溶液从玻璃珠旁空隙处流出。注意：①不要用力捏玻璃珠，也不能使玻璃珠上下移动；②不要捏到玻璃珠下部的乳胶管；③停止滴定时，应先松开拇指和食指，最后再松开无名指和小指。　　无论使用哪种滴定管，都必须掌握下面三种加液方法：①逐滴连续滴加；②只加一滴；③使液滴悬而未落，即加半滴。　　滴定操作中应注意以下几点：　　⑴摇瓶时，应使溶液向同一方向作圆周运动（左右旋转均可），但勿使瓶口接触滴定管，溶液也不得溅出。　　⑵滴定时，左手不能离开活塞任其自流。　　⑶注意观察溶液落点周围溶液颜色的变化。　　⑷开始时，应边摇边滴，滴定速度可稍快，但不能流成“水线”。接近终点时，应改为加一滴，摇几下。最后，每加半滴溶液就摇动锥形瓶，直至溶液出现明显的颜色变化。加半滴溶液的方法如下：微微转动活塞，使溶液悬挂在出口管嘴上，形成半滴，用锥形瓶内壁将其沾落，再用洗瓶以少量蒸馏水吹洗瓶壁。用碱管滴加半滴溶液时，应先松开拇指和食指，将悬挂的半滴溶液沾在锥形瓶内壁上，再放开无名指与小指。这样可以避免出口管尖出现气泡，使读数造成误差。　　⑸每次滴定最好都从0.00开始（或从零附近的某一固定刻度线开始），这样可以减小误差。　　(6)滴定结束后，滴定管内剩余的溶液应弃去，不得将其倒回原瓶，以免沾污整瓶操作溶液。随即洗净滴定管，并用蒸馏水充满全管，备用。

　　影响酸碱中和滴定结果的因素：　　1、读数：滴定前俯视或滴定后仰视 （偏大）滴定前仰视或滴定后俯视（偏小）　　2、未用标准液润洗滴定管 （偏大）；未用待测溶液润洗滴定管（偏小）　　3、用待测液润洗锥形瓶 （偏大）　　4、滴定前标准液滴定管尖嘴有气泡，滴定后尖嘴气泡消失 （偏大）　　5、不小心将标准液滴在锥形瓶的外面 （偏大）　　6、指示剂（可当作弱酸）用量过多 （偏大），当弱酸，说明是酚酞做指示剂，碱滴定酸，相当于消耗更多的碱，所以结果偏大。　　指示剂（可当作弱碱）用量过多 （偏大），当弱碱，说明是甲基橙做指示剂，酸滴定碱，相当于消耗更多的酸，所以结果偏大。　　7、滴定过程中，锥形瓶振荡太剧烈，有少量液滴溅出 （偏小）　　8、开始时标准液在滴定管刻度线以上，未予调整 （偏小）　　9、碱式滴定管（量待测液用）或移液管内用蒸馏水洗净后直接注入待测液 （偏小）　　10、移液管吸取待测液后，悬空放入锥形瓶，少量待测液洒在外面 （偏小）　　11、滴定到指示剂颜色刚变化，就是到了滴定终点 （偏小）　　12、锥形瓶用蒸馏水冲洗后，不经干燥便直接盛待测溶液 （无影响）　　13、滴定接近终点时，有少量蒸馏水冲洗锥形瓶内壁 （无影响）　　14、滴定时待测液滴定管尖嘴有气泡，滴定后尖嘴气泡消失（偏小）　　15、溶液颜色较浅时滴入酸液过快，停止滴定后反加一滴NaOH溶液颜色无变化（偏大）

　　在实际中，影响酸碱指示剂变色范围的因素主要有两方面：一种是影响指示剂常数KHln的因素，包括温度、溶剂、溶液的离子强度等，其中温度的影响较大。另一种是影响变色范围宽度的因素，如指示剂用量、滴定程序等，现具体讨论如下。　　1．温度温度改变时，指示剂常数KHln及水的离子积KW均有改变，因此指示剂的变色范围也随之发生改变。例如，18℃时，甲基橙的变色范围为3.1～4.4，而100℃时，变为2.5～3.7。因此，滴定宜在室温下进行。如必须加热，应该将溶液冷却后再进行滴定。　　2．溶剂 指示剂在不同溶剂中其pKHln值是不同的，因此在不同溶剂中的变色范围不同。例如，甲基橙在水溶液中pKHln=3.4，在甲醇中pKHln=3.8。　　3．中性电解质溶液中性电解质的存在增加了溶液的离子强度，使指示剂常数改变，影响到指示剂的变色范围。此外，某些电解质还具有吸收不同波长光波的性质，会引起指示剂颜色深度、色调及变色灵敏度的改变。所以在滴定溶液中不宜有大量盐类存在。　　4．指示剂用量指示剂的用量（浓度）是一个重要因素。对于单色指示剂（如酚酞、百里酚酞），指示剂的用量对变色范围有较大影响。从指示剂变色的平衡关系看出：　　HIn←→H++In-　　设指示剂总浓度为c，人眼观察到红色碱式的最低浓度为一固定值a，代入平衡式，则　　KHln/[H+]=[In-]/[Hln]=a/(a-c)　　式中，KHln是定值，如果c增大了，则[H+]会相应增大，酚酞指示剂将在较低pH值变色。例如，在50～100ml溶液中加入2～3滴0.1%酚酞，在pH≈9时出现为红色；而在同样条件下，如加入15～20滴酚酞，在pH≈8时就会出现为红色。因此．对单色指示剂须严格控制指示剂用量。　　对于双色指示剂，指示剂用量多少不会影响变色范围。但溶液中指示剂的浓度大时可能致使终点时颜色变化不敏锐。另外指示剂本身也要消耗滴定剂．使滴定误差增大。因此，指示剂用量一般少一些为宜，只要达到变色灵敏度，用量越少越好。　　5．滴定程序溶液由浅色滴定到深色时，便于观察终点颜色的变化。所以滴定程序宜是当指示剂颜色由酸式或碱式色变为混合色时，溶液颜色由浅色变化到深色。例如，用酚酞作指示剂，滴定程序一般为用碱滴定酸，终点由无色变为粉红色，容易辨别。而用甲基橙作指示剂，一般用酸滴定碱，终点由黄色变为橙色，易于辨认。

有许多植物色素在不同pH值的溶液里会呈现出不同的颜色。因此，每个地方都可以就地取材，自制一些酸碱指示剂。下面远慕生物介绍一些自制的方法：1.从红萝卜皮中提取酸碱指示剂：刮下红萝卜的红皮后，用95%的酒精浸泡一天左右，过滤取出它的滤液即酸碱指示剂。按检验的需要制作pH1～14的标准液若干个，每个标准液取10ml分置于试管中，再分别加入红萝卜皮浸泡液10滴，塞紧作为比色样品。在某待测溶液中加入红萝卜浸泡液，颜色发生变化后再与比色样品比较，就能确定待测溶液pH值的大致范围。2. 从紫草中提取酸碱指示剂：取紫草5g，用50%的酒精浸泡一天可得到紫草素的紫色的酒精溶液即酸碱指示剂。其遇到酸碱的变色与石蕊试液相同。3. 从紫色卷心菜中提取酸碱指示剂：取约250g紫色卷心菜，洗净切碎置于不锈钢锅中加水煮沸10分钟，然后过滤冷却置于容器中即可用作酸碱指示剂。其用法可参照上述操作1的方法。4. 从米苋菜中提取酸碱指示剂：其操作方法同操作3。5.用咖喱粉制酸碱指示剂：取一药匙咖喱粉，用50%的调成糊状，涂在一块白布的两面上，放置一段时间后用水冲去多余的咖喱粉，白布被染成黄色，这就制成一块可以多次反复使用的酸碱指示布。它遇碱性溶液时呈红色，遇酸性溶液时呈黄褐色。每次用完后，用水把布上的酸性或碱性物质漂洗干净，指示布又恢复原来的黄色。可以供下次继续使用。还有很多植物的色素如月季花、菊花、牵牛花等的浸出液都可以制成不同的酸碱指示剂。